PLOS NËMMEN: E-Cadherin Déstabiliséierung Konten fir d'Pathogenicity vun Missense kennen Ierfgroussherzog Firwat Gastric Cancer

Wat VerfÜgung

E-cadherin ass kritesch fir den Ënnerhalt vun Otemschwieregkeeten Architektur duerch seng Roll am Zell-Zell Haftung. E-cadherin Projet'en sinn d'genetesch Ursaach vum Ierfgroussherzog Firwat Gastric Cancer (HDGC) an missense kennen vertrieden engem Medeziner Belaaschtung, wéinst der Onsécherheet vun hire pathogenic Roll. Kënschtlech an VIVO, nodeems meescht kennen ze Verloscht-vun-Funktioun, obwuel d'causal Faktor fir d'Majoritéit onbekannt ass. Mir Hypothes, datt Déstabiliséierung fir d'pathogenicity vun E-cadherin missense kennen HDGC Kont hätt, a getest eis Hypothes an silico benotzt an kënschtlech Handwierksgeschir. FoldX sind war benotzt den Impakt vun all stattfannen an E-cadherin gebierteg-Staat Stabilitéit ze berechnen, an d'Analyse huet mat verännert Conservatioun kënnt, déi z. Spannen, HDGC Patienten germline E-cadherin destabilizing mutants presentéieren engem jonken Alter bei Diagnos oder Doud ausser suggeréiert datt de Verloscht vun déem-Staat Stabilitéit vun E-cadherin Konte fir d'Krankheet phenotype. Fir d'biologesch Relevanz vun E-cadherin Déstabiliséierung zu HDGC entschlësselen, ze propagéieren mir e Grupp vu nei identifizéiert HDGC-verbonne kennen (E185V, S232C an L583R), vun deem L583R virausgesot ass destabilizing gin. Mir weisen, datt dëst stattfannen kënschtlech net funktionell ass, geet kuerz Halschent-Liewen an ass knapp un eeler, wéinst virzäitegen proteasome-ofhängeg ofgeschnidden, engem phenotype vun Stabiliséierung mat der kënschtlech stattfannen nees L583I (strukturell toleréiert). Ëmzestoussen Rapport mir E-cadherin strukturell Modeller gëeegent den Impakt vun der Majoritéit vun Kriibs-verbonne missense Projet'en ze viraus a mir weisen, datt E-cadherin Déstabiliséierung zu Verloscht-vun-Funktioun féiert an eng kënschtlech a fräi pathogenicity zu VIVO. VerfÜgung

Fro: Simões-Correia J, Figueiredo J, Lopes R, Stricher F, Oliveira C, Serrano L, et al. (2012) E-Cadherin Déstabiliséierung Konten fir d'Pathogenicity vun Missense kennen Ierfgroussherzog Firwat Gastric Cancer. PLoS NËMMEN 7 (3): e33783. Doi: 10.1371 /journal.pone.0033783 VerfÜgung

Redakter: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japan VerfÜgung

Arnaque: 9. November 2011; Akzeptéiert: 17. Februar 2012; Publizéiert: 21. Mäerz 2012 VerfÜgung

Copyright: © 2012 Simões-Correia et al. Dëst ass eng oppen-Zougang Artikel ënnert de Bedingunge vun der Lizenz BY Creative Commons verdeelt, déi bereet benotzen Genehmegungen, Distributioun, an Reproduktioun vun all mëttelgrouss, gëtt d'Original Auteur an d'Quell Kaiser sinn VerfÜgung

Funding:. Dës Aarbecht vun Fundação Para engem Ciência e Tecnologia, Portugal (PTDC /Sau-OBD /64319/2006, PTDC /Sau-OBD /104017/2008, SFRH /BPD /48765/2008) war ënnerstëtzt, EMBO (kuerzfristeg hëllefen ASTF 60- 2009) an EU Subventiounen Perspektiven (HEALTH-F4-2008-201648). D'funders hu keng Roll am Etude Design, Daten Kollektioun an Analyse, Décisioun, oder Virbereedung vun der mëttelalterlech Handschrëft ze publizéieren VerfÜgung

Wettsträit Interessen:.. D'Auteuren hunn deklaréiert, datt keng Competitioun Interessen existéieren VerfÜgung

Aféierung VerfÜgung

e-cadherin ass eng Zell-Zell Haftung glycoprotein aus vu fënnef extracellular cadherin-Typ Widerhuelung, ee transmembrane Regioun an eng héich conserved cytoplasmic Schwäif [1], [2]. E-cadherin ass virun allem am epithelial Zellen ausgedréckt an ass de grousse Volet vun Adherens Junctions (AJ). Dës junctions Stärekoup, via homophilic Interaktiounen, duerch d'extracellular Beräicher vun Kalzium-ofhängeg E-cadherin Molekülle, op der Uewerfläch vun homotypic Noper Zellen. VerfÜgung

