PLoS ONE: E-caderina destabilizzazione Conti per la patogenicità di Missenso mutazioni in ereditaria diffusa gastrico Cancer

Estratto

E-caderina è fondamentale per il mantenimento della architettura dei tessuti a causa del suo ruolo nella adesione cellula-cellula. E-caderina mutazioni sono la causa genetica di ereditaria diffusa cancro gastrico (HDGC) e mutazioni missense rappresentano un peso clinica, a causa dell'incertezza del loro ruolo patogenetico. In vitro e in vivo, la maggior parte delle mutazioni portano a perdita di funzione, anche se il fattore causale è noto per la maggioranza. Abbiamo ipotizzato che la destabilizzazione potrebbe spiegare la patogenicità di E-caderina mutazioni missense in HDGC, e testato la nostra ipotesi utilizzando in silico e in vitro strumenti. FoldX algoritmo è stato utilizzato per calcolare l'impatto di ogni mutazione in E-caderina stabilità nativo-stato, e l'analisi è stata completata con conservazione evolutiva, per SIFT. È interessante notare che i pazienti che ospitano hdgc linea germinale E-caderina mutanti destabilizzanti presentano una più giovane età al momento della diagnosi o la morte, il che suggerisce che la perdita di stabilità nativo-stato dei conti E-caderina per il fenotipo della malattia. Per chiarire la rilevanza biologica di E-caderina destabilizzazione HDGC, abbiamo studiato un gruppo di mutazioni recentemente identificati HDGC-associati (E185V, S232C e L583R), di cui L583R è previsto per essere destabilizzante. Abbiamo dimostrato che questa mutazione non è funzionale in vitro, espone più breve emivita e non è in grado di maturare, a causa del degrado proteasoma-dipendente prematuro, un fenotipo ritornato dalla stabilizzazione con la mutazione artificiale L583I (strutturalmente tollerata). Qui riportiamo modelli strutturali E-caderina idonei a prevedere l'impatto della maggior parte delle mutazioni missense cancro associati e mostriamo che E-caderina destabilizzazione porta alla perdita di funzione in vitro e una maggiore patogenicità in vivo.

Visto: Simões-Correia J, J Figueiredo, Lopes R, Stricher F, Oliveira C, Serrano L, et al. (2012) E-caderina destabilizzazione Conti per la patogenicità di Missenso mutazioni in ereditaria diffusa cancro gastrico. PLoS ONE 7 (3): e33783. doi: 10.1371 /journal.pone.0033783

Editor: Masaru Katoh, National Cancer Center, Giappone

Ricevuto: 9 novembre 2011; Accettato: 17 febbraio 2012; Pubblicato: 21 mar 2012

Copyright: © 2012 Simões-Correia et al. Questo è un articolo ad accesso libero distribuito sotto i termini della Creative Commons Attribution License, che permette l'uso senza restrizioni, la distribuzione e la riproduzione con qualsiasi mezzo, a condizione che l'autore originale e la fonte sono accreditati

Finanziamento:. Questo lavoro è stata sostenuta da Fundação para a Ciência e Tecnologia, Portogallo (PTDC /SAU-OBD /64319/2006, PTDC /SAU-OBD /104017/2008 SFRH /BPD /48765/2008), EMBO (borsa di studio ASTF breve termine 60- 2009) e dell'UE prospettive di sovvenzione (Health-F4-2008-201648). I finanziatori avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta e l'analisi dei dati, la decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto

Competere interessi:.. Gli autori hanno dichiarato che non esistono interessi in competizione

Introduzione

e-caderina è una glicoproteina di adesione cellula-cellula composto da cinque ripetizioni caderina di tipo extracellulare, una regione transmembrana e una coda citoplasmatica altamente conservata [1], [2]. E-caderina è espressa principalmente nelle cellule epiteliali ed è il componente principale delle giunzioni aderenti (AJ). Questi nodi cluster, tramite interazioni omofiliche, attraverso i domini extracellulari di molecole E-caderina calcio-dipendenti, sulla superficie delle cellule vicine omotipiche.

