Plos ONE: E-kadherina destabilizacijo računi za patogenost Missense mutacij v dednim difuzna Rak želodca

Povzetek

E-kadherina je ključnega pomena za vzdrževanje tkiva arhitekture zaradi svoje vloge v adhezijo celic celic. -E kadherina mutacije so genetski vzrok dednim Diffuse želodca raka (HDGC) in missense mutacij predstavljajo klinično breme, zaradi negotovosti njihove patogeno vlogo. In vitro in in vivo, večina mutacije privede do izgube-of-funkcijo, čeprav je vzročni dejavnik neznano za večino. Domnevali smo, da bi destabilizacijo predstavljajo patogenosti E-kadherina missense mutacij v HDGC in testirali hipotezo uporabo in silico, in vitro orodja. FoldX algoritem je bil uporabljen za izračun vpliva vsakega mutacije v E-kadherina stabilnost domačin države, in analiza je bila dopolnjena z evolucijsko ohranjanje, ki jih presejemo. Zanimivo je, da bolniki HDGC zatočišča zarodne imunoglobulinske proge E-kadherina destabilizira mutanti predstaviti mlajšo starost ob diagnozi ali smrti, kar pomeni, da je izguba domačin državne stabilnosti E-kadherina računov za fenotip bolezni. Za pojasnitev biološko ustreznost E-kadherina destabilizacije v HDGC, smo raziskovali skupino na novo ugotovljene HDGC, povezanih mutacij (E185V, S232C in L583R), od katerih je L583R predvidoma destabilizacije. Pokazali smo, da je to mutacija ne deluje in vitro kaže krajšo razpolovno dobo in ne more zrel, zaradi prezgodnje proteazomske odvisne razgradnje, fenotip stabilizacija povrne na z umetnim mutacije L583I (strukturno prenašal). Tu poročamo E-kadherina strukturne modele, primerne za napovedovanje vpliva večine, povezanimi z rakom missense mutacij in pokažemo, da E-kadherina destabilizacijo pride do izgube-of-funkcijo in vitro in povečano patogenosti in vivo.

Citation: Simões-Correia J, Figueiredo J, Lopes R, Stricher F, Oliveira C, Serrano L, et al. (2012) E-kadherina destabilizacijo računi za patogenost Missense mutacij v dednim Diffuse želodca raka. PLoS ONE 7 (3): e33783. doi: 10,1371 /journal.pone.0033783

Urednik: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japonska

Prejeto: 9. novembra 2011; Sprejeto: 17. februar 2012; Objavljeno: 21. marec 2012

Copyright: © 2012 Simões-Correia et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. To delo je bila podprta z Fundação odst Ciencia e Tecnologia, Portugalska (PTDC /SAU-OBD /64319/2006, PTDC /SAU-OBD /104017/2008, SFRH /BPD /48765/2008), EMBO (short-term štipendija ASTF 60- 2009) in EU Obeti za donacijo (HEALTH-F4-2008-201648). Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

E-kadherina je celične adhezije celic glikoprotein sestavljen iz petih ekstracelularnih ponovitev kadherina tipa, eno transmembransko regijo in visoko ohranjenem citoplazemskega repa [1], [2]. E-kadherina je izražena predvsem v epitelijskih celic in je glavna sestavina Adherens spojih (AJ). Ti križišča grozd, prek homophilic interakcij, prek celičnih domen kalcija odvisne od E-kadherina molekul na površini homotypic sosednjih celic.

Vloga e-kadherina razvoj tumorja je dobro opisan, in njene izguba izražanja je znak v karcinomov [3]. Eksperimentalni dokazi podpirajo vlogo za E-kadherina kompleksa tako v zatiranje nastanek invazijo in metastaz [4]. Izguba E-kadherina izražanja pogosto povezana z genskimi dogodke, kot spoja mestu in obrezave mutacij z vložki, brisanjem in nepovezanih mutacije povzročijo, poleg missense mutacije [5]. V sporadične difuzno raka želodca, so spremembe v gena E-kadherina (CDH1) je pokazala, prednostno v eksonov 7-9 [5], medtem ko je v lobularni raka na dojki so širijo vzdolž gena, brez preferenčnega srborit [6]. Missense mutacije so na voljo v teh dveh vrstah raka sporadične in tudi v sinovijskih sarkomi [7].