D'Roll vum E-cadherin zu entholl Entwécklung ass gutt beschriwwen, an hir Verloscht vun Ausdrock ass e Pionéier vun carcinomas [3]. Experimentéierte Beweis ënnerstëtzt eng Roll fir d'E-cadherin komplex souwuel zu suppressing Invasioun an Metastasen Équipe [4]. Verloscht vun E-cadherin Ausdrock ass vun insertions ëmmer fir genetesch Evenementer wéi splice Site an truncation kennen, geläscht, a lächerlech kennen, zousätzlech zu missense kennen [5] dacks verbonnen. An sporadesch diffusen gastric Kriibs, hire Restaurant an der Gentherapie Zeechesaatz E-cadherin (CDH1) sinn zéien an exons 7 bis 9 [5], iwwerdeems zu lobular Broscht Cancers si laanscht der Gentherapie, mat kee privilegiéierten Hotspot Verbreedung fonnt [6]. Missense Projet'en sinn an dësen zwou Zorte vun sporadesch Kriibs an och zu synovial sarcomas [7]. VerfÜgung

FAMILIAL Usammlung vun Firwat Gastric Cancer (DGC) duerstellt 10% vun de Fäll vun Gastric Cancer (GC) fonnt, an nëmmen 1-3% si ierflech [8]. Vun dësen familial Fäll, ass Ierfgroussherzog Firwat Gastric Cancer (HDGC) vun streng Critèren definéiert, datt duerch d'International Gastric Cancer Linkage Consortium (IGCLC) vun 1999 definéiert goufen: (1) zwou oder méi dokumentéiert Fäll vun diffusen gastric Kriibs an éischt /zweet Diplome op d'mannst eng Famill, mat festgestallte virum Alter vun 50; oder (2) dräi oder méi Fäll vun dokumentéiert diffusen gastric Kriibs an éischt /zweet Diplome Familljememberen, onofhängeg vun Alter. Fréi agesat Firwat Gastric Cancer (EODGC) considéréiert gëtt wann isoléiert eenzel mat DGC mat manner dann 45 Joer diagnostizéiert gëtt. Germline CDH1 Projet'en sinn an 30% vun de Fäll HDGC fonnt [9]. D'Associatioun vun CDH1 Projet'en a familial gastric Kriibs éischte vun Guilford beschriwwen et al VerfÜgung vun 1998 [10] an zënter hier vill Studien gemellt verschidden Zorte vun CDH1 kennen HDGC [11], [12], [13 ]. Ënnert all Rapport CDH1 VerfÜgung germline kennen, 77,9% sinn lächerlech, splice-Site an frameshift kennen (dermat ze virzäitegen anze- codons produzéiere) an 22,1% sinn missense kennen [9]. Projet'en déi PTC erstallt ginn normalerweis Liewer, sinn d'Patienten héije Risiko wwerreeche considéréiert, a si ugeroden prophylactic total gastrectomy ze hunn [14]. D'pathogenicity vun missense kennen ass net einfach, an deenen hire Restaurant sinn allgemeng als Klass liichtkraaftarm Varianten (USVs) wéinst dem Manktem u streng Critèrë bezeechent hiren Impakt ze diskutéieren. Puer Punkten gewiescht fir d'Klassifikatioun vun E-cadherin USVs zu HDGC berücksichtege: 1) Co-Segregatioun vun der stattfannen mat DGC (bannent pedigrees); 2) stattfannen Frequenz am gesond Kontroll Bevëlkerung; 3) stattfannen Terrain (an onofhängeg Famille). Segregatioun Analyse ass oft onméiglech, mat enger klenger Zuel vu betraffene Fäll sinn fir molekulare Diagnos [15], an d'Flichte vun de Medeziner Informatiounen ass eng limitéieren Schrëtt der pathogenic Bedeitung vun dësen kennen ze soen. Fir dës Schwieregkeet circumvent mir virdrun entwéckelt hunn kënschtlech VerfÜgung funktionell assays der funktionell Impakt vun E-cadherin germline missense kennen [16], [17] diskutéieren. Allerdéngs, implicate esou Studien Labo spezifesch experimentell Konditiounen, nämlech Zell Biologie assays, a si vill Zäit an Iddi ze benotzen. An silico VerfÜgung Prognosen sinn zouverlässeg an séier Analyse, datt een den Impakt vum Punkt kennen ze soe benotzen kann, besonnesch wann strukturell Informatiounen sinn [18] ass, [19]. VerfÜgung

An dësem Wierk, mir lant de Potential vun Struktur-baséiert zu silico VerfÜgung Prognosen den Impakt vun E-cadherin missense kennen ierflech an sporadesch Kriibs fonnt ze diskutéieren,. Eis Analyse baséiert op der Berechnung vun déem-Staat Stabilitéit Ännerunge vun all Variant entschlof (ΔΔG = ΔG _{virstellen-ΔG Mut), andeems d'FAQ Design FoldX sind kritt [20], [21]. Spannen, den Grupp vu Patienten, ausser destabilizing kennen (ΔΔG > 0,8 kcal /mol) ass vun engem jonken Alter bei Diagnos oder Doud vun DGC charakteriséiert, suggeréiert datt de Verloscht vun der E-cadherin gebierteg-Staat Stabilitéit an d'Krankheet phenotype dréit. Mat Hëllef vun engem bewosst Modell, analyséiert mir de phenotype vun E-cadherin Déstabiliséierung, a fonnt, datt wann e stattfannen induces ofgeholl gebierteg-Staat Stabilitéit, E-cadherin fréi duerch d'proteasome deforméiert ass, geet kuerz Halschent-Liewen, geplatzt Verloscht vun der Kondom Funktioun. Ofzeschafen, eis Resultater hindeit, datt Déstabiliséierung fir d'pathogenicity vun E-cadherin missense kennen HDGC fonnt Konte. VerfÜgung}