Il ruolo di E-caderina nello sviluppo del tumore è ben descritto, e la sua la perdita di espressione è un marchio di garanzia nei carcinomi [3]. Evidenze sperimentali supporta un ruolo per il complesso E-caderina sia nel sopprimere invasione e metastasi formazione [4]. Perdita di espressione E-caderina è frequentemente associata ad eventi genetiche come sito di splice e mutazioni troncamento causate da inserzioni, delezioni, e mutazioni nonsense, oltre a missense mutazioni [5]. Nel cancro gastrico sporadico diffuso, alterazioni nel gene che codifica per E-caderina (CDH1) si trovano preferenzialmente negli esoni 7-9 [5], mentre in tumori al seno lobulare sono sparsi lungo il gene, senza hotspot preferenziale [6]. mutazioni missense sono trovati in questi due tipi di cancro sporadico e anche nel sarcoma sinoviale [7].

aggregazione familiare di cancro gastrico diffusa (DGC) rappresenta il 10% dei casi di cancro gastrico (GC), e solo 1-3% sono ereditari [8]. Da questi casi familiari ereditaria diffusa cancro gastrico (HDGC) è definito da criteri rigorosi che sono stati definiti dal Consorzio Linkage cancro gastrico International (IGCLC) nel 1999: (1) due o più casi documentati di cancro gastrico diffuso nel primo secondo grado /parenti, con almeno un diagnosticato prima dei 50 anni; o (2) tre o più casi di cancro gastrico diffuso documentato a parenti di primo /secondo grado, indipendentemente dall'età. Esordio precoce diffusa cancro gastrico (EODGC) è considerato quando un individuo isolato viene diagnosticato con DGC con meno di 45 anni di età. Linea germinale mutazioni CDH1 si trovano nel 30% dei casi hdgc [9]. L'associazione delle mutazioni CDH1 e cancro gastrico familiare è stato descritto da Guilford et al
nel 1998 [10] e da allora molti studi hanno riportato diversi tipi di mutazioni CDH1 in HDGC [11], [12], [13 ]. Tra tutti segnalati CDH1
mutazioni germinali, il 77,9% sono senza senso, giunzione in loco e frameshift mutazioni (previsti per la produzione di codoni di terminazione prematura) e il 22,1% sono mutazioni missense [9]. Le mutazioni che generano PTC sono normalmente deleteri, i pazienti sono considerati vettori ad alto rischio, e si consiglia di avere gastrectomia totale profilattica [14]. La patogenicità delle mutazioni missense non è semplice, e queste alterazioni sono comunemente indicato come classificati sequenza di varianti (USV) a causa della mancanza di criteri rigorosi per valutare il loro impatto. Diversi parametri sono stati presi in considerazione per la classificazione dei USV E-caderina in HDGC: 1) co-segregazione della mutazione con DGC (entro pedigree); 2) frequenza di mutazione nella popolazione sana di controllo; 3) recidiva mutazione (in famiglie indipendenti). segregazione analisi è spesso impossibile, con un piccolo numero di casi colpite disponibili per la diagnosi molecolare [15], e l'assenza di informazioni cliniche è un fattore limitante per dedurre il significato patogeno di queste mutazioni. Per aggirare questa limitazione abbiamo precedentemente sviluppato in vitro
saggi funzionali per valutare l'impatto funzionale di E-caderina mutazioni germinali missense [16], [17]. Tuttavia, tali studi implicano condizioni sperimentali specifiche di laboratorio, ovvero test di biologia cellulare, e sono molto tempo da utilizzare nella routine. in silico
previsioni sono affidabili e analisi veloce che si può usare per prevedere l'impatto di mutazioni puntiformi, soprattutto quando le informazioni sono disponibili strutturali [18], [19].

In questo lavoro, abbiamo esplorato le potenzialità della struttura a base di in silico
previsioni per valutare l'impatto delle mutazioni missense e-caderina, che si trova nel cancro ereditaria e sporadici. La nostra analisi si è basata sul calcolo del nativo-state variazioni di stabilità indotti da ogni variante (ΔΔG = DeltaG _{WT-DeltaG Mut), ottenuto con l'algoritmo proteina disegno FoldX [20], [21]. È interessante notare che il gruppo di pazienti portatori di mutazioni destabilizzanti (ΔΔG > 0,8 kcal /mol) è caratterizzata da una più giovane età al momento della diagnosi o morte per DGC, suggerendo che la perdita di E-caderina stabilità nativo dello stato contribuisce al fenotipo della malattia. Utilizzando un modello cellulare, abbiamo analizzato il fenotipo di E-caderina destabilizzazione, e abbiamo trovato che quando una mutazione induce diminuita nativo dello stato di stabilità, E-caderina è prematuramente degradata dal proteasoma, espone più breve emivita, con conseguente perdita del collante funzione. Complessivamente, i nostri risultati suggeriscono che i conti di destabilizzazione per la patogenicità di E-caderina mutazioni missense trovato in HDGC.}