družinska združevanje razpršenih želodca raka (DGC) predstavlja 10% primerov želodčnega raka (GC), in le 1-3% so dedne [8]. Iz teh družinskih zadevah, dedna difuzna želodca Rak (HDGC) je opredeljena s strogimi merili, ki so jih določa mednarodni želodca raka povezava Consortium (IGCLC) v letu 1999: (1) dve ali več dokumentiranih primerov razpršenega rakom želodca v prvem /druge stopnje sorodniki, z vsaj enim diagnosticirali pred starostjo 50 let; ali (2) tri ali več primerov dokumentirane razpršenega rakom želodca v prvem /drugem stopinj sorodnikov, ne glede na starost. Zgodnji pojav difuzna želodca Rak (EODGC), se šteje, če je osamljen posameznik zboli za DGC z manj kot 45 let. Zarodne CDH1 mutacije najdemo v 30% primerov HDGC [9]. Združenje CDH1 mutacij in družinsko raka želodca je prvi opisal Guilford et al
leta 1998 [10] in od takrat številne študije poročajo različne vrste CDH1 mutacij v HDGC [11], [12], [13 ]. Med vsemi poročali CDH1
reproduktivnih mutacij, 77,9%, so nesmisel, spoja mestu in premikom bralnega okvirja (predvidene za proizvodnjo prezgodnjih kodonov odpravnine) in 22,1% se missense mutacije [9]. Mutacije, ki ustvarjajo PTC običajno škodljivih, bolniki se štejejo za prevoznike z visokim tveganjem, in se svetuje, da imajo profilaktično celotnega želodca [14]. Patogenost missense mutacij ni enostavna, in te spremembe so ponavadi naveden kot netajnih zaporedje variante (USVs) zaradi pomanjkanja strogih meril, da ocenijo njihov vpliv. Več parametrov so bile upoštevane pri razvrščanju E-kadherina USVs v HDGC: 1) co-segregacija mutacije z DGC (v rodovnike); 2) Pogostost mutacije v kontrolno zdravo populacijo; 3) mutacija ponovitev (v neodvisnih družin). Analiza Segregacija je pogosto nemogoče, z majhnim številom prizadetih primerih, ki so na voljo za molekularno diagnostiko [15], in odsotnost kliničnih podatkov je korak, ki omejuje sklepati patogene pomen teh mutacij. Obiti to omejitev smo že razvili vitro
funkcionalni testi za oceno funkcionalne vpliv E-kadherina reproduktivnih missense mutacij [16], [17]. Vendar pa take študije implicirajo lab posebne pogoje za poskuse, in sicer celično biologijo teste in so zamuden za uporabo v rutino. silico
napovedi so zanesljiva in hitra analiza, ki ga je mogoče uporabiti za napovedovanje vpliva točkovnih mutacij, še posebej, če je na voljo strukturne informacije [18], [19].

V tem delu smo raziskali potencial strukture, ki temeljijo na silico
napovedi za oceno učinka E-kadherina missense mutacij, ki se nahajajo v dedni in sporadični raka. Naša analiza je temeljila na izračunu spremembe domačih državnih stabilnosti, ki ga vsako varianto induciranih (ΔΔG = ΔG _{WT-ΔG Mut), pridobljen s protein oblikovanje FoldX algoritem [20] v [21]. Zanimivo je, da je skupina bolnikov z vzrejo rušila mutacije (ΔΔG > 0,8 kcal /mol), je značilno, da mlajši ob diagnozi ali smrti zaradi DGC, kar kaže, da je izguba E-kadherina stabilnost domačin država prispeva k fenotipa bolezni. Uporaba mobilnega modela smo analizirali fenotip E-kadherina destabilizacije, in ugotovila, da ko bo mutacija inducira zmanjšala domačin stanje stabilnosti, je E-kadherina predčasno razgradi z proteasoma, kaže krajšo razpolovno dobo, kar je povzročilo izgubo lepila funkcija. Skupaj naši rezultati kažejo, da je destabilizacija predstavlja patogenosti E-kadherina missense mutacij najdemo v HDGC.}

Materiali in metode

Zbiranje E-kadherina zaporedje variant in PDBs

E-kadherina variante, vezane na HDGC ali EODGC so bili zbrani iz literature, in somatske variante so bile zbrane iz kataloga somatskih mutacij v raka (COSMIC) baze podatkov (http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/~~HEAD=pobj kozmično /). Trije novi E-kadherina zaporedje variant, kjer poročajo našem laboratoriju za funkcionalno analizo: E185V, S232C in L583R. V zadnjem času, so poročali L583R, s povezano funkcionalnih podatkov [22].

