PLoS ONE: E-Cadherin Destabilization Accounts für die Pathogenität von Missense-Mutationen bei hereditärer Diffuse Magenkrebs

Abstrakt

E-Cadherin ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der Gewebearchitektur aufgrund seiner Rolle bei der Zell-Zell-Adhäsion. E-Cadherin-Mutationen sind die genetische Ursache für erbliche Diffuse Magenkrebs (HDGC) und Missense-Mutationen stellen eine klinische Belastung, aufgrund der Unsicherheit ihrer pathogene Rolle. In vitro und in vivo, führen die meisten Mutationen zu loss-of-function, obwohl das ursächliche Faktor für die meisten unbekannt ist. Wir vermuten, dass die Destabilisierung für die Pathogenität von E-cadherin Missense-Mutationen in HDGC erklären könnte, und getestet unserer Hypothese in silico unter Verwendung von in vitro und Werkzeugen. FoldX Algorithmus verwendet, um die Wirkung jeder Mutation in E-Cadherin nativen Zustand Stabilität zu berechnen, und die Analyse wurde mit evolutionäre Konservierung, ergänzt durch SIFT. Interessanterweise HDGC Patienten Keimbahn-E-Cadherin zu destabilisieren Mutanten präsentieren ein jüngeres Alter bei der Diagnose oder Tod beherbergen, was darauf hindeutet, dass der Verlust von nativer Zustand Stabilität von E-Cadherin-Konten für die Krankheits-Phänotyp. Um die biologische Relevanz von E-Cadherin Destabilisierung in HDGC aufzuklären, untersuchten wir eine Gruppe von neu identifizierten HDGC-assoziierte Mutationen (E185V, S232C und L583R), von denen vorhergesagt wird L583R destabilisierend sein. Wir zeigen, daß diese Mutation in vitro nicht funktionsfähig ist, weist kürzere Halbwertszeit und ist nicht in der Lage, um zu reifen, durch vorzeitige Proteasom-abhängigen Abbau, einem Phänotyp durch die Stabilisierung mit der künstlichen Mutation L583I zurückgesetzt (strukturell toleriert). Hier berichten wir über E-cadherin Strukturmodelle geeignet, die Auswirkungen der meisten Krebs assoziiertes Missense-Mutationen vorauszusagen, und wir zeigen, dass E-Cadherin Destabilisierung loss-of-function führt in vitro und erhöhte Pathogenität in vivo.

Citation: Simões-Correia J, Figueiredo J, Lopes R, Stricher F, Oliveira C, Serrano L, et al. (2012) E-Cadherin Destabilisierung Accounts für die Pathogenität von Missense-Mutationen bei hereditärer Diffuse Magenkrebs. PLoS ONE 7 (3): e33783. doi: 10.1371 /journal.pone.0033783

Editor: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japan

Empfangen: 9. November 2011; Akzeptiert: 17. Februar 2012 um; Veröffentlicht: 21. März 2012

Copyright: © 2012 Simões-Correia et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Diese Arbeit von Fundação para a Ciência e Tecnologia, Portugal (PTDC /SAU-OBD /64319/2006, PTDC /SAU-OBD /104017/2008, SFRH /BPD /48765/2008) unterstützt wurde, EMBO (kurzfristige Gemeinschaft ASTF 60- 2009) und EU-Förderung Perspektiven (HEALTH-F4-2008-201648). Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

E-Cadherin ist ein Zell-Zell-Adhäsion Glykoprotein aus fünf extrazellulären Cadherin-Typ-Wiederholungen, eine Transmembranregion und einer hochkonservierten cytoplasmatischen Schwanz [1], [2]. E-Cadherin ist in erster Linie in Epithelzellen exprimiert und ist die Hauptkomponente von Adhärenzverbindungen (AJ). Diese junctions Cluster über homophile Wechselwirkungen, durch die extrazellulären Domänen von Calcium-abhängigen E-Cadherin-Moleküle auf der Oberfläche von homotypischen Nachbarzellen.

