PLoS One: E-Cadherint destabilizációja számlák a patogenitását missense mutáció örökletes diffúz Gyomor Cancer

absztrakt katalógusa

E-cadherin kritikus fenntartásához szövet építészet betöltött szerepe miatt a sejt-sejt adhézió. E-cadherin mutációk genetikai oka Örökletes diffúz gyomorkarcinóma (HDGC) és missense mutáció jelent klinikai terhet, mivel a bizonytalanság patogén szerepet. In vitro és in vivo körülmények között, a legtöbb mutáció elvesztéséhez vezethet-of-funkció, bár az ok-okozati tényező ismeretlen a többség. Feltételeztük, hogy a destabilizáció is kitehetik a patogenitás az E-cadherin missense mutációt HDGC, és teszteltük a hipotézist használva in silico és in vitro eszközöket. FoldX algoritmust kiszámításához használt hatását az egyes mutációk az E-cadherin natív állapot stabilitását, és az elemzést egészítette evolúciós megőrizzék, SZITÁL. Érdekes, HDGC hordozó betegeknél csíravonal E-cadherin destabilizáló mutánsok be a fiatalabb életkor a diagnózis vagy a halál, ami arra utal, hogy a veszteség a natív állapot stabilitását E-cadherin beszámolóját a betegség fenotípus. Hogy világosabb biológiai jelentőségének E-cadherin destabilizálja HDGC azt vizsgáltuk, egy csoport újonnan azonosított HDGC összefüggő mutációt (E185V, S232C és L583R), amelynek L583R az előrejelzések szerint destabilizáló. Megmutatjuk, hogy ez a mutáció nem működik az in vitro, mutat rövidebb felezési és nem tudja, hogy érett, mivel a korai proteaszóma-függő degradáció, a fenotípus visszatért stabilizálás a mesterséges mutációval L583I (szerkezetileg tolerálható). A leírásban beszámolunk az E-cadherin szerkezeti modellek alkalmasak megjósolni a hatását a legtöbb rákhoz kapcsolódó missense mutáció, és azt mutatják, hogy az E-cadherin destabilizáció vezet elvesztése-of-function in vitro és fokozott mértékű patogenitásának in vivo.

bevezető hivatkozás: Simões-Correia J, Figueiredo J., Lopes R, Stricher F, Oliveira C Serrano L, et al. (2012) E-Cadherint destabilizációja számlák a patogenitását missense mutáció örökletes diffúz gyomorrákban. PLoS ONE 7 (3): e33783. doi: 10,1371 /journal.pone.0033783 katalógusa

Szerkesztő: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japán katalógusa

Beérkezett: november 9, 2011; Elfogadva: február 17, 2012; Megjelent: március 21, 2012 katalógusa

Copyright: © 2012 Simões-Correia et al. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra. Katalógusa

Forrás: Ez a munka támogatott Fundacao para a Ciência e Tecnologia, Portugália (PTDC /Sau-OBD /64319/2006, PTDC /Sau-OBD /104017/2008, SFRH /BPD /48765/2008), EMBO (rövid távú ösztöndíj ASTF 60- 2009) és az EU támogatási kilátásai (EGÉSZSÉGÜGYI F4-2008-201648). A finanszírozók nem volt szerepe a tanulmány tervezés, adatgyűjtés és elemzés, döntés, hogy közzéteszi, vagy a készítmény a kézirat. Katalógusa

Érdekütközés: A szerzők kijelentették, hogy nem ellentétes érdekek léteznek. Katalógusa

Bevezető

E-cadherin egy olyan sejt-sejt adhézió glikoprotein áll öt extracelluláris cadherin-típusú ismétlődik, egy transzmembrán régió és egy erősen konzervált citoplazmatikus farok [1], [2]. E-cadherin expresszálódik elsősorban epiteliális sejtek és ez a fő komponense adherens kereszteződéseket (AJ). Ezek a csomópontok klaszter, via homofil kölcsönhatások révén az extracelluláris doménjei kalcium-függő E-cadherin molekulák felszínén homotípusos szomszéd sejteken.