PDBs E-povezanih kadherina smo identificirali s samodejnim iskanjem švicarsko Model repozitorija (http://swissmodel.expasy.org). Zaporedje uskladitev humanega E-kadherina in vsaka od sekvenc, ki se uporabljajo za različne modele smo izvedli z M-aparat [23], [24] (http://tcoffee.crg.cat/apps/tcoffee/play?name=mcoffee ). Slike so bile pripravljene z Pymol. Po analizi zaporedja in strukturno homologijo, so bili trije PDBs izbrani uporabiti kot model. Xenopus C-kadherina ektodomene (PPP 1L3W), miška E-kadherina prodomain (PPP 1OP4) in miške β-catenin vzajemno domeno (PPP 1I7X)

FoldX izračuni in PRESEJANJE analiza

Z FoldX ukaz (http://foldx.crg.es/) Buildmodel
smo zgradili tri različne modele (prodomain, zunajcelični in citoplazme); tri strukture smo humaniziramo z nadomestitvijo vsakega različnega aminokisline. Nastala struktura je bila optimizirana z ukazom RepairPDB
in energije, kjer analizirani z stabilnost
ali AnalyseComplex
ukazov. Mutacije povezano bolezni so bili ustvarjeni s Buildmodel
ukaz, vsako mutacijo ponavljajo v petih tekov. Energije so samodejni izhod v FoldX in sprememba domačin stanje stabilnosti, ΔΔG med WT in mutant (ΔΔG = ΔG _{WT-ΔG Mut) nastajajo tudi v ločeni datoteki, z ustreznim standardom odstopanja in vse energetske sankcije so povezana z vsako mutacijo. Samo mutacije z ΔΔG > 0,8 kcal /mol, so bile obravnavane škodljivih}

Uporabili smo odbirati (http://sift.jcvi.org/~~HEAD=dobj, Sortirna Netolerantna Od toleranten) oceniti ohranjanje vsakega aminokislin nadomestitve, kot je bilo prej. opisano [25], z uporabo funkcije trenutku GI. 31073. le mutacije z rezultatom pod 0,05 so se šteli za Netolerantna

prop (http://www.cbs.dtu.dk/services /prop /) [26] je bil uporabljen za oceno, če bi mutacije vplivajo na prodomain cepitvi.

celične kulture in Transfekcije

E-kadherina WT cDNA smo klonirali v pIRES2-EGFP vektorja po za izdelavo navodil (Clontech, Takara Bio) in mutacije E185V, S232C, L583R in L583I HE-kadherina so inducirane s spletnega mesta usmerjeno mutagenezo kot prej [27] opisano. Prazen vektor (Mock), smo uporabili kot kontrolo celice

CHO (kitajskega hrčka) (številka ATCC: CCL-61). Gojimo v Alfa-MEM mediju (Gibco, Invitrogen), dopolnjen z govejim ploda 10% seruma (FBS; Gibco, Invitrogen) in 1% penicilin-streptomicina (Gibco, Invitrogen). Celice so bile občasno ocenjevali mikoplazme kontaminacije z imunofluorescence z DAPI. Celice smo transficirali z 1 ug vsakega od vektorjev, ki kodirajo različne oblike E-kadherina (WT, E185V, S232C, L583R in L583I) z Lipofectamine 2000 (Invitrogen), v skladu s postopkom izdelave. Za stabilno obratu celične linije so bile celice, ki jih odpornost na antibiotike izbran do 5 ug /ml blasticidin (Gibco, Invitrogen). Vse celične linije so se ohranila v vlažnem inkubatorju s 5% CO _{2 pri 37 ° C}

Funkcionalni testi

prehodno transfektiranih CHO (kitajskega hrčka) celice (ATCC številka:. CCL -61) je bilo izpostavljeno, da teče citometry, z merjenjem GFP fluorescence, da oceni učinkovitost transfekcije pred vsakim poskusom. Za počasno seštevanja testu smo jamice 96-dobrega plošči prevlečena z 50 ul raztopine agar (100 mg Bacto-Agarja v 15 ml sterilne PBS). Celice so sneti z tripsin in suspendiramo v gojišče. Suspenzijo 1 x 10 ^{5 celic /ml smo pripravili in 2 x 10 4 Celice smo zasejali v vsako jamico. Ploščo smo inkubirali pri 37 ° C v navlaženi komori s 5% CO _{2 za 48 ur. Združevanje so ocenili v obrnjenem mikroskopom (4 x povečave) in fotografirali z digitalnim fotoaparatom.}}