spontan a Methode VerfÜgung

Erfaassung vun E-cadherin Haaptrei Varianten an PDBs VerfÜgung

E-cadherin Varianten bis HDGC oder EODGC verbonne waren aus der Literatur gesammelt, an somatic Varianten sech aus dem Katalog vun somatic Projet'en am Cancer (kosmescher) Datebank (http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/gesammelt kosmescher /). Dräi nei E-cadherin Haaptrei Varianten wou eist Labo fir funktionell Analys confirméiert: E185V, S232C an L583R. Viru Kuerzem, huet L583R gemellt, mat funktionell Donnéeën verbonne [22]. VerfÜgung

E-cadherin-Zesummenhang PDBs sech mat automatesch Sich mat Schwäizer Model Commons identifizéiert (http://swissmodel.expasy.org). Haaptrei Formatioun vu mënschlechen E-cadherin an all eenzel vun de Message fir déi verschidde Modeller benotzt gouf standing mat M-Kaffi [23], [24] (http://tcoffee.crg.cat/apps/tcoffee/play?name=mcoffee ). Biller waren mat Pymol virbereet. No analyséiert Haaptrei an strukturell homology, waren dräi PDBs ausgewielt esou Modeller ze benotzen:. Xenopus C-cadherin ectodomain (PDB 1L3W), Maus E-cadherin prodomain (PDB 1OP4) an der Maus β-catenin proposéiert public (PDB 1I7X)

FoldX Berechnungen an Analyse VerfÜgung z

Ausschöpfung FoldX (http://foldx.crg.es/) Kommando Buildmodel VerfÜgung mir gebaut dräi verschidde Modeller (prodomain, extracellular an cytoplasmic); déi dräi Strukturen sech duerch Wiessel vun all verschidden aminoacid humanized. Déi doraus resultéierend Struktur optiméiert gouf mat de Kommando RepairPDB VerfÜgung an der Energien, wou mat Stabilitéit VerfÜgung analyséiert oder AnalyseComplex VerfÜgung Befeeler. D'Krankheet-verbonne kennen sech zu fënnef leeft mam Buildmodel VerfÜgung Kommando, all stattfannen widderholl entsteet. Déi Energien sin eng automatesch Wasserstoff zu FoldX, an déem-Staat Stabilitéit änneren, ΔΔG, tëscht virstellen an Mann- (ΔΔG = ΔG _{virstellen-ΔG Mut) ass och an enger separater Fichier entsteet, mat den entspriechende Norm Hitparad, an all d'energesche Strofe fir all stattfannen assoziéiert. Nëmmen déi kennen mat ΔΔG > 0,8 kcal /mol goufen Liewer als VerfÜgung}

Mir benotzt z (http://sift.jcvi.org/, intolerant Zortéiere Vun tolerant) d'Conservatioun vun all aminoacid Wiessel ze diskutéieren, wéi virdrun. de Webber Fonktioun vun gi beschriwwen [25], mat Hëllef:. 31073. Nëmmen kennen mat engem stoung ënnert 0,05 sech als intolerant gin VerfÜgung

gestach (http://www.cbs.dtu.dk/services /gestach /) [26] war benotzt Projet'en ze diskutéieren, ob en Effekt op prodomain Rëss hätt. VerfÜgung

Zell Kultur an transfections VerfÜgung

e-cadherin virstellen cDNA zu pIRES2-EGFP Vecteure gekloonten war laut zu Fabrikatioun Uweisungen (Clontech, Takara Bio) an Projet'en E185V, S232C, L583R an L583I hien-cadherin vum Site ausernee mutagenesis virdrun ëmschriwwen entschlof sech [27]. Déi eidel Vecteure (mierkt) war als Kontroll benotzt VerfÜgung

CHO (Chinese Hamster Ovary) Zellen (ATCC Nummer: Chopper-61). Goufen zu Alfa-Mem mëttelfristeg (Gibco, Invitrogen) ergänzt mat 10% An et Bovine ugebaut serum (FBS; Gibco, Invitrogen) an 1% penicillin-streptomycin (Gibco, Invitrogen). Zellen sech fir mycoplasm kontaminéierte vun imunofluorescence mat DAPI Bierg bewäert. Zellen sech mat 1 ug vun jidderengen vun den vectors déi verschidde Forme vu E-cadherin (virstellen, E185V, S232C, L583R an L583I) benotzt Lipofectamine 2000 (Invitrogen) Zeechesaatz transfected, laut der Fabrikatioun Prozedur. Fir stabil Zell Linn Etablissement, goufen Zellen vun Antibiotike Resistenz zu 5 μg /ml blasticidin (Gibco, Invitrogen) ausgewielt. All Zell Linnen goufen zu engem humidified incubator mat 5% CO _{2 op 37 ° C haten VerfÜgung}