Materiali e Metodi

Raccolta di sequenza di E-caderina varianti e PDBs

varianti e-caderina associata HDGC o EODGC sono stati raccolti dalla letteratura, e le varianti somatici sono stati raccolti dal catalogo di mutazioni somatiche in Cancro (COSMIC) del database (http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmico/). Tre nuova sequenza E-caderina varianti in cui riferito al nostro laboratorio per l'analisi funzionale: E185V, S232C e L583R. Recentemente, è stato riportato L583R, con i dati funzionali associati [22].

PDBs E-caderina-correlati sono stati identificati utilizzando la ricerca automatica con Swiss Modello Repository (http://swissmodel.expasy.org). allineamento Sequenza di E-caderina umana e ciascuna delle sequenze utilizzate per i diversi modelli è stata eseguita con M-caffè [23], [24] (http://tcoffee.crg.cat/apps/tcoffee/play?name=mcoffee ). Le immagini sono state preparate con PyMOL. Dopo aver analizzato la sequenza e omologia strutturale, tre PDBs sono stati selezionati da utilizzare come modelli:. Xenopus C-caderina ectodomain (PPB 1L3W), mouse E-caderina prodomain (PPB 1OP4) e il dominio del mouse β-catenina interagisce (PPB 1I7X)

FoldX calcoli e analisi SIFT

Utilizzando il comando FoldX (http://foldx.crg.es/) Buildmodel
abbiamo costruito tre diversi modelli (prodomain, extracellulare e citoplasmatica); le tre strutture sono state umanizzato per sostituzione di ciascun amminoacido differente. La struttura risultante è stato ottimizzato utilizzando il comando RepairPDB
e le energie dove analizzati con Stabilità
o AnalyseComplex
comandi. Le mutazioni associate alla malattia sono stati generati con il Buildmodel
comando, ogni mutazione ripetuta in cinque piste. Le energie sono una produzione automatica in FoldX, e il cambiamento di stabilità nativo-stato, ΔΔG, tra il WT e mutanti (ΔΔG = DeltaG _{WT-DeltaG Mut) viene anche generato in un file separato, con la norma corrispondente deviazioni, e tutte le sanzioni energetici associati a ciascuna mutazione. Solo mutazioni con ΔΔG > 0,8 kcal /mole sono stati considerati deleteri}

Abbiamo usato SIFT (http://sift.jcvi.org/, ordinamento Intolleranti Da tollerante) per valutare la conservazione di ogni sostituzione aminoacidica, come in precedenza. descrissero [25], utilizzando la funzione Blink di GI:. 31073. Solo mutazioni con un punteggio inferiore a 0,05 sono stati considerati per essere intolleranti

prop (http://www.cbs.dtu.dk/services /prop /) [26] è stato utilizzato per valutare se le mutazioni potrebbero avere un effetto sulla scissione prodomain.

coltura cellulare e trasfezioni

e-caderina WT cDNA è stato clonato in pIRES2-EGFP vettore secondo per la fabbricazione di istruzioni (Clontech, Takara Bio) e mutazioni E185V, S232C, L583R e L583I HE-caderina sono stati indotti da mutagenesi sito-specifica, come descritto in precedenza [27]. Il vettore vuoto (Mock) è stato utilizzato come controllo

CHO (ovaio di criceto cinese), le cellule (numero ATCC: CCL-61). Sono state coltivate in terreno di Alfa-MEM (Gibco, Invitrogen) supplementato con 10% fetale bovino siero (FBS; Gibco, Invitrogen) e 1% di penicillina-streptomicina (Gibco, Invitrogen). Le cellule sono state sporadicamente valutati per la contaminazione da mycoplasm imunofluorescence con DAPI. Le cellule sono state trasfettate con 1 ug di ciascuno dei vettori codificanti le diverse forme di E-caderina (WT, E185V, S232C, L583R e L583I) usando Lipofectamine (2000 Invitrogen), secondo la procedura di fabbricazione. Per stabile istituzione linea di cellule, le cellule sono state selezionate per la resistenza agli antibiotici a 5 mg /ml blasticidin (Gibco, Invitrogen). Tutte le linee cellulari sono state mantenute in un incubatore umidificato con 5% di CO _{2 a 37 ° C}