Western blot

Mobilni lizati so bili pridobljeni z Catenin liznega pufra (1% Triton X-100, 1 % Nonidet P-40 v PBS), dopolnjena s koktajlom zaviralca proteaz (Roche) in koktajl zaviralec fosfataze (Sigma). Protein količinsko je bilo narejeno z modificiranim Bradford testu (Bio-Rad). Za vsak vzorec smo nanesli 25 mikrogramov proteina, loči 7,5% SDS-PAGE in electroblotted na nitrocelulozno membrano (GE Healthcare Life Sciences). Membrane smo blokirali s 5% brez maščob mleko v prahu in 0,5% Tween-20 v PBS. Imunoblot je bila izvedena s protitelesi proti E-kadherina (1:1000; BD Biosciences), aktin (1:1000, Santa Cruz Biotechnology) in α-tubulin (1:10000, Sigma). Ovce anti-mouse (GE Healthcare Life Sciences) ali osel anti-koza (Santa Cruz Biotechnology) so bili uporabljeni kot sekundarna protitelesa, sledi odkrivanje ECL (GE Healthcare Life Sciences). Immunoblots so pri Količina količinsko One (Bio-Rad).

-fluorescence aktivira celic (FACS) sortiranje

Celice smo gojili na sotočje enoplastni, napoteni s versene (Gibco, Invitrogen) in resuspendirali v ledeno mrzlo PBS z 0,05 mg /ml CaCl _{2. Suspenzijo 5 x 10 ^{5 celice smo centrifugirali 5 minut na 1500 rpm 4 ° C, in sprali v PBS z 0,05 mg /ml CaCl 2 3% BSA. Celice smo inkubirali 60 minut s primarnim protitelesom proti E-kadherina, HECD1 (Zymed Laboratories) v 1:100 razredčenju. Celice smo sprali dvakrat in nato inkubiramo z anti-miško biotinilated (Dako) na 1:100 razredčenju. Celice smo sprali dvakrat in nato inkubiramo z streptavidina PE-Cy5 (BD Pharmingen) ob 1:40 razredčenju. Končno izperemo celice resuspendirali v 500 ul PBS in 50000 celice so bili analizirani v pretočnim citometrom (Coulter ep XL-MCL). Podatki so bili analizirani s programsko opremo WinMDI.}}

imunofluorescenčni obarvanje

Za imunofluorescenčni in mikroskopijo smo celice zasejemo na steklenih coverslips in zrasla za približno 80% sotočju, določen v ledeno mrzlo metanola 15 minut, izperemo 2-krat s PBS in inkubiramo s primarnim protitelesom, razredčene v PBS 5% BSA, 60 minut pri sobni temperaturi. uporabljena primarna protitelesa: miš monoklonsko anti-E-kadherina (BD Biosciences); rabbit anti-Calnexin (Stressgen). Sekundarna protitelesa uporabljajo: Alexa Fluor 488 anti-mouse (1:500, Invitrogen); Alexa Fluor 594 anti-zajec (1:500; Invitrogen). V coverslips so bili nameščeni na steklene ploščice, s pomočjo Vectashield z DAPI za jedrsko odkrivanje (Vector Laboratories). pridobitev slika je bila izvedena na Carl Zeiss Apotome Axiovert 200 M fluorescenčni mikroskop z uporabo 40 x ciljev. Slike so bile pridobljene s AxioCam HRM kamero in obdeluje programske Axiovison različico 4.8.

Cell Zdravljenje

Za inhibicijo sinteze beljakovin, celice so zdravili z 25 uM za cikloheksimidu 8 h in 16 h, in količina celotnega E-kadherina smo analizirali z WB, kot smo že prej opisali. Za inhibicije proteasoma testom smo celice zasejali v 6 vdolbinicami, zrasla za približno 80% od sotočja ter inkubirali 16 ur pri 10 mikrometrov MG132 (Calbiochem). Celični lizati smo analizirali s Svetovno banko, kot je opisano zgoraj.