A szerepe az e-cadherin tumor fejlődése jól leírható, és annak expressziójának elvesztése fémjelzi a carcinoma [3]. A kísérleti bizonyíték alátámasztja szerepet az E-cadherin komplex mind elnyomja invázió és metasztázis kialakulását. [4] Elvesztése E-cadherin expresszió gyakran társul a genetikai eseményeket, mint illesztési hely és a csonkolást mutációk által okozott inszerciókat, deléciókat és nonszensz mutációk mellett, a missense mutáció [5]. Sporadikus diffúz gyomorrák, módosított kódoló gén E-cadherin (Cdh1) találhatók Előnyben részesített exonok 7-9 [5], míg lobularis emlőrákok vannak szétterjedhetnek a gén, nem preferenciális hotspot [6]. Missense mutáció találhatók a két típusú sporadikus rák, valamint a synovialis sarcomák [7].

családi halmozódás diffúz gyomorkarcinóma (DGC) 10% -át képviseli az esetek gyomorrák (GC), és csak a 1-3% örökletes [8]. Ezekből familiáris esetekben, örökletes diffúz gyomorkarcinóma (HDGC) által meghatározott szigorú feltételek szerint határozza meg a Nemzetközi gyomorkarcinóma rudazat Consortium (IGCLC) 1999-ben: (1) két vagy több esetet dokumentáltak diffúz gyomorrák első /második fokozat rokonok, legalább egy diagnosztizálták éves kora előtt 50; vagy (2) három vagy több esetben dokumentált diffúz gyomorrák első /második rokonok, függetlenül az életkortól. Korai kezdetű diffúz gyomorkarcinóma (EODGC) tartják, ha egy elszigetelt egyéni diagnosztizálnak DGC kevesebb, mint 45 éves. Csíravonal Cdh1 mutációk találhatók a 30% -át HDGC esetben [9]. Az egyesület Cdh1 mutációk és familiáris gyomorrák először írta le Guilford és munkatársai katalógusa 1998-ban [10], és azóta számos tanulmány számolt be különböző típusú Cdh1 mutációk HDGC [11], [12], [13 ]. Között jelentett Cdh1 katalógusa csírasejt-mutáció, 77,9% értelmetlen, splice-site és frameshift mutáció (az előrejelzések szerint termelni idő előtti megszűnése kodon) és 22,1% -a missense mutáció [9]. Mutációk generáló PTC általában káros, a betegek tartják nagy kockázatot hordozó és tanácsos, hogy a profilaktikus teljes gastrectomián [14]. Patogenitását missense mutáció nem egyszerű, és ezek a változások gyakran nevezik a Unclassified szekvencia variánsok (USVs) hiánya miatt a szigorú kritériumok értékelésére hatásukat. Számos paramétereket figyelembe venni a besorolás E-cadherin USVs a HDGC: 1) co-szegregációs a mutációt DGC (belül családfa); 2) mutációs gyakoriság az egészséges kontroll populáció; 3) mutáció kiújulás (független családok). A szegregációs analízist gyakran lehetetlen, kis számú érintett esetek álló molekuláris diagnosztika [15], és hiányoznak a klinikai adatok korlátozó lépés következtetni a kórokozó jelentősége ezeknek a mutációk. Ahhoz, hogy ezt a korlátot már korábban kifejlesztett in vitro katalógusa funkcionális vizsgálatok értékelésére funkcionális hatása E-cadherin csírasejt missense mutáció [16], [17]. Azonban az ilyen vizsgálatok eredményei azt sugallják laboratóriumi specifikus kísérleti körülmények között, nevezetesen sejtbiológia vizsgálatokban, és ezek időigényes használni rutin. In silico katalógusa előrejelzések megbízható és gyors elemzést, hogy lehet használni megjósolni a hatását a pontmutáció, különösen akkor, ha a strukturális információ áll rendelkezésre [18], [19]. Katalógusa