saggi funzionali

trasfettate CHO (ovaio di criceto cinese), le cellule (numero ATCC:. CCL -61) sono stati sottoposti a flusso citometria, utilizzando la misurazione della fluorescenza GFP, per valutare l'efficienza di trasfezione prima di ogni esperimento. Per il saggio di aggregazione lenta, pozzetti di 96-a micropiastre sono stati rivestiti con 50 ml di soluzione di agar (100 mg Bacto-Agar in 15 ml di PBS sterile). Le cellule sono state staccate con tripsina e risospese in terreno di coltura. Una sospensione di 1 × 10 ^{5 cellule /ml è stata preparata e 2 × 10 4 cellule sono state seminate in ogni pozzetto. La piastra è stata incubata a 37 ° C in una camera umidificata con 5% di CO _{2 per 48 ore. L'aggregazione è stata valutata in un microscopio invertito (4 × ingrandimenti) e fotografato con una fotocamera digitale.}}

Western blotting

I lisati cellulari sono stati ottenuti con tampone di lisi catenina (1% Triton X-100, 1 % Nonidet P-40 in PBS), integrato con cocktail di inibitori delle proteasi (Roche) e cocktail di inibitori della fosfatasi (Sigma). Protein quantificazione è stata effettuata mediante saggio Bradford modificato (Bio-Rad). Per ogni campione, 25 mg di proteina è stato caricato, separati nel 7,5% SDS-PAGE, e electroblotted a membrana di nitrocellulosa (GE Healthcare Life Sciences). Le membrane sono state bloccate con latte in polvere 5% senza grassi e 0,5% Tween-20 in PBS. Immunoblotting è stata eseguita con anticorpi contro E-caderina (1:1000; BD Biosciences), actina (1:1000; Santa Cruz Biotechnology), e α-tubulina (1:10000; Sigma). Sheep anti-topo (GE Healthcare Life Sciences) o asino anti-capra (Santa Cruz Biotechnology) sono stati utilizzati come anticorpi secondari, seguito da rilevamento ECL (GE Healthcare Life Sciences). Immunoblot sono stati quantificati in Quantity One software (Bio-Rad).

cella fluorescenza-attivato (FACS)

Le cellule sono state coltivate per un monostrato confluente, indipendente con Versene (Gibco, Invitrogen) e risospese in ghiaccio freddo PBS con 0,05 mg /ml CaCl _{2. Una sospensione di 5 × 10 ^{5 cellule è stato centrifugato per 5 minuti a 1500 rpm a 4 ° C, e lavate in PBS con 0,05 mg /ml CaCl 2 3% BSA. Le cellule sono state incubate per 60 minuti con un anticorpo primario contro la E-caderina, HECD1 (Zymed Laboratories) a 1:100 diluizione. Le cellule sono state lavate due volte e quindi incubati con anti-topo biotinilato (Dako) a 1:100 diluizione. Le cellule sono state lavate due volte e poi incubate con streptavidina-PE CY5 (BD Pharmingen) alla diluizione 1:40. Infine, le cellule sono state lavate, risospese in 500 pl di PBS, e 50000 cellule sono state analizzate in un citometro a flusso (Coulter Epics XL-MCL). I dati sono stati analizzati con il software WinMDI.}}

immunofluorescente colorazione

Per immunofluorescenza e microscopia, le cellule sono state seminate su vetrini e cresciuto a circa l'80% di confluenza, fissate in metanolo ghiacciata per 15 minuti, lavate 2 volte con PBS e incubate con l'anticorpo primario, diluito in PBS 5% BSA, per 60 minuti a temperatura ambiente. Gli anticorpi primari utilizzati: topo monoclonale anti-E-caderina (BD Biosciences); coniglio anti-calnexin (Stressgen). anticorpi secondari utilizzati: Alexa Fluor 488 anti-topo (1:500, Invitrogen); Alexa Fluor 594 anti-coniglio (1:500; Invitrogen). I vetrini sono stati montati su vetrini, usando Vectashield con DAPI per il rilevamento nucleare (Vector Laboratories). acquisizione delle immagini è stata eseguita su Carl Zeiss apotome Axiovert 200 M Fluorescenza Microscopio con 40 × obiettivi. Le immagini sono state acquisite con la fotocamera AxioCam gestione delle risorse umane ed elaborati dal software Axiovison versione 4.8.