Fonctionnement assays VerfÜgung

Transiently transfected CHO (Chinese Hamster Ovary) Zellen (ATCC Nummer:. Chopper -61) waren citometry ze stréimen, GFP fluorescence Moosse benotzt, déi transfection Efficacitéit all Experimenter ze diskutéieren. Fir de luesen Usammlung assay, Wells vum 96-Meter-Plack sech mat 50 μl vun Agar Léisung (100 mg Bacto-Agar an 15 ml vun steril PBS) bedeckt. Zellen sech mat trypsin an suspendéiert zu Kultur mëttelfristeg ugebauten. A Ophiewe vun 1 × 10 5 Zellen /ml war bereet, an 2 × 10 4 Zellen sech an all gutt rakommen. Déi Plack gouf op 37 ° C an enger humidified Chamber mat 5% CO _{2 fir 48 h incubated. Usammlung war an eng Inverted microscope (4 × Vergréisserung) an fotografeschen mat enger digitaler Kamera bewäert. VerfÜgung}

Western blotting VerfÜgung

Zell lysates sech mat Catenin lysis Prellbock (1% Triton X-100, kritt 1 % Nonidet P-40 vun PBS), ergänzt mat protease inhibitor Cocktail (Roche) an phosphatase inhibitor Cocktail (Fläch). Protein quantification gouf vun engem geännert Bradford assay (Bio-Rad) gemaach. Fir all Prouf, war 25 μg vun FAQ iwwerlaascht, an 7.5% SDS-PAGE getrennt, a electroblotted zu nitrocellulose Membran (GE Gesondheetswiesen Life Sciences). Schläimhait sech mat 5% Nët-Fett dréchen Mëllech an 0,5% Tween-20 vun PBS gespaart. Immunoblotting war mat antibodies géint E-cadherin gesuergt (1:1000; BD Biosciences), actin (1:1000; Santa Cruz Déi), an α-tubulin (1:10000; Fläch). Schof anti-Maus (GE Gesondheetswiesen Life Sciences) oder Esel anti-Geess (Santa Cruz Déi) huet als sekondär antibodies, gefollegt vun ECL erkennen (GE Gesondheetswiesen Life Sciences) benotzt. Immunoblots waren an ech sinn One Software (Bio-Rad) laachen. VerfÜgung

Fluorescence-ageschalt Zell zortéieren (FACS) VerfÜgung

BTS zu engem Spuenien wär monolayer ugebaut goufen, ugebauten mat Versene (Gibco, Invitrogen) an an Äis kal PBS mat 0,05 mg /ml CaCl resuspended _{2. Eng Dispens vun 5 × 10 5 Zellen fir 5 Minutten op 1500 Ziichter 4 ° C, an gewäsch an PBS mat 0,05 mg /ml CaCl 2 3% BSA centrifuged war. Zellen sech fir 60 Minutten mat enger Primärschoul antibody géint E-cadherin, HECD1 (Zymed Laboratoiren) op 1:100 dilution incubated. Zellen sech zweemol an duerno incubated mat anti-Maus biotinilated (Dako) op 1:100 dilution gewäsch. Zellen sech zweemol an duerno incubated mat streptavidin PE-CY5 (BD Pharmingen) um 1:40 dilution gewäsch. Endlech, goufen Zellen gewäsch, an 500 μl vun PBS resuspended, an 50000 Zellen sech zu engem Flux cytometer (Coulter Epe XL-MCL) analyséieren. Donnéeën war mat WinMDI Software analyséiert. VerfÜgung}

Immunofluorescent staining VerfÜgung

Fir Immunofluorescence an microscopy, goufen Zellen rakommen op Glas coverslips a gewuess ronn 80% Niewebaach, fixen an Äis-kal methanol fir 15 Minutten, 2 Mol mat PBS gewäsch, a mat der Primärschoul antibody incubated, verdënntem vun PBS 5% BSA, fir an der 60. Minutt bei Raumtemperatur. Primärschoul antibodies benotzt: Maus monoclonal anti-E-cadherin (BD Biosciences); Kanéngchen anti-Calnexin (Stressgen). Secondaire antibodies benotzt: Alexa Fluor 488 anti-Maus (1:500; Invitrogen); Alexa Fluor 594 anti-Kanéngchen (1:500; Invitrogen). D'coverslips sech op Glas drënner Descher, mat Vectashield mat DAPI fir nuklear erkennen (Vecteure Laboratoiren). Bild Acquisitioun war op Carl König Apotome Axiovert 200 M Fluorescence Microscope mat 40 × Ziler gesuergt. Biller waren mat Axiocam Egal Kamera an Filteren vun Software Axiovison Versioun 4,8 chrétienne. VerfÜgung

Zell Behandlungen VerfÜgung

Fir d'FAQ Synthes inhibition, goufen Zellen mat 25 μM vun Cycloheximide behandelt fir 8 h an 16 h, an de Montant vun insgesamt E-cadherin war vun WK analyséiert wéi virdru beschriwwen. Fir d'proteasome inhibition assay, goufen Zellen zu 6 gutt Placke rakommen, zu ronn 80% vun Niewebaach gewuess, a fir 16 h mat 10 μM MG132 (CalBioChem) incubated. Zell lysates sech duerch WK analyséiert wéi virdru beschriwwen. VerfÜgung