Die Rolle der E-Cadherin bei der Tumorentwicklung ist gut beschrieben, und ihre Verlust der Expression ist ein Markenzeichen in Karzinomen [3]. Experimentelle Beweise unterstützt eine Rolle für die E-Cadherin-Komplexes sowohl bei der Unterdrückung der Invasion und Metastasenbildung [4]. Verlust der E-Cadherin-Expression durch Insertionen verursachte genetische Ereignisse wie Spleißstelle und truncation Mutationen, Deletionen und Nonsense-Mutationen, zusätzlich zu Missense-Mutationen [5] häufig verbunden. In sporadischen diffuse Magenkrebs, Veränderungen in dem Gen, kodierend E-Cadherin (CDH1) werden bevorzugt in den Exons 7 bis 9 [5], während in lobular Mammakarzinome sie sind entlang des Gens, ohne Vorzugs Hotspot verteilt gefunden [6]. Missense-Mutationen in diesen beiden Arten von sporadischen Krebs und auch in Synovialsarkomen [7].

Familiäre Aggregation von Diffuse Magenkrebs (DGC) entspricht 10% der Fälle von Magenkrebs (GC) gefunden, und nur 1-3% sind erblich [8]. Aus diesen familiären Fällen wird hereditäre Diffuse Magenkrebs (HDGC) nach strengen Kriterien definiert, die von der International Gastric Cancer Linkage Consortium (IGCLC) im Jahr 1999 festgelegt wurden: (1) zwei oder mehr dokumentierte Fälle von diffusem Magenkrebs in der ersten /zweiten Grades mindestens einen Verwandten, mit diagnostiziert vor dem Alter von 50; oder (2) drei oder mehr Fälle von dokumentiert diffuse Magenkrebs in der ersten /zweiten Grades, unabhängig vom Alter. Früh einsetzende Diffuse Magenkrebs (EODGC) betrachtet wird, wenn ein isoliertes Individuum mit DGC mit weniger als 45 Jahren diagnostiziert wird. Keimbahn-Mutationen CDH1 sind in 30% der Fälle gefunden HDGC [9]. Der Verband der CDH1 Mutationen und familiäre Magenkrebs wurde zuerst von Guilford et al
1998 [10] und seitdem viele Studien berichteten verschiedene Arten von CDH1 Mutationen in HDGC [11], [12], [13 ]. Unter allen berichteten CDH1
Keimbahnmutationen, 77,9% sind Unsinn, Spleißstellen und Frameshift-Mutationen (vorhergesagt zu einem vorzeitigen Abbruch Codons erzeugen) und 22,1% sind Missense-Mutationen [9]. Mutationen, die PTC erzeugen sind in der Regel schädlich sind die Patienten, die hohe Risikoträger betrachtet, und es wird empfohlen prophylaktische Gastrektomie zu haben [14]. Die Pathogenität von Missense-Mutationen ist nicht einfach, und diese Veränderungen werden häufig als nicht klassifizierte Sequenzvarianten (USVs) aufgrund des Fehlens von strengen Kriterien bezeichnet ihre Wirkung zu bewerten. Mehrere Parameter wurden für die Klassifizierung von E-Cadherin USVs in HDGC berücksichtigt: 1) Co-Segregation der Mutation mit DGC (innerhalb Abstammungen); 2) Mutationsfrequenz in der gesunden Kontrollpopulation; 3) Mutation Wiederholung (in unabhängigen Familien). Segregationsanalyse ist oft unmöglich, mit einer kleinen Anzahl von betroffenen Fällen für molekulare Diagnostik [15], und das Fehlen von klinischen Informationen ist ein limitierender Schritt, die pathogene Bedeutung dieser Mutationen zu schließen. Um diese Einschränkung zu umgehen, haben wir zuvor entwickelten in vitro funktionelle Assays
die funktionelle Wirkung der E-Cadherin-Keimbahn-Missense-Mutationen [16], [17] zu bewerten. Jedoch implizieren solche Studien lab spezifischen experimentellen Bedingungen, nämlich Zellbiologie Assays, und sie sind zeitaufwendig in der Routine zu verwenden. In silico
Prognosen sind zuverlässige und schnelle Analyse, dass man die Auswirkungen von Punktmutationen zur Vorhersage verwenden können, vor allem, wenn Strukturinformationen [18] ist, [19].