Cell Trattamenti

Per l'inibizione della sintesi proteica, le cellule sono state trattate con 25 mM di Cycloheximide per 8 ore e 16 h, e la quantità di totale e-caderina è stata analizzata mediante WB come descritto in precedenza. Per il test di inibizione del proteasoma, le cellule sono state seminate in 6 pozzetti, coltivate a circa l'80% di confluenza, e incubate per 16 h con 10 micron MG132 (Calbiochem). I lisati cellulari sono stati analizzati mediante WB come descritto in precedenza.

Risultati

1. modelli strutturali E-caderina

Non ci sono poche strutture E-caderina umana (HE-CAD) disponibili, e coprono solo piccole porzioni della proteina (Tabella S1). Utilizzando la ricerca automatica di Swiss Modello Repository, abbiamo scoperto che PDB 1L3W, commentato per tutta la lunghezza del dominio extracellulare di Xenopus EP-caderina (EP-CAD), è altamente omologa allo stesso dominio in E-caderina umana. Abbiamo analizzato omologia di sequenza con l'allineamento utilizzando M-caffè, un allineamento di sequenze multiple che combina l'uscita di diversi pacchetti multipli di allineamento sequenza (PCMA, Poa, Mafft, muscoli, T-Caffè, CLUSTALW, ProbCons, DialignTX) [23], [24 ]. La figura 1A mostra l'allineamento delle due sequenze di dominio extracellulare. Le regioni in mattoni rossi rappresentano perfetto accordo tra i metodi utilizzati, che rappresenta le sequenze altamente simili. Per costruire la struttura del modello, abbiamo rimosso le regioni con alcuna somiglianza (Figura 1A, stelle), e limitato il modello per le regioni con allineamento affidabile (freccia nera, figura 1A). La struttura è stata Xenopus umanizzato come descritto in Materiali e Metodi e Figura 1B mostra l'allineamento strutturale di He-cad domini EC1-EC2 (da PDB 2O72) e domini EC1-EC2 del Xenopus derivato modello strutturale. Le due strutture sono quasi sovrapposte, indicando che la somiglianza tra i domini extracellulari di umana E-caderina e Xenopus EP-caderina non solo a livello di sequenza, ma anche a livello strutturale. La struttura del modello di E-CAD umano esibisce energie compatibili con la struttura da Xenopus, con una leggera diminuzione di energia libera (DeltaG) ottenuto per il modello (DeltaG _{reale = 559.99 kcal /mol e DeltaG model = 531,77 kcal /mol), che indica che l'umanizzazione non introduce scontri supplementari. Recentemente, una struttura del mouse dominio extracellulare è stato rilasciato (PPB 3Q2V, Tabella S1), e abbiamo usato anche questa struttura come un modello, come un modo per raffinare i risultati ottenuti con il modello di Xenopus.}

Abbiamo stabilito altri due modelli, che coprono il prodomain (PPB 1OP4, dal topo N-caderina) e il dominio citoplasmatico β-catenina (PDB 1I7X, dal topo e-caderina), utilizzando la stessa metodologia. Complessivamente, i tre modelli coprono la maggior parte della struttura delle proteine ​​(Figura 1C): il modello prodomain copre posizioni 28-117, i modelli extracellulari posiziona 155-697 e il dominio citoplasmatico β-catenina copre 782-838. A livello del dominio juxtamembrana, una struttura è annotato, comprendente la superficie interagente tra E-caderina e p120 [28]. Questa struttura contiene un piccolo peptide lunga 18 aminoacidi (che copre posizioni 756-773 su He-CAD), con bassissimo contenuto strutturale, i fattori che riducono l'affidabilità dei calcoli di energia, così abbiamo scartato questa struttura dall'analisi.

2. In silico
previsione dell'impatto della E-caderina USV cancro-associata

mutazioni E-caderina non sono solo la causa genetica di HDGC, ma sono anche spesso trovano in diversi tipi di sporadici tumori. Abbiamo analizzato in silico
l'impatto di tutte le mutazioni E-caderina missenso cancro-associata che localizzano alle regioni interessate dai modelli strutturali generati: 22 mutazioni della linea germinale trovati nelle impostazioni di HDGC e EODGC, e 57 si trovano in tumori sporadici. Germinali USV E-caderina sono stati raccolti dalla letteratura, e alcuni sono comunicazioni personali del nostro laboratorio. Alcune mutazioni HDGC /EODGC non sono possibili per modellare, a causa della mancanza di informazioni strutturali (ad esempio quelli localizzati nel dominio juxtamembrana di E-caderina), e non sono stati inclusi in questa analisi. Mutazioni somatiche sono stati raccolti dal database Cancer Genome Project, e contengono mutazioni trovate nel tumore gastrico e lobulare della mammella (gli unici due tipi di cancro associato a HDGC), ma anche altri tipi di tumore, come il sarcoma sinoviale o carcinoma del dotto biliare (Tabella S2 ).