Resultater VerfÜgung

1. E-cadherin strukturell Modeller VerfÜgung

Et ginn e puer Mënsch E-cadherin (en-Wikipedia) Strukturen sinn, a si Cover nëmme kleng Portiounen d'FAQ (Table S1). Benotzt automatesch Sich vun Schwäizer Model Commons, fonnt mir dass PDB 1L3W, forcéiert fir déi voll Längt extracellular Domän vun xenopus EP-cadherin (EP-CAD), zu der selwechter Domain an mënschlechen E-cadherin héich homologous ass. Mir analyséieren Haaptrei homology duerch Formatioun M-Kaffi mat, e Multiple Haaptrei Formatioun datt d'Wasserstoff puer Multiple Haaptrei Formatioun Formulen (PCMA, Poa, Mafft, Muskel, T-Kaffi, ClustalW, ProbCons, DialignTX) [23] combinéiert, [24 ]. Figur 1A weist d'Formatioun vun den zwou extracellular Domain Message. De roude Zillekonstruktioune Regiounen vertrieden perfekt Accord ënnert de Methode benotzt, vertrëtt héich ähnleche Message. Fir de Modell Struktur bauen, mir geläscht Regioune mat kee Ähnlechkeet (Dorënner 1A, Stären), a begrenzt de Modell ze Regioune mat verléisslech Formatioun (schwaarz Feil, Dorënner 1A). D'xenopus Struktur gouf am Material a Methoden a Dorënner 1B weist strukturellen Formatioun vun Hien-CAD EC1-EC2 Beräicher (aus PDB 2O72) an EC1-EC2 Beräicher vun der xenopus ofgeleet strukturell Modell ëmschriwwen humanized. Déi zwou Strukture si bal iwwerlagert, wat beweist, datt d'Ähnlechkeet tëscht der extracellular Domainen vum Mënsch E-cadherin an xenopus EP-cadherin ass op der Haaptrei Niveau net nëmmen awer och um strukturell Niveau. De Modell Struktur vum Mënsch E-CAD geet kompatibel Energien mat der Struktur vun xenopus, mat engem liicht erofgoen vun fräi Energie (ΔG) fir de Modell kritt (ΔG _{real = 559,99 kcal /mol an ΔG Modell = 531,77 kcal /mol), wat beweist, datt d'humanization net extra Groussbritannien heescht dodrop. Kuerzem, war eng Struktur vun der Maus extracellular Domain verëffentlecht (PDB 3Q2V, Table S1), a mir ginn och dës Struktur wéi e Modell, wéi eng Manéier d'Resultater mat den xenopus Modell kritt un Aktualitéit. VerfÜgung}

Mir etabléierten zwee aner Modeller, deckt de Prodomain (PDB 1OP4, aus Maus N-cadherin) an de β-catenin cytoplasmic public (PDB 1I7X, aus Maus E-cadherin), d'selwecht Methodik benotzt. Ofzeschafen, déi dräi Modeller Meeschter d'FAQ Struktur Cover (Dorënner 1c): d'prodomain Modell deckt Positiounen 28-117, déi extracellular Modeller Positiounen 155-697 an de β-catenin cytoplasmic Domain deckt 782-838. Um Niveau vun der juxtamembrane Domän, ass eng Struktur forcéiert, mat der proposéiert Uewerfläch tëscht E-cadherin an p120 [28]. Dës Struktur ass e klengen, 18 aminoacids laang peptide (Eechenholz Positiounen 756-773 op en-Wikipedia), mat Niddereg strukturell Inhalt, Facteuren, datt d'Zouverlässegkeet vun der Energie Berechnungen erofgoen, also mir discarded dës Struktur vun der Analyse. VerfÜgung

2. An silico VerfÜgung Cepheid vun den Impakt vun Kriibs-verbonne E-cadherin USVs VerfÜgung

E-cadherin Projet'en sinn net nëmmen d'genetesch Ursaach vun HDGC, mä si sinn och oft an verschidden Zorte vun sporadesch fonnt Cancers. Mir analyséieren zu silico VerfÜgung den Impakt vun all E-cadherin missense kennen Kriibs-Applikatioun, déi zu der Regioun vun der struktureller Modeller generéiert Daach localize: fonnt 22. germline Projet'en an d'Astellunge vun HDGC an EODGC, an 57 fonnt an sporadesch Cancers. Germline E-cadherin USVs sech aus der Literatur gesammelt, an e puer sinn perséinlech Kommunikatioun vun eiser Labo. Verschidde HDGC /EODGC Projet'en sinn net méiglech Modell, wéinst dem Manktem vun strukturell Informatiounen (e.g. de en der mannste vun der juxtamembrane Domän vun E-cadherin), a goufen net an dëser Etude mat abegraff. Somatic kennen sech aus der Cancer Genom Project Datebank gesammelt, an enthale zu gastric an lobular Broscht Kriibs (den just zwou Aarte vu Kriibs verbonne zu HDGC), awer och aner Zorte vu Kriibs wéi synovial sarcoma oder Bile duct carcinoma (Table S2 fonnt kennen ). VerfÜgung