Ebben a munkában, feltártuk a lehetséges szerkezet-alapú in silico katalógusa előrejelzések hatásának értékelésére az E-cadherin missense mutációt találtak örökletes és sporadikus rák. A vizsgálat a számítás alapján a natív állapot stabilitása indukálta változások az egyes variánsok (AAG = ΔG _{WT-ΔG Mut) nyert fehérje tervezési FoldX algoritmus [20], [21]. Érdekes, hogy a csoport a hordozó betegeknél destabilizálja mutációk (AAG > 0,8 kcal /mol) jellemzi fiatalabb korban a diagnózis idején vagy halál által DGC, ami arra utal, hogy a veszteség az E-cadherin natív állapotú stabilitás hozzájárul a betegség fenotípusát. Egy celluláris modell, elemeztük a fenotípus az E-cadherin destabilizáció, és megállapította, hogy amikor egy mutáció indukálja csökkent natív állapot stabilitását, E-cadherin korán lebomlik a proteaszóma mutat, rövidebb felezési, így a veszteség a ragasztó funkció. Összességében, eredményeink arra utalnak, hogy a destabilizáció számlák patogenitását E-cadherin missense mutáció található HDGC. Katalógusa}

Anyagok és módszerek katalógusa

gyűjtemény az E-cadherin szekvencia variánsok és PDBs katalógusa

E-cadherin változatok kapcsolódó HDGC vagy EODGC gyűjtöttünk az irodalomban, mind a szomatikus variánsai gyűjtöttünk katalógusa szomatikus mutációk jelentősége a rákban (KOZMIKUS) adatbázis (http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/kozmikus/). Három új E-cadherin szekvencia variánsok, ahol jelenteni a labor funkcionális elemzés: E185V, S232C és L583R. Nemrégiben L583R számoltak, funkcionális társított adatokat [22]. Katalógusa

E-cadherin kapcsolatos PDBs azonosítottak automatikus kereséssel svájci Model tároló (http://swissmodel.expasy.org). Sequence összehangolása humán E-kadherin és az egyes szekvenciák használt különböző modellek végeztük M-kávé [23], [24] (http://tcoffee.crg.cat/apps/tcoffee/play?name=mcoffee ). Képek készültek Pymol. Elemzése után szekvencia és szerkezeti homológia, három PDBs választottak használni modellek: Xenopus C-cadherin ektodomén (EKT 1L3W), egér E-cadherin prodomén (EKT 1OP4) és az egér β-catenin kölcsönható domén (PDB 1I7X).

FoldX számítások és SZITÁL elemzés katalógusa

Az FoldX (http://foldx.crg.es/) parancs Buildmodel katalógusa építettünk három különböző modell (prodomén, extracelluláris mind a citoplazmatikus); A három struktúrákat humanizált helyettesítésével egyes különböző aminosav. Az eredményül kapott struktúra optimalizáltuk parancs használatával RepairPDB katalógusa és az energiák, ahol elemezték Stabilitás katalógusa vagy AnalyseComplex katalógusa parancsokat. A betegséggel kapcsolatos mutációk jöttek létre a Buildmodel katalógusa parancsot, az egyes mutációk ismételt öt fut. Az energiák automatikus kimenetet FoldX, és a natív állapot stabilitásának változása, AAG, a WT és mutáns (AAG = ΔG _{WT-ΔG Mut) is keletkezik egy külön fájlban, a vonatkozó szabvány eltérések, és az összes energikus büntetéseket társított minden egyes mutációt. Csak mutációk AAG > 0,8 kcal /mol volt ártalmatlan. Katalógusa}

Mi használt SZITÁL (http://sift.jcvi.org/, Válogató intoleráns tól Toleráns), hogy értékelje a védelmi egyes aminosav-cserét, mint korábban leírt [25], a Blink jellemzője GI: 31073. Csak mutációk egy pont alatt 0,05 tekintettük intoleráns. katalógusa

prop (http://www.cbs.dtu.dk/services /prop /) [26] használtuk annak értékelésére, hogy mutációk hatással prodomén hasítás. katalógusa

Sejttenyészetek és transzfekciókra katalógusa

E-cadherin WT cDNS-t a pIRES2-EGFP szerinti vektor a gyártó utasításait (Clontech, Takara Bio), és mutációk E185V, S232C, L583R és L583I HE-cadherin indukált helyspecifikus mutagenezissel a korábban leírtak szerint [27]. Az üres vektor (Mock) használtunk kontrollként.