Utilizzando i modelli strutturali descritti in precedenza, abbiamo usato FoldX per generare ciascuno dei cancro associato USV, e valutata la loro stabilità nativo-stato, DeltaG (comunemente indicato come energia totale per semplicità) [20]. La differenza energetica tra il riferimento WT e la corrispondente mutante (ΔΔG = DeltaG _{WT-DeltaG Mut) è stata calcolata per i 22 hdgc /EODGC USV E-caderina localizzate nelle regioni coperte dalle strutture modello, ed il i risultati sono riportati nella Tabella 1. Quando ΔΔG è negativo, questo riflette un guadagno di stabilità nativo di stato sotto forma mutante; quando è positivo, ciò implica che il mutante è meno stabile, allora il riferimento WT. Precedenti studi in altre proteine ​​hanno mostrato che i cambiamenti di stabilità calcolati con l'algoritmo FoldX di sotto di 0.8 kcal /mol sono all'interno della variazione errore del software, e sono quindi considerate non significative [21]. mutazioni Di conseguenza, abbiamo solo considerato destabilizzante quando inducono variazioni di energia di cui sopra 0,8 kcal /mole. In figura 2A, le mutazioni sopra lo schema sono destabilizzanti, mentre quelli inferiori sono strutturalmente tollerati. E 'chiaro che le mutazioni destabilizzanti sono spead lungo la proteina, senza dominio preferenziale colpito
.}

Il prodomain di He-CAD è scisso durante la maturazione, e se questo non è compiuto, la funzione adesivo E-caderina è compromessa [ ,,,0],29], [30]. Per le mutazioni localizzate in questo settore, abbiamo valutato l'impatto in energia totale con FoldX, la conservazione con SIFT, e anche valutato se l'interferenza con il sito prodomain scissione con il puntello (dettagli in Materiali e Metodi). Abbiamo scoperto che sia ereditaria (G62V e T118R) e sporadico (P30T, G62D, H92Y, H121R e H123Y) mutazioni localizzate in E-caderina prodomain sono strutturalmente tollerati, come previsto da FoldX (Tabella S3). Quando analizziamo l'impatto sulla base di conservazione utilizzando SIFT, abbiamo anche scoperto che nessuna delle mutazioni è stato considerato deleterio, perché il loro grado di conservazione è bassa (Tabella S3). Questi risultati indicano che la patogenicità di USV E-caderina localizzato nel prodomain non è probabile dipende destabilizzazione. Abbiamo anche trovato alcun effetto sulla scissione del propeptide, come previsto da ProP (dati non mostrati). Di conseguenza, riteniamo che la patogenicità delle mutazioni E-caderina in questo dominio può derivare dalla interferenza con l'attracco di proteine ​​coinvolte nella trasformazione prodomain, impossibile prevedere in silico
.

E ereditario USV -cadherin coprono l'intera lunghezza del dominio extracellulare, mentre mutazioni sporadiche trovano principalmente in EC2-EC3, come secondo la hotspot precedentemente descritto in esoni 7-9 [5]. Dal totale 18 germinali mutazioni HDGC /EODGC localizzati in questo settore, abbiamo scoperto che 10 hanno un notevole impatto strutturale nella proteina (Tabella 1). Circa la metà delle mutazioni sporadiche sono anche destabilizzando (Tabella S3), indipendentemente dal dominio CE in cui sono localizzate, suggerendo che la destabilizzazione nativo-stato può essere associato ad una frazione considerevole di tumori sporadici di smarrimento E-caderina dalla mutazione puntiforme.