strukturellen Modeller virdru beschriwwen benotzt, déi mir FoldX jiddereng vun de Kriibs verbonne USVs ze generéieren, a bewäert hier Mammensprooch-Staat Stabilitéit, ΔG (allgemeng als total Energie fir Simplicitéit bezeechent) [20]. D'energesche Ënnerscheed tëscht der virstellen Referenz an déi entspriechend Mann- (ΔΔG = ΔG _{virstellen-ΔG Mut) gouf fir de 22. op de Regioune vum Modell Strukturen Daach en der HDGC /EODGC E-cadherin USVs berechent, an der Resultater sinn an Table opgezielt 1. Wann ΔΔG negativ ass, dat spiegelt engem Gewënn vun déem-Staat Stabilitéit an der Mann- Form; wann et positiv ass, erausfonnt, datt d'Mann- manner stabil ass dann d'virstellen Referenz. Virdrun Studien an aner Proteinen hunn, datt Stabilitéit Verännerunge mat FoldX sind ënnert 0,8 kcal /mol sinn bannent de Feeler Ännerung vun der Software, a sinn dofir geduecht fir Nët-relevant [21] berechent gewisen. Anere Wierder, mir nëmmen dorunner kennen destabilizing gin wann se Energie Ännerungen virun 0,8 kcal /mol induce. An Dorënner 2A, déi kennen iwwer de Schema sinn destabilizing, iwwerdeems ënnen mannste strukturell toleréiert ginn. Et ass kloer, datt destabilizing kennen laanscht d'FAQ spead sinn, mat kee privilegiéierten Domain betraff. VerfÜgung}

D'prodomain vun Hien-CAD während maturation eenalecn ass, a wann dat net erfëllt ass, gëtt eng E-cadherin Kondom Funktioun leider [ ,,,0],29], [30]. Fir d'Projet'en an dësem Beräich en der, évaluéiert mer den Impakt vun insgesamt Energie mat FoldX, der Conservatioun mat z, an och wann d'Amëschen mat der prodomain Rëss Site mat gestach (Detailer zu spontan a Methoden) bewäert. Mir hu fonnt, datt souwuel ierflech (G62V an T118R) a sporadesch (P30T, G62D, H92Y, H121R an H123Y) an E-cadherin prodomain en der Projet'en strukturell toleréiert ginn, wéi déi vun FoldX (Table S3) virausgesot. Wann mir den Impakt baséiert op Conservatioun benotzt z analyséieren, mir hunn och, datt keent vun de Projet'en Liewer considéréiert huet, well hir Ofschloss vun der Conservatioun niddreg ass (Table S3). Dës Resultater weisen, datt d'pathogenicity vun E-cadherin USVs an der prodomain en der et wahrscheinlech net ofhängeg op Déstabiliséierung. Mir hunn och keen Effet op d'Rëss vun der propeptide, wéi vun gestach virausgesot (Donnéeën net gewisen). An anere Wierder, gleewe mir, datt d'pathogenicity vun E-cadherin Projet'en an dësem Beräich vun der Amëschen mat der Kopplungssystem vu Proteinen am prodomain Veraarbechtung Équipe Resultat kann, onméiglech ze soe zu silico VerfÜgung. VerfÜgung

Ierfgroussherzog E -cadherin USVs span der voller Längt vun der extracellular Domän, iwwerdeems sporadesch kennen Kannerbetreiung zu EC2-EC3 fonnt ginn, wéi am Aklang mat der Institutioun, déi virdrun am exons beschriwwen 7-9 [5]. Vun der Ganzen 18 germline HDGC /EODGC Projet'en an dësem Beräich en der, hunn mir déi 10 eng wichteg strukturell Impakt op d'FAQ (Table 1) hunn. Ongeféier d'Halschent vun der sporadesch Projet'en sinn destabilizing och (Table S3), onofhängeg vun der EG Domän, wou se en der sinn, a proposéiert, datt déi gebierteg-Staat Déstabiliséierung fir eng substantiell Ëmwandlung vun sporadesch Cancers sensibiliséieren E-cadherin Verloscht vun Punkt stattfannen verbonne ginn.

Nëmmen dräi Projet'en an der Regioun vun de Modell vun der cytoplasmic β-catenin bindend public (P799R, V832M, S838G) Ëmgéigend en der sinn: déi éischt zwee an der HDGC /EODGC Kader an déi aner een sporadesch, fonnt identifizéiert zu ovary carcinoma [31]. Fir dës Projet'en analyséiert mir de bindend Energie tëscht E-cadherin an β-catenin a fonnt, datt keent vun hinnen vill der bindend Affinitéit vun β-catenin Mäe, laut FoldX Cepheid. Dëst ass am Aklang mat der kënschtlech VerfÜgung Resultater weist, datt der ierfgroussherzoglecher stattfannen V832M Photo'en effizient β-catenin, a seng pathogenicity schéngt op d'Daf vun der E-cadherin /β-catenin komplex ofhängeg gin α zu festleeën -catenin [32], [33]. VerfÜgung