CHO (kínai hörcsög petefészek) sejtek (ATCC szám: CCL-61) tenyésztettünk Alfa-MEM-tápközegben (Gibco, Invitrogen), kiegészítve 10% magzati borjú (FBS; Gibco, Invitrogen) és 1% penicillin-sztreptomicin (Gibco, Invitrogen). A sejteket szórványosan értékelték mycoplasma szennyeződés imunofluorescence DAPI-val. A sejteket transzfektáltuk 1 ug az egyes vektorok kódoló különböző formái E-cadherin (WT, E185V, S232C, L583R és L583I) Lipofectamine 2000 (Invitrogen) szerint a gyártás eljárást. A stabil sejtvonal létrehozására a sejteket által kiválasztott antibiotikum rezisztencia 5 ug /ml Blasticidin (Gibco, Invitrogen). Az összes sejtvonalat tartottuk nedvesített inkubátorban, 5% CO _{2 37 ° C-on.}

funkcionális vizsgálatok

tranziensen transzfektált CHO (kínai hörcsög petefészek) sejtek (ATCC szám: CCL -61) vetettük alá áramlik citometry segítségével GFP fluoreszcencia mérése, hogy értékelje a transzfekciós hatékonyság minden kísérlet előtt. A lassú aggregációs vizsgálat, kutak 96 lyukú lemez vontunk be 50 ul agar-oldatot (100 mg Bacto-Agar 15 ml steril PBS-ben). A sejteket leválasztottuk tripszinnel, és szuszpendáljuk tápközegben. A szuszpenziót 1 × 10 ^{5 sejt /ml-t készítünk, és 2 × 10 4 sejteket beoltottuk minden lyukban. A lemezt 37 ° C-on nedvesített kamrában, 5% CO _{2 48 órán át. Aggregáció értékeltük egy invertált mikroszkóp (4 × nagyítás) és fényképezett egy digitális fényképezőgép.}}

Western blot

A sejtlizátumokat kaptunk catenin lízis-pufferrel (1% Triton X-100, 1 % Nonidet P-40 PBS-ben), kiegészítve proteáz inhibitor koktél (Roche) és a foszfatáz inhibitor koktél (Sigma). A fehérje mennyiségi meghatározását végeztük egy módosított Bradford vizsgálati eljárás (Bio-Rad). Minden egyes minta esetében, 25 ng fehérjét vittünk, elválasztottuk, 7,5% SDS-PAGE, és elektroblottolással nitrocellulóz-membránra (GE Healthcare Life Sciences). A membránokat blokkoltuk 5% zsírmentes száraz tej és 0,5% Tween-20 PBS-ben. Immunblot analízist végeztünk elleni antitestekkel E-kadherin (1:1000; BD Biosciences), aktin (1:1000; Santa Cruz Biotechnology), és α-tubulin (1:10000; Sigma). Juh anti-egér (GE Healthcare Life Sciences), vagy szamár anti-kecske (Santa Cruz Biotechnology) alkalmaztunk másodlagos antitestekkel, majd ECL detektálás (GE Healthcare Life Sciences). Az immun-blot számszerűsített Quantity One szoftverrel (Bio-Rad).

fluoreszcenciával aktivált sejt (FACS)

A sejteket egybefolyó egyrétegű, levált Versene (Gibco, Invitrogen) és reszuszpendáljuk jéghideg PBS-ben 0,05 mg /ml CaCI _{2. A szuszpenziót 5 × 10 ^{5 sejt centrifugáltuk 5 percen át 1500 fordulat, 4 ° C-on, és mostuk PBS-ben 0,05 mg /ml CaCI 2 3% BSA-t. A sejteket 60 percig inkubáljuk egy primer antitest elleni E-kadherin, HECD1 (Zymed Laboratories) 1:100 hígításban. A sejteket kétszer mostuk, majd inkubáljuk anti-egér biotinilált (Dako) ba 1:100 hígításban. A sejteket kétszer mostuk, majd inkubáljuk streptavidin PE-CY5 (BD Pharmingen) at 1:40 hígításban. Végül, a sejteket mostuk, újraszuszpendáltuk 500 | il PBS-ben, és a 50000 sejteket vizsgáltuk áramlási citométerrel (Coulter EPICS XL-MCL). Az adatokat elemeztük WinMDI szoftver.}}