Solo tre mutazioni sono localizzate nella regione mappata dal modello del dominio citoplasmatico di legame β-catenina (P799R, V832M, S838G): i primi due identificato nell'impostazione HDGC /EODGC e l'altra sporadica, trovata nel carcinoma dell'ovaio [31]. Per queste mutazioni abbiamo analizzato l'energia di legame tra E-caderina e β-catenina e abbiamo scoperto che nessuno di loro altera in modo significativo l'affinità di legame di β-catenina, secondo FoldX previsione. Ciò è in accordo con il in vitro
risultati mostrano che la mutazione V832M ereditaria lega efficientemente β-catenina, e la sua patogenicità sembra essere dipendente dalla incapacità del complesso E-caderina /β-catenina di impegnare α catenina [32], [33].

Abbiamo raccolto tutte le previsioni e funzionale in vitro
dati di mutazioni HDGC /EODGC e analizzato l'affidabilità dei predittori utilizzati (Tabella 1). Abbiamo classificato i risultati delle previsioni come: vero positivo (TP) quando la mutazione è previsto come deleterio in silico
(sia da FoldX o SIFT) e mostra la perdita di funzione in vitro
; Vero negativo (TN), quando la mutazione è previsto come tollerato in silico
ed è funzionale in vitro
; Falso positivo (FP) quando la mutazione è previsto come deleterio in silico
ma è funzionale in vitro
; e falso negativo (FN), quando la mutazione è previsto come tollerato in silico
ma presenta in vitro
perdita di funzione. TP e TN sono risultati positivi, nel senso che i predittori sono in grado di rilevare l'impatto mutazione in funzione; FP e FN rappresentano il loro grado di fallimento. Abbiamo scoperto che entrambi gli algoritmi sono in grado di prevedere l'impatto funzionale di fino al 70% delle linea germinale mutazioni HDGC /EODGC (11 su 16 mutazioni), con le previsioni di sovrapposizione per la metà delle mutazioni (Tabella 1, Figura 2B).

sono stati analizzati i dati disponibili per le mutazioni della linea germinale vettori e hdgc /EODGC, anche se le informazioni sono limitate, abbiamo scoperto che il più completo set di dati è l'età di insorgenza o di morte associata alla DGC. Quando abbiamo Box-plot questi dati, il raggruppamento "Destabilizing" e "non-destabilizzante" portatori della mutazione, si osserva un evidente più giovane età di esordio della malattia (diagnosi o morte) per il primo gruppo (Figura 2D), suggerendo che la destabilizzazione native-stato conti per il precedente sviluppo della DGC.

3. significato biologico di E-caderina destabilizzazione

Per determinare il significato biologico di E-caderina destabilizzazione, abbiamo usato come sistema modello tre recentemente identificate mutazioni missense E-caderina germinali segnalati al nostro laboratorio per la caratterizzazione funzionale: E185V, S232C e L583R, il seguito recentemente descritto in letteratura [22]. Il in silico
analisi descritto in precedenza è stata effettuata per queste tre nuove mutazioni ed i risultati sono inclusi nella tabella 1 (al di sotto della linea scura). Le mutazioni E185V e S232C sono strutturalmente tollerati, con ΔΔG = rispettivamente 0,29 kcal /mol e -0.9 kcal /mol (Tabella 1), ritenuto non significativo l'impatto nella struttura. Mutation S232C promuove una diminuzione dell'energia, stabilizzando la proteina, e questo è dovuto alla perdita di alta energia di una serina seppellito OH gruppo, che non è coinvolto in un H-bond, e per la sistemazione della catena laterale della cisteina. La mutazione L583R induce la destabilizzazione, con ΔΔG = 2.72 kcal /mol, che riflette il cambiamento drammatico da una idrofobica a aminoacidi idrofili, che si traduce in un Arginina non in grado di formare legami idrogeno, essendo sfavorevole sepolti.

I n vitro
test funzionali sono stati eseguiti per le mutazioni HDGC /EODGC di cui sopra, e abbiamo trovato una perfetta correlazione tra la funzionalità in vitro
e la presenza /assenza di impatto strutturale: E185V e S232C mantengono la funzione di collante di e-caderina, e sono in grado di formare aggregati cellulari stretti, mentre L583R mostra un chiaro modello sparso, simile a cellule Mock (Figura 3a), indicando che E185V e S232C sono non patogeni e L583R è patogeno.

Quando abbiamo analizzato espressione e-caderina nelle diverse linee cellulari, abbiamo trovato che la quantità totale di L583R mutanti è minore che l'espressione WT alle stesse condizioni, mentre mutazioni E185V e S232C, mantenere livelli normali (Figura 3B). È interessante notare che la banda corrispondente al L583R viene mantenuto nel gel, indicando che L583R non è in grado di maturare correttamente (forma immatura di E-caderina è 130 kDa, maturo è di 120 kDa) e citometria a flusso risultati mostrano che è meno espresso nella membrana plasmatica (Figura 3C).