In dieser Arbeit, erforschten wir das Potenzial der strukturbasierten in silico
Prognosen der Auswirkungen von E-Cadherin Missense-Mutationen in erbliche und sporadische Krebs gefunden zu bewerten. Unsere Analyse basiert auf der Berechnung von nativen Zustand Stabilitätsänderungen durch jede Variante induziert (ΔΔG = &Dgr; G _{WT-Δ G Mut), durch das Protein Design FoldX Algorithmus erhalten [20], [21]. Interessanterweise ist die Gruppe von Patienten beherbergen zu destabilisieren Mutationen (ΔΔG > 0,8 kcal /mol) von einem jüngeren Alter bei der Diagnose oder der Tod durch DGC gekennzeichnet, was darauf hindeutet, dass der Verlust von E-Cadherin nativen Zustand Stabilität des Krankheits-Phänotyp beiträgt. Verwendung eines zellulären Modell analysierten wir den Phänotyp von E-Cadherin-Destabilisierung und fand, daß, wenn eine Mutation induziert verringert nativer Zustand Stabilität, E-cadherin vorzeitig durch das Proteasom abgebaut wird, weist kürzere Halbwertszeit, was zu einem Verlust der Klebe Funktion. Insgesamt unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine Destabilisierung für die Pathogenität von E-Cadherin Missense-Mutationen in HDGC gefunden Konten.}

Materialien und Methoden

Sammlung von E-Cadherin Sequenzvarianten und PDBs

E-Cadherin-Varianten HDGC oder EODGC assoziiert wurden aus der Literatur gesammelt und somatischen Varianten wurden aus dem Katalog der somatische Mutationen in Krebs (COSMIC) Datenbank (http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/gesammelt kosmische /). Drei neue E-Cadherin Sequenzvarianten, wo in unserem Labor für die funktionelle Analyse berichtet: E185V, S232C und L583R. Vor kurzem wurde berichtet L583R, mit funktionellen Daten assoziiert [22].

E-Cadherin-bezogene PDBs wurden mit Hilfe der automatischen Suche mit Schweizer Model Repository identifiziert (http://swissmodel.expasy.org). Sequenz-Alignment der humanen E-Cadherin und jede der Sequenzen, die für die verschiedenen Modelle verwendet wurde durchgeführt, mit M-Kaffee [23], [24] (http://tcoffee.crg.cat/apps/tcoffee/play?name=mcoffee ). Die Bilder wurden mit Pymol vorbereitet. Nach der Analyse-Sequenz und strukturelle Homologie wurden drei PDBs ausgewählt als Modelle zu verwenden. Xenopus C-Cadherin Ektodomäne (PDB 1L3W), Maus-E-Cadherin Prodomäne (PDB 1OP4) und die Maus β-Catenin in Wechselwirkung Domäne (PDB 1I7X)

FoldX Berechnungen und Analysen
SIFT

Mit FoldX (http://foldx.crg.es/) Befehl Buildmodel
bauten wir drei verschiedene Modelle (Prodomäne, extrazelluläre und zytoplasmatische); die drei Strukturen wurden durch Substitution eines jeden einzelnen Aminosäuren humanisiert. Die resultierende Struktur optimiert wurde mit dem Befehl RepairPDB
und die Energien, wo mit Stabilität
analysiert oder AnalyseComplex
Befehle. Die krankheitsassoziierten Mutationen wurden in fünf Läufen mit dem Buildmodel
Befehl, jede Mutation wiederholt erzeugt. Die Energien sind eine automatische Ausgabe in FoldX, und die einheimischen Zustand Stabilität Veränderung, ΔΔG, zwischen WT und Mutante (ΔΔG = &Dgr; G _{WT-Δ G Mut) ist auch in einer separaten Datei erzeugt, mit dem entsprechenden Standard Abweichungen und alle energetischen Strafen jede Mutation verbunden. Nur Mutationen mit ΔΔG > 0,8 kcal /mol wurden schädlich betrachtet}