Mir gesammelt all d'Prognosen a funktionell kënschtlech VerfÜgung Donnéeën vun HDGC /EODGC kennen an analyséiert d'Zouverlässegkeet vun der benotzt dacks (Table 1). Mir séiert d'Resultater vun de Prognosen wéi: Richteg Positiv (TP) wann d'stattfannen als Liewer virausgesot ass zu silico VerfÜgung (entweder duerch FoldX oder z) a weise Verloscht vun Funktioun kënschtlech VerfÜgung; Richteg Negativ (TN) wann d'stattfannen als toleréiert virausgesot ass zu silico VerfÜgung a funktionell kënschtlech VerfÜgung; Falsch Positiv (voll) wann d'stattfannen gëtt als Liewer virausgesot zu silico VerfÜgung mee fonctionnell kënschtlech VerfÜgung; a falsch Negativ (Virun engem Joer souguer) wann d'stattfannen als toleréiert virausgesot ass zu silico VerfÜgung mä geet kënschtlech VerfÜgung Verloscht vun Funktioun. TP an TN sinn positiv Resultater, dat heescht, datt d'dacks kënnen déi stattfannen Impakt vun Funktioun ze entdecken; Voll a Virun engem Joer souguer vertrieden hir Ofschloss vun engem Echec. Mir hu fonnt, datt souwuel algorithms kënnen d'funktionell Impakt vu bis zu 70% vun der germline HDGC /EODGC kennen (11 aus 16 Projet'en) fir virauszesoen, mat Prognosen phpNuke fir Halschent vun de kennen (Table 1, Dorënner 2B).

mir analyséiert d'Donnéeë fir d'germline HDGC /EODGC kennen wwerreeche a sinn, obwuel d'Informatiounen limitéiert ass, hunn mir dass déi komplett Formatioun vun Donnéeën am Alter vun agesat oder Doud ze DGC verbonnen ass. Wann mir Box-Komplott dës Donnéeën, Glidderung "Destabilizing" an "Non-destabilizing" stattfannen wwerreeche, fest mir eng evident jonken Alter vun Krankheet agesat (Diagnos oder Doud) fir d'éischte Grupp (Dorënner 2D) suggeréiert datt gebierteg-Staat Déstabiliséierung Konte vun der éischter Entwécklung vun DGC. VerfÜgung

3. Biologesch Bedeitung vun E-cadherin Déstabiliséierung VerfÜgung

der biologescher Bedeitung vun E-cadherin Déstabiliséierung Fir erauszefannen, mir ginn als Modell System dräi nei identifizéiert E-cadherin germline missense Projet'en fir eis Labo fir funktionell characterization gemellt: E185V, S232C an L583R, déi spéider viru kuerzem an der Literatur beschriwwen [22]. D' zu silico VerfÜgung Analyse beschriwwe virdrun fir dësen dräi nei Projet'en Leeschtung war an d'Resultater sinn an Table 1 (ënnert dem donkel Linn) abegraff. Projet'en E185V an S232C si strukturell toleréiert, mat ΔΔG = 0,29 kcal /mol an -0,9 kcal /mol bzw. (Table 1), als gesäit wat den Impakt vun Struktur. Stattfannen S232C ënnerstëtzt eng Diminutioun an Energie, d'FAQ stabilizing, an dat ass wéinst dem Verloscht vun den héijen Energien vun engem Serine leider Grupp Schetzel, deen net an eng H-Emissioun Équipe ass, an zu der Wunneng vun der sidechain vun Cysteine. Stattfannen L583R induces Déstabiliséierung, mat ΔΔG = 2,72 kcal /mol, bidden de dramatesch änneren aus engem hydrophobic zu hydrophilic aminoacid, déi Resultater an eng Arginine net konnt H-Obligatiounen bis Form, akzeptéieren begruewe ginn. VerfÜgung

Ech n kënschtlech VerfÜgung funktionell assays fir d'uewendriwwer-ernimmt HDGC /EODGC kennen gesuergt huet, a mir eng perfekt Korrelatioun tëscht der Funktionalitéit kënschtlech VerfÜgung an der Präsenz /Feele vu strukturelle Impakt: E185V an S232C behalen de Kondom Funktioun vun e-cadherin, a si konnt knapper bewosst Bodrum zu Form, iwwerdeems L583R eng kloer Fragmenter Muster, Mooss mierkt Zellen (Dorënner 3A) geet, wat beweist, datt E185V an S232C Nët-pathogenic an L583R ass pathogenic. VerfÜgung

Wann mer E-cadherin Ausdrock vun de verschiddene Zell Linnen analyséiert, fonnt mir datt de Gesamtbetrag vun Mann- L583R ass manner dass d'virstellen Ausdrock ënnert de selwechte Bedingungen, iwwerdeems kennen E185V an S232C, behalen normal Niveauen (Dorënner 3B). Spannen, ass d'Band ze L583R entspriechend am gelies zréckbehalen, wat beweist, datt L583R net fäheg ass op anstänneg alen (Teenie Form vun E-cadherin ass 130 kDa, eeler ass 120 kDa) an Flux cytometry Resultater weisen, datt se manner an der ausgedréckt ass Plasma Membran (Dorënner 3C). VerfÜgung