Rezultati

1. E-kadherina strukturni modeli

Na voljo sta nekaj človeško E-kadherina (HE-CAD) strukture in zajemajo le majhne dele proteina (tabela S1). S samodejnim iskanjem švicarske Model skladišču, smo ugotovili, da je PPP 1L3W, označi za celovečerni zunajcelični domeni Xenopus EP-kadherina (EP-CAD), visoko homologna za isto domeno v človeški E-kadherina. Analizirali smo sekvenčno homologijo s poravnavo z uporabo M-kavo, večkratno zaporedno poravnavo, ki združuje proizvodnjo več različnih paketov zaporedja za poravnavo (PCMA, Poa, Mafft, mišic, T-kava, ClustalW, ProbCons, DialignTX) [23], [24 ]. Slika 1A prikazuje prilagajanje obeh ekstracelularnih sekvence domene. Rdeče opeke regije predstavljajo popolno soglasje med uporabljenimi metodami, ki predstavljajo zelo podobne sekvence. Za izgradnjo vzorčno strukturo, smo odstranili regije brez podobnosti (slika 1A, zvezde), in omejen model v regijah z zanesljivo poravnavo (črno puščico, slika 1A). Struktura Xenopus je naredila človeka, kot je opisano v Materiali in metode in slika 1B prikazuje strukturno prilagajanje HE-CAD ES1-EC2 domen (od PPP 2O72) in ES1-ES2 domene za Xenopus izpeljane strukturni model. Dva strukture blizu prekriva, kar kaže, da je podobnost med ekstracelularnih domen človeškega E-kadherina in Xenopus EP-kadherina ne samo na ravni zaporedja, ampak tudi na strukturni ravni. Strukturni model človeškega E-CAD kaže združljive energije s strukturo iz Xenopus, z rahlim znižanjem za brezplačno energijo (ΔG), dobljene iz modela (ΔG _{realno = 559,99 kcal /mol in ΔG modelu = 531.77 kcal /mol), kar kaže, da humanizacijo ne uvaja dodatnih spopade. Pred kratkim je bila struktura miške zunajcelične domene sprosti (PPP 3Q2V, tabela S1), in smo tudi to strukturo kot model, kot način za izboljšanje rezultatov, pridobljenih z modelom Xenopus.}

Ugotovili smo, dve drugi modeli, ki zajemajo Prodomain (PPP 1OP4, od miške N-kadherina) v in β-catenin citoplazme domene (PPP 1I7X, od miške E-kadherina), ki uporabljajo enako metodologijo. Trije modeli zajemajo večino beljakovin strukturo (slika 1C): model prodomain zajema položaje 28-117, v ekstracelularni modeli pozicije 155-697 in β-catenin citoplazme področje zajema 782-838. Na ravni jukstamembranskem domene, ena struktura označi, ki obsega vzajemno površino med E-kadherina in P120 [28]. Ta struktura vsebuje majhno, 18 aminokislin dolgo peptid (zajema položaje 756-773 na HE-CAD), z zelo nizko strukturno vsebine, dejavniki, ki zmanjšujejo zanesljivost izračunov energije, zato zavrže to strukturo iz analize.

2. silico
napovedovanje učinka, povezana z rakom E-kadherina USVs

mutacij-E kadherina niso le genetski vzrok HDGC, vendar so prav tako pogosto najdemo v različnih vrstah sporadično raka. Analizirali smo silico
vpliv vseh z rakom povezana E-kadherina missense mutacij, ki lokalizirajo na regije s strukturnimi modeli pokriva ustvarjeni: 22 reproduktivnih mutacij najdemo v nastavitvah HDGC in EODGC, in 57 so v občasnih raka. Reproduktivnih-E kadherina USVs so bili zbrani iz literature, in nekateri so osebne komunikacije v našem laboratoriju. Nekatere HDGC /EODGC mutacije ni mogoče modelirati zaradi pomanjkanja strukturne informacije (npr tistih lokaliziranih v jukstamembranskem področju E-kadherina) in niso bili vključeni v to analizo. Somatske mutacije so bili zbrani iz podatkovne baze Cancer Genome Project, in vsebujejo mutacije najdemo v želodcu in lobularnega raka dojke (edina vrsta raka povezana s HDGC), temveč tudi druge vrste raka, kot sklepno sarkom ali žolčevoda karcinoma (tabela S2 ).