Wir haben SIFT (http://sift.jcvi.org/, Intolerant Sortierung Von Tolerant), um die Erhaltung der einzelnen Aminosäuresubstitution zu bewerten, wie zuvor. die Blink-Funktion von GI beschrieben [25], mit:. 31073. Nur Mutationen, die mit einem Wert unter 0,05 wurden als intolerant zu sein

prop (http://www.cbs.dtu.dk/services /prop /) [26] wurde verwendet, um Mutationen zu bewerten, ob eine Wirkung auf Prodomäne Spaltung haben könnte.

Zellkultur und Transfektionen

E-Cadherin WT cDNA in plRES2-EGFP-Vektor kloniert wurde nach zur Herstellung von Anweisungen (Clontech, Takara Bio) und Mutationen E185V, S232C, L583R und L583I hE-Cadherin durch ortsgerichtete Mutagenese, wie zuvor beschrieben induziert wurden [27]. Der leere Vektor (Mock) wurde als Kontrolle verwendet

CHO (Chinese Hamster Ovary) Zellen (ATCC-Nummer: CCL-61). Wurden in Alfa-MEM-Medium (Gibco, Invitrogen), ergänzt mit 10% fötalem Rinder gewachsen Serum (FBS; Gibco, Invitrogen) und 1% Penicillin-Streptomycin (Gibco, Invitrogen). Zellen wurden für Kontamination durch Mycoplasmen imunofluorescence mit DAPI sporadisch ausgewertet. Zellen wurden mit 1 ug eines jeden der Vektoren, die die verschiedenen Formen von E-Cadherin (WT, E185V, S232C, L583R und L583I) unter Verwendung von Lipofectamine 2000 (Invitrogen) codiert, transfiziert sind, gemäß dem Herstellungsverfahren. Für eine stabile Zelllinie Einrichtung wurden die Zellen durch Antibiotika-Resistenz auf 5 ug /ml Blasticidin (Gibco, Invitrogen) ausgewählt. Alle Zellinien wurden in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO _{2 bei 37 ° C gehalten}

funktionelle Assays

Transient transfizierte CHO (Chinese Hamster Ovary) Zellen (ATCC Nr. CCL -61) wurden einer citometry fließen, GFP Fluoreszenzmessung verwendet, die Transfektionseffizienz vor jedem Experiment zu bewerten. Für die langsame Aggregationsassay, Wells von 96-Well-Platten wurden mit 50 &mgr; l Agar-Lösung (100 mg Bacto-Agar in 15 ml sterilem PBS) beschichtet. Die Zellen wurden mit Trypsin und suspendiert in einem Kulturmedium abgelöst. Eine Suspension von 1 x 10 ^{5 Zellen /ml wurde hergestellt und 2 x 10 4 Zellen wurden in jede Vertiefung ausgesät. Die Platte wurde bei 37 ° C in einer befeuchteten Kammer mit 5% CO _{2 für 48 h inkubiert. Die Aggregation wurde in einem umgekehrten Mikroskop (4-fache Vergrößerung) und fotografiert mit einer Digitalkamera ausgewertet.}}

Western Blotting

Zelllysate wurden mit Catenin Lysepuffer (1% Triton X-100, 1 erhaltenen % Nonidet P-40 in PBS), ergänzt mit Protease-Inhibitor-Cocktail (Roche) und Phosphatase-Inhibitor-Cocktail (Sigma). Proteinquantifizierung wurde nach einem modifizierten Bradford-Assay (Bio-Rad) durchgeführt. Für jede Probe wurden 25 ug Protein beladen, in 7,5% SDS-PAGE aufgetrennt und durch Elektroblotting auf Nitrocellulose-Membran (GE Healthcare Life Sciences). Die Membranen wurden mit 5% fettfreier Trockenmilch und 0,5% Tween-20 in PBS blockiert. Immunoblotting wurde mit Antikörpern gegen E-Cadherin durchgeführt (1:1000; BD Biosciences), Actin (1:1000; Santa Cruz Biotechnology) und α-Tubulin (1:10000; Sigma). Schaf anti-Maus (GE Healthcare Life Sciences) oder Esel anti-Ziege (Santa Cruz Biotechnology) wurden als sekundäre Antikörper, gefolgt von ECL-Detektion (GE Healthcare Life Sciences) verwendet. Immunoblots wurden in Quantity One Software (Bio-Rad) quantifiziert.

Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS)

Zellen zu einer konfluenten Monolayer gezüchtet wurden, freistehend mit Versene (Gibco, Invitrogen) und in eiskaltem PBS mit 0,05 mg /ml CaCl resuspendiert _{2. Eine Suspension von 5 x 10 ^{5 Zellen für 5 Minuten bei 1500 rpm 4 ° C und gewaschen in PBS mit 0,05 mg /ml CaCl 2 3% BSA zentrifugiert. Die Zellen wurden für 60 Minuten mit einem primären Antikörper, der gegen E-Cadherin, HECD1 (Zymed Laboratories) bei 1:100 Verdünnung inkubiert. Die Zellen wurden zweimal und dann inkubiert mit anti-Maus-biotinyliertem (Dako) bei 1:100 Verdünnungs gewaschen. Die Zellen wurden zweimal und dann inkubiert mit Streptavidin PE-Cy5 (BD Pharmingen) bei Verdünnung von 1:40 gewaschen. Schließlich wurden die Zellen gewaschen, in 500 ul PBS resuspendiert und 50000 Zellen wurden in einem Durchflußzytometer (Coulter Epics XL-MCL) analysiert. Die Daten wurden mit WinMDI Software analysiert.}}

Immunfluoreszenzfärbung

Für die Immunfluoreszenzmikroskopie und wurden die Zellen auf Glasplättchen und gewachsen zu etwa 80% Konfluenz, fixiert in eiskaltem Methanol für 15 Minuten, 2 mal mit PBS gewaschen und mit primärem Antikörper inkubiert, verdünnt in PBS 5% BSA, für 60 Minuten bei Raumtemperatur. Primäre Antikörper verwendet: Maus monoklonalen Anti-E-Cadherin (BD Biosciences); Kaninchen-Anti-Calnexin (Stressgen). Sekundäre Antikörper verwendet: Alexa Fluor 488-Anti-Maus (1:500; Invitrogen); Alexa Fluor 594-Anti-Kaninchen (1:500; Invitrogen). Die Deckgläser wurden auf Glasobjektträger aufgebracht, mit Vectashield mit DAPI für nukleare Detektion (Vector Laboratories). Die Bildaufnahme wurde auf Carl Zeiss Apotome Axiovert 200 M Fluoreszenzmikroskop unter Verwendung von 40 × Ziele durchgeführt. Die Bilder wurden mit Axiocam HRm Kamera und verarbeitet werden durch Software AxioVison Version 4.8 erworben.

Zellbehandlungen

Für die Proteinsynthese-Hemmung wurden die Zellen mit 25 &mgr; M Cycloheximid behandelt 8 h und 16 h, und die Menge der gesamten E-Cadherin wurde von WB analysiert, wie zuvor beschrieben. Für den Proteasomen-Hemmtest wurden die Zellen in Platten mit 6 Vertiefungen ausgesät, bis etwa 80% Konfluenz wachsen gelassen und für 16 h mit 10 uM MG132 (Calbiochem) inkubiert. Die Zelllysate wurden durch WB analysiert, wie zuvor beschrieben.

Ergebnisse

• PLoS ONE: Integration von DNA-Kopienzahl Änderungen und Transkriptions-Expressionsanalyse in menschlichen Magen Cancer
• PLoS ONE: fermentierter Milch von Propionibacterium freudenreichil induziert Apoptose von HGT-1 Human Magenkrebs Cells