Quando la proteina di maturazione non riesce, questo si traduce spesso in reticolo endoplasmatico (ER) la ritenzione di proteine ​​immaturo. Per verificare se L583R stato infatti mantenuto come immaturo, abbiamo analizzato se è trattenuto nel ER mediante co-immunofluorescenza con il marcatore ER calnexin (Figura 4A), e trovato che parte del segnale L583R si sovrappone con il marcatore ER, indicando aumentato ritenzione ER.

Per capire se la destabilizzazione potrebbe essere rilevato in vitro
, abbiamo analizzato la stabilità del L583R nella cella, valutando il proprio fatturato. Abbiamo bloccato sintesi proteica con cicloesimide verificando che L583R è presto degradato, come valutato dalla sua espressione residua subito dopo 8 h di inibizione della sintesi proteica, in contrasto WT e gli altri mutanti che sono ancora altamente espressi nelle stesse condizioni (Figura 4B) , indicando che L583R è instabile nella cella. La presenza della banda immaturo nei campioni di E-caderina WT o mutanti (fascia superiore, figura 4B) è dovuta al sovraccarico di proteine ​​derivanti da trasfezione transiente.

proteine ​​instabili o mal ripiegate sono strettamente regolati da meccanismi di controllo di proteine ​​di qualità che proteggono la cellula, indirizzando le proteine ​​ripiegate di nuova sintesi per la degradazione nel proteasoma [34]. Per affrontare se questo è il caso per L583R, abbiamo inibito l'attività del proteasoma con MG132 e osservato che, nonostante i diversi livelli iniziali di E-caderina, l'espressione di L583R mutanti è completamente ristrutturato in seguito al trattamento (Figura 4C), che indica che è prematuramente degradata dal proteasoma dopo la sintesi, come precedentemente descritto per altre mutazioni juxtamembranar hdgc-associata E-caderina [35]. È interessante notare che, quando la degradazione proteasoma è inibito, vi è un accumulo di immaturo E-cad in tutte le linee cellulari, manifestando l'importanza del proteasoma nella regolazione di nuova sintesi E-cad, indipendentemente essere mutato o meno.

Per convalidare ulteriormente il in silico
previsioni, abbiamo analizzato il fenotipo di una mutazione destabilizzato ritornato inducendo un'alterazione strutturale tollerato nella stessa posizione della forma mutante di E-caderina. Utilizzando FoldX, abbiamo calcolato l'impatto di ogni possibile alterazione in posizione 583 e abbiamo trovato che l'alterazione indurre meno destabilizzazione era L583I (ΔΔG = 0,56 kcal /mol, come previsto con il modello di topo, Tabella S3). È interessante notare, questa mutazione mantiene la funzione adesiva di E-caderina, conseguente aggregati cellulari compatti (Figura 4D), e non è destabilizzato in vitro
, esponendo la resistenza cicloheximide comparabili alla forma WT (figura 4E). Questi risultati sottolineano l'affidabilità del in silico previsioni
a base di stabilità E-caderina e la chiara associazione di E-caderina destabilizzazione con perdita di funzione di collante.

Discussione

e-caderina alterazioni (mutazioni, delezioni e metilazione) sono l'unica causa riconosciuta genetica di HDGC [36], [37], [38]. La maggior parte delle mutazioni identificate in HDGC sono del tipo senza senso, ma una quota significativa (20%) della linea germinale mutazioni danno origine a singole sostituzioni aminoacidiche, di cui la patogenicità è difficile da valutare e spesso non è chiaro [39], [40]. Le informazioni più importanti in termini di consulenza genetica dei vettori missense mutazione germinale è familiare informazioni cliniche (analisi di segregazione, per lo più), ma questa informazione è spesso scarsa con le dimensioni del pedigree comunemente essere troppo piccolo per consentire studi di segregazione, e la valutazione patogenicità solito proviene da in vitro
saggi cellulari funzionali [15], [17], che sono in termini di tempo e tecnicamente impegnativo, e non sono quindi ampiamente applicabile nei laboratori molecolari di routine. Di conseguenza, vi è la necessità di nuovi metodi per determinare la patogenicità delle mutazioni missense E-caderina associata HDGC [40].

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