Wann FAQ maturation klappt, doduurch Toast an Endoplasmic Reticulum (ËH) Reklassement vun Teenie FAQ. Ze testen ob L583R war jo als Teenie zréckbehalen, analyséiert mir wann et an der ER vum Co-immunofluorescence mat der ËH Bewaacher calnexin (Dorënner 4A) zréckbehalen ass, an fonnt dass en Deel vun der L583R Signal ass mat der ËH Bewaacher iwwerlagert, fräi besot ËH ugeet. VerfÜgung

fir ze verstoen wann Déstabiliséierung nogewise ginn hätt kënschtlech VerfÜgung, analyséiert mir d'Stabilitéit vun L583R an der Zell, Evaluéieren hiren Ëmsaz. Mir blockéiert FAQ Synthes mat cycloheximide an fonnt dass L583R geschwënn deforméiert ass, wéi déi vun hiren Reschtoffall Ausdrock geschwënn no 8 h vu FAQ Synthes inhibition évaluéiert, am Géigesaz zu virstellen an den anere mutants datt am selwechten Zoustand nach héich ausgedréckt ginn (Dorënner 4B) , ass dass L583R besot an der Zell onbestänneg. D'Präsenz vun Teenie Band zu virstellen oder Mann- E-cadherin Echantillon (erop Band, Dorënner 4B) ass wéinst dem deene FAQ aus flüchteg transfection doraus. VerfÜgung

onbestänneg oder misfolded Proteinen sinn rigoréis vun Protein Qualitéitskontroll Mechanismen reglementéiert dass d'Zell schützen duerch nei Wierderbuch matt Proteinen fir ofgeschnidden an der proteasome Dréi [34]. Fir Adress wann dat de Fall fir L583R ass, inhibited mir de proteasome Aktivitéit mat MG132 an observéiert, datt, trotz de verschiddene initial Niveau vun E-cadherin, ass den Ausdrock vun Mann- L583R komplett op Behandlung restauréiert (Dorënner 4C), wat beweist, datt et fréi duerch d'proteasome der Synthes deforméiert, wéi virdrun fir aner juxtamembranar HDGC-verbonne E-cadherin kennen [35] beschriwwen. Spannen, wann proteasome ofgeschnidden inhibited ass, et ass eng Fro déi honnerte vu Teenie E-CAD an all Zell Linnen, an d'Regulatioun vun nei Wierderbuch E-CAD d'Wichtegkeet vun der proteasome manifesting, onofhängeg vun oder net mutated ginn. VerfÜgung

zu silico VerfÜgung Prognosen> weider ze validéieren, mir der phenotype vun engem nees destabiliséiert stattfannen vun Pinguin ass eng strukturell toleréiert Verfall vun der selwechter Positioun vun der Mann- Form vun e-cadherin analyséiert. Benotzt FoldX, mer den Impakt vun all méiglech Verfall vun Positioun 583 an hunn ausgerechent, datt d'Aménagement manner Déstabiliséierung Pinguin war L583I (ΔΔG = 0,56 kcal /mol, wéi virausgesot mat der Maus Modell, Table S3). Spannen, datt dës stattfannen de Kondom Funktioun vun E-cadherin geplatzt kompakt Zell Bodrum (Dorënner 4D), an ass net destabiliséiert kënschtlech VerfÜgung, cicloheximide Resistenz ähnlecher zu der virstellen Form suer- (Dorënner 4E). Dës Resultater opweises d'Zouverlässegkeet vun der zu silico VerfÜgung baséiert Prognosen vun E-cadherin Stabilitéit an der kloer Associatioun vun E-cadherin Déstabiliséierung mat Verloscht vun Kondom Funktioun. VerfÜgung

Diskussioun VerfÜgung

E-cadherin hire Restaurant (kennen, geläscht a methylation) sinn der nëmmen unerkannt genetesch Ursaach vun HDGC [36], [37], [38]. Déi meescht kennen HDGC identifizéiert ginn vun der lächerlech Typ, mee e groussen Deel (20%) vun germline kennen ginn Lut ze Single aminoacid Auswiesselungen, vun deenen der pathogenicity schwiereg ass ze diskutéieren an ass oft ongeklärten [39], [40]. Déi wichtegst Informatiounen zu Conditioune vun genetesch Berodung vun germline missense stattfannen wwerreeche ass familial Medeziner Informatiounen (Segregatioun Analyse, meeschtens) mee dës Informatioun ass oft knapp mat der Gréisst vun der Rassekaz allgemeng ze kleng ginn Segregatioun Studien ze erlaben, an d'pathogenicity Foussgänger normalerweis hirkommen Zell-baséiert kënschtlech VerfÜgung funktionell assays [15], [17], déi Zäit sinn opwänneg an technesch Ufuerderunge stellt, an si dofir net iwwerall applicabel zu Iddi molekulare Laboe. Demno, et ass e Besoin fir nei Methoden déi pathogenicity vun E-cadherin missense Projet'en ze HDGC [40] verbonne ze bestëmmen.

• PLOS NËMMEN: Integration vun DNA Copy Number hire Restaurant an Transcriptional Expression Analys zu de Mënscherechter Gastric Cancer
• PLOS NËMMEN: Milk fermentéiert vun Propionibacterium freudenreichii Induces Apoptosis vun HGT-1 Mënscherechter Gastric Cancer Cells