Uporaba strukturnih modelov prej opisanih, smo uporabili FoldX za ustvarjanje vsako USVs povezanimi z rakom, in ocenili njihov materni državno stabilnost, ΔG (običajno iz popolne energije za preprostosti) [20]. Energična Razlika med referenčno WT in ustrezno mutant (ΔΔG = ΔG _{WT-ΔG Mut) je bila izračunana za 22 HDGC /EODGC E-kadherina USVs lokalizirane v regijah, ki modela strukture podjetja, in Rezultati so navedeni v tabeli 1. Ko se ΔΔG negativen, to odraža dobiček materni državno stabilnost mutirane oblike; ko je pozitivna, to pomeni, da je mutant manj stabilna dobi referenčno WT. Prejšnje študije v drugih proteinov, ki so pokazale, da so spremembe, stabilnost, izračunane z FoldX algoritmom pod 0,8 kcal /mol, so v spremembah napake programske opreme, in se zato šteje, da ni pomembno [21]. V skladu s tem smo samo šteje mutacije, da bo rušila, ko pride do spremembe energije nad 0,8 kcal /mol. V sliki 2A, mutacije nad sheme so destabilizacije, medtem ko so spodnji tisti strukturno prenaša. Jasno je, da se destabilizira mutacije spead ob beljakovin, brez preferenčnega domeno prizadela.}

prodomain He-CAD je razcepljen med zorenjem, in če se to ne doseže, je E-kadherina lepilo funkcija oslabljena [ ,,,0],29], [30]. Za mutacij lokaliziranih na tem področju, smo ocenili vpliv na celotne energije z FoldX, ohranjanju s presejanje, pa tudi oceniti, če je poseg v mestu prodomain cepitve z prop (podrobnosti v Materiali in metode). Ugotovili smo, da sta dedna (G62V in T118R) in občasno (P30T, G62D, H92Y, H121R in H123Y) mutacije lokalizirane v E-kadherina prodomain strukturno prenaša, kot napovedujejo FoldX (tabela S3). Ko smo analizirali vpliv, ki temelji na ohranjanju uporabo presejanje, smo tudi ugotovili, da nobena od mutacij je zdelo škodljivo, ker je njihova stopnja ohranjenosti je nizka (Tabela S3). Ti rezultati kažejo, da je patogenost E-kadherina USVs lokaliziran v prodomain verjetno ni odvisna od destabilizacije. Ugotovili smo tudi ne vpliva na cepitev propeptida, kot napovedujejo rekvizit (podatki niso prikazani). V skladu s tem smo prepričani, da lahko patogenost E-kadherina mutacij na tem področju izhajajo iz posega v sidranja proteinov, ki sodelujejo pri obdelavi prodomain, nemogoče napovedati v silicij
.

Dedni E -cadherin USVs zajel celotno dolžino zunajcelični domeni, medtem ko so sporadično mutacije pretežno nahaja v EC2-ES3, kot je v skladu s točko povezave prej opisanem v eksonov 7-9 [5]. Od vseh 18 reproduktivnih HDGC /EODGC mutacij lokaliziranih na tem področju, smo ugotovili, da ima 10 znaten strukturni vpliv na beljakovine (tabela 1). Približno polovica sporadičnih mutacij so tudi destabilizacijo (tabela S3), neodvisno od domene ES kjer so lokalizirane, kar kaže, da se domačin stanje destabilizacijo lahko povezan z znatnim frakcijo sporadičnih raka izgube E-kadherina s točkovno mutacijo.

le tri mutacije so lokalizirani v regiji, ki jo model citoplazemske β-catenin vezave domene (P799R, V832M, S838G) preslikan: prvih dveh opredeljenih v okolju HDGC /EODGC, drugo pa sporadični, je pokazala, v jajčnikov raka [31]. Za te mutacije smo analizirali vezne energije med E-kadherina in beta-catenin in ugotovila, da nobeden od njih bistveno spremeni afiniteto za beta-catenin, po katerem FoldX napovedi. To je v skladu z in vitro
Rezultati kažejo, da je dedna mutacija V832M učinkovito veže beta-catenin, in zdi se, da je odvisna od nezmožnosti E-kadherina /β-catenin kompleksa zavezujoč α njena patogenost -catenin [32], [33].