immunfluoreszcens festéssel

immunfluoreszcens és mikroszkópia, sejteket oltottunk üveg fedőlemezen és növesztjük körülbelül 80% -os összefolyásig, rögzített jéghideg metanollal 15 percig, mossuk 2-szer PBS-sel, és primer antitesttel inkubáltuk, PBS-ben 5% BSA-t, 60 percig, szobahőmérsékleten. A primer antitesteket használtuk: egér monoklonális anti-E-cadherin (BD Biosciences); nyúl anti-calnexin (Stressgen). Másodlagos antitestek használhatók: Alexa Fluor 488 anti-egér (1:500; Invitrogen); Alexa Fluor 594 antinyúl (1:500; Invitrogen). A fedőlemezeket üveg tárgylemezekre használva Vectashield DAPI-val a nukleáris kimutatására (Vector Laboratories). Képalkotás végeztünk Carl Zeiss Apotome Axiovert 200 M fluoreszcens mikroszkópban 40 × célkitűzéseket. A képeket szerzett Axiocam HRM kamera és feldolgozott szoftver Axiovison verzió 4.8.

Cell Kezelések

a fehérje szintézis gátlása, sejteket kezeltünk 25 jiM cikloheximid 8 órán és 16 óra, és az összeget a teljes E-cadherin analizáltuk WB korábban leírtak szerint. A proteaszóma gátlása vizsgálathoz a sejteket szélesztettünk 6 lyukú lemezekre,, növesztjük körülbelül 80% összefolyás, és 16 órát inkubáljuk 10 nM MG132 (Calbiochem). A sejtlizátumokat analizáltuk WB korábban leírtak szerint.

Eredmények

1. E-cadherin szerkezeti modellek katalógusa

Van néhány ember az E-cadherin (HE-cad) rendszerekkel rendelkeznek, és ők csak azokra kis adagokban a fehérje (táblázat S1). Automatikus keresés segítségével a svájci modell Repository, azt találtuk, hogy az EKT 1L3W, jegyzetekkel a teljes hosszúságú extracelluláris domén Xenopus EP-cadherin (EP-cad), nagymértékben homológ ugyanabban a tartományban az emberi E-cadherin. Elemeztük homológiát illesztése a M-kávé, egy többszörös szekvencia illesztés, amely egyesíti a termelés több többszörös szekvencia illesztéssel csomag (PCMA, Poa, Mafft, Izom, T-Coffee, ClustalW ProbCons, DialignTX) [23], [24 ]. Az 1A mutatja az összehangolás a két extracelluláris domén szekvenciákat. A vörös téglából régiók a tökéletes egyetértés alakult ki az alkalmazott módszereket, ami nagyon hasonló szekvenciákat. Ki kell építeni a szerkezetet, levettük régiókban nem mutat hasonlóságot (1A, csillag), és korlátozta a modell régiók megbízható összehangolás (fekete nyíl, 1A). Xenopus szerkezet humanizált volt leírtak Anyag és módszer és 1B ábra szerkezeti összehangolás HE-cad EC1-EC2 domének (az EKT 2O72) és EC1-EC2 domének a Xenopus származó strukturális modell. A két szerkezet szinte egymásra, jelezve, hogy a közötti hasonlóság extracelluláris doménjei humán E-kadherin és Xenopus EP-cadherin nem csak a szekvencia szinten, hanem a strukturális szinten. A modell felépítése humán E-cad mutat kompatibilis energiákat a szerkezet Xenopus, enyhe csökkenés a szabad energia (ΔG) kapott a modell (ΔG _{valódi = 559,99 kcal /mol és ΔG model = 531,77 kcal /mol), jelezve, hogy a humanizálás nem vezet be extra összecsapások. Nemrégiben egy szerkezet az egér extracelluláris domén-ben megjelent (EKT 3Q2V táblázat S1), és mi is ezt a struktúrát, mint egy modell, mint a módja, hogy finomítsa a kapott eredmények Xenopusban modell. Katalógusa}