smo zbrali vse napovedi in funkcionalno in vitro
podatki HDGC /EODGC mutacij in analizirali zanesljivost kazalcev, ki se uporabljajo (tabela 1). razdeljeni smo rezultate od napovedi, kot so: True Pozitivni (TP), ko je mutacija napovedal kot škodljivo silico
(bodisi FoldX ali PRESEJANJE) in kažejo izpad funkcije in vitro
; Res je negativna (TN), ko je mutacija napovedal kot prenašajo v silicij
in je funkcionalno in vitro
; False Positive (FP), ko je mutacija napovedal kot škodljivo v silicij
vendar je funkcionalna in vitro
; in False Negative (FN), ko je mutacija napovedal kot prenašajo silico
vendar eksponati in vitro
izgubo funkcije. TP in TN pozitivne rezultate, kar pomeni, da so napovedujejo sposobni prepoznati vpliv mutacij v funkciji; FP in FN predstavljajo njihovo stopnjo okvare. Ugotovili smo, da sta oba algoritmi sposobni napovedati funkcionalnega učinka do 70% reproduktivnih HDGC /EODGC mutacij (11 od 16 mutacij), pri napovedi prekrivajo za polovico mutacij (tabela 1, slika 2B).

analizirali smo podatke, ki so na voljo za zarodne linije HDGC /EODGC mutacije prevozniki in, čeprav je informacija omejena, smo ugotovili, da je najbolj popoln nabor podatkov, starost nastopa ali smrti, povezanih s DGC. Ko smo box-plot te podatke, skupina "rušila" in "Non-rušila" mutacijo prevoznikom, opazimo očiten mlajši starosti nastopu bolezni (diagnoza ali smrt) za prvo skupino (slika 2D), kar kaže, da je domačin državne destabilizacijo računi za prejšnje razvoj DGC.

3. Biološki pomen E-kadherina destabilizacije

Za določitev biološki pomen E-kadherina destabilizacije, smo uporabili kot modelni sistem tri na novo ugotovljenih E-kadherina reproduktivnih missense mutacije poročali na našem laboratoriju za funkcionalnih značilnosti: E185V, S232C in L583R, kasneje nedavno opisana v literaturi [22]. silico
analizi opisano prej smo izvedli v treh novih mutacij in rezultati so vključeni v tabeli 1 (spodaj temno črto). Mutacije E185V in S232C so strukturno prenaša, ΔΔG = 0,29 kcal /mol in -0,9 kcal /mol (tabela 1), šteje za nepomembno glede vpliva na strukturo. Mutacija S232C spodbuja zmanjšanje energije stabilizacijo proteina, kar je posledica izgube visoke energije serinom zakopane OH skupina, ki ni vključena v H-vezi, in namestitev na stransko verigo na cistein. Mutacija L583R povzroča destabilizacijo, s ΔΔG = 2.72 kcal /mol, kar odraža dramatičen premik od hidrofobne za hidrofilne aminokisline, ki povzroči, da je arginin niso sposobne, da tvorijo H-vezi, ki neugodno pokopan.

n vitro
funkcionalne analize so bile izvedene omenjenih HDGC /EODGC mutacij, in smo našli popolno korelacijo med funkcionalnostjo in vitro
in prisotnosti /odsotnosti strukturnega vpliva: E185V in S232C ohranijo lepilni funkcija E-kadherina, in so sposobni, da se tvori tesen celične agregate, medtem L583R kaže jasno razpršene vzorec, ki spominja mock celice (slika 3A), kar kaže, da so E185V in S232C nepatogeni in L583R patogen.

Ko smo analizirali E-kadherina ekspresije v različnih celičnih linijah, smo ugotovili, da je celotna količina mutanta L583R nižja izraz WT pod enakimi pogoji, medtem ko mutacij E185V in S232C, ohranijo normalnih ravneh (Slika 3b). Zanimivo je, da je skupina, ki ustreza L583R zadrži v gelu, ki kaže, da je L583R ne more ustrezno zrel (nezreli obliki E-kadherina je 130 kDa, zrel je 120 kDa) in pretočna citometrija rezultati kažejo, da je manj izražena v plazemske membrane (slika 3C).

Ko protein zorenje ne uspe, je to običajno za posledico Endoplazemski retikulum (ER) ohranitev nezrelega beljakovin. Če želite preveriti, ali je bila L583R dejansko zadrži kot nezrelih, smo analizirali, če se obdrži na urgenci sočasno imunofluorescenco z ER marker calnexin (slika 4A), in ugotovil, da je del L583R signala prekriva z ER označevalec, kar kaže na povečano zadrževanje ER.

Da bi razumeli, če bi bilo mogoče zaznati destabilizacijo in vitro
smo analizirali stabilnost L583R v celici, oceni njen promet. blokirali smo sintezo beljakovin z cikloheksimidu in ugotovili, da je L583R hitro razgradijo, kot ga preostanka ekspresijo ocenili kmalu po 8 urah inhibicije sinteze proteina, v nasprotju z WT in drugih mutantov, ki so še vedno zelo izražene v istem stanju (slika 4B) , kar kaže, da je L583R nestabilen v celici. Prisotnost nezrelih pasu, WT ali mutiranih vzorcev E-kadherina (top band, slika 4B) je zaradi preobremenitve beljakovin, ki izhaja iz prehodnih transfekciji.

Nestabilna ali nepravilno zgubane proteini so dobro urejena z mehanizmi za nadzor Protein kakovosti ki ščitijo celice z usmerjanjem na novo sintetizirane neprepognjenih proteine ​​za razgradnjo v proteasoma [34]. Obravnavati, če to velja za L583R smo zaviral aktivnosti proteasoma z MG132 in ugotovili, da kljub različnim začetnih stopnjah E-kadherina, je izraz mutanta L583R celoti obnovljena po zdravljenju (slika 4C), kar kaže, da je predčasno razgradi z proteasoma po sintezi, kot je prej opisano za druge juxtamembranar-HDGC povezan mutacij-E kadherina [35]. Zanimivo je, da, ko je razgradnja proteasoma zaviral, da je kopičenje nezrelih E-CAD v vseh celičnih linijah, ki se objavlja pomen proteasoma pri urejanju novo sintetiziranega E-CAD, ne glede, da so mutirani ali ne.

za dodatno potrditev silico
napovedi, smo analizirali fenotip z povrne na destabiliziralo mutacij, ki jih inducira strukturno prenašali spremembo v enakem položaju mutirane oblike e-kadherina. Uporaba FoldX, smo izračunali vpliv vsake morebitne spremembe v položaju 583 in ugotovil, da je bila sprememba inducira manj destabilizacijo L583I (ΔΔG = 0,56 kcal /mol, kot je napovedano z uporabo modela miške, Tabela S3). Zanimivo je, da je ta mutacija ohranja funkcijo lepljivo z E-kadherina, ki izhajajo iz kompaktnih agregatov celic (slika 4D), in ne destabilizacijo vitro
, kaže cicloheximide odpornost, primerljivo z obliko WT (slika 4E). Ti rezultati poudarjajo zanesljivost v silicij napovedi
osnovi stabilnosti E-kadherina in jasno združenje E-kadherina destabilizacije z izgubo lepilnim funkcije.

Pogovor

E-kadherina spremembe (mutacije, izbrisi in metilacija) so edina priznana genski vzrok HDGC [36] [37] [38]. Večina mutacij, opredeljenih v HDGC so vrste neumnosti, ampak velik delež (20%) od reproduktivnih mutacije povzročijo posameznih aminokislin menjav, od katerih je patogenost težko oceniti in je pogosto nejasna [39], [40]. Najbolj pomembne informacije v zvezi z genetskim svetovanjem reproduktivnih prevoznikov missense mutacij je družinsko kliničnih podatkov (analiza segregacije, večinoma), vendar so te informacije pogosto primanjkuje z velikostjo rodovnikom pogosto čemer je premajhna, da bi študij ločevanja, in oceno patogenosti običajno prihaja iz vitro
funkcionalnih testiranju na celični ravni [15], [17], ki so veliko časa in tehnično zahteven in zato niso pogosto uporablja v rutinskih molekularnih laboratorijev. Zato obstaja potreba po novih metodah za določanje patogenost E-kadherina missense mutacij, povezanih s HDGC [40].

• Plos ONE: Integracija DNK Kopiranje Število spremembe in transkripcijske Expression analize v človeške želodčne Cancer
• Plos ONE: fermentirano mleko s Propionibacterium freudenreichii inducira apoptozo HGT-1 Human želodca Rak Cells