Megállapítottuk két másik modell, amely a prodomén (EKT 1OP4, egér N-cadherin) és a β-catenin citoplazmatikus domén (EKT 1I7X, egér E-cadherin), ugyanazzal a módszerrel. Összességében a három modell kiterjed a legtöbb fehérje szerkezetének (1C): prodomén modell lefedi pozíciók 28-117, az extracelluláris modellek pozícionálja 155-697 és a β-catenin citoplazmatikus domén kiterjed 782-838. Szintjén a juxtamembrán domain, egyetlen struktúra kiegészítések, amely a érintkezési felület között E-cadherin és P120 [28]. Ez a struktúra egy kis, 18 aminosav hosszúságú peptid (amely pozíciók 756-773 on HE-cad), nagyon alacsony szerkezeti tartalmat, tényezők, melyek csökkentik a megbízhatóságot az energia számítások, ezért elvetették ezt a struktúrát az elemzésből. Katalógusa

2. In silico katalógusa előrejelzése hatásának rákhoz kapcsolódó E-cadherin USVs katalógusa

E-cadherin mutációk nem csak a genetikai oka HDGC, de ők is gyakran megtalálható a különböző típusú sporadikus rák. Elemeztük in silico katalógusa hatása a daganatos betegségek okozta E-cadherin missense mutáció hogy lokalizálja a hatálya alá tartozó régiókban a strukturális modell által generált: 22 csírasejt-mutáció található a beállításait HDGC és EODGC és 57 talált szórványos rák. Csíravonaí E-cadherin USVs gyűjtöttünk az irodalomban, és néhány személyes kommunikáció a mi labor. Néhány HDGC /EODGC mutációk nem lehet modellezni, hiánya miatt a szerkezeti információt (például azok, lokalizált a juxtamembrán domain E-cadherin), és nem szerepelnek az elemzésben. Szomatikus mutációk gyűjtöttünk a Cancer Genome Project adatbázis, és tartalmaznak mutációkat találtak a gyomornedvben és lobularis emlőrák (a csak két fajta rák kapcsolódó HDGC), hanem más típusú rák, mint például az ízületi szarkóma vagy epevezeték karcinóma (asztal S2 ).

a strukturális modell a korábban ismertetett, szoktuk FoldX generálni az egyes kapcsolódó rák USVs, és értékelte a natív állapot stabilitását, ΔG (közkeletű, mint a teljes energia az egyszerűség kedvéért) [20]. Az energetikai különbség a WT referencia és a megfelelő mutáns (AAG = ΔG _{WT-ΔG Mut) számoltunk a 22 HDGC /EODGC E-cadherin USVs lokalizált régiókban a modell által lefedett struktúrák, valamint a eredményeket az 1. táblázatban felsorolt ​​Amikor AAG negatív, ez tükrözi a nyereség natív állapotú stabilitást a mutáns formáját; ha pozitív, az azt jelenti, hogy a mutáns kevésbé stabil, akkor a vezeték nélküli terminál referencia. Korábbi tanulmányok más fehérjékről kimutatták, hogy a stabilitás változások számított FoldX alábbi algoritmus 0,8 kcal /mol belül vannak a hiba változás a szoftver, és így kell tekinteni, nem szignifikáns [21]. Ennek megfelelően, csak akkor tekinthető mutáció lehet destabilizáló amikor az általuk okozott energetikai változások felett 0,8 kcal /mol. A 2A ábra a mutációk felett a rendszer olyan instabilitási, míg az alsó azok szerkezetileg tolerálható. Egyértelmű, hogy destabilizálja a mutációk spead mentén a fehérje, és nem kedvezményes tartomány befolyásolja. Katalógusa}

A prodomén He-cad hasítja az érés során, és ha ez nem történt meg, az E-cadherin ragasztó működése károsodott [ ,,,0],29], [30]. A mutációk lokalizált ezen a területen, akkor értékeltük a teljes energia FoldX, a védelmi és SZITÁL, és értékeltük, hogy a beavatkozás a prodomén hasítási hely prop (részletek az Anyagok és módszerek). Azt találtuk, hogy mind örökletes (G62V és T118R) és szórványos (P30T, G62D, H92Y, H121R és H123Y) mutációk lokalizált E-cadherin prodomén szerkezetileg tolerálható, mint előre a FoldX (táblázat S3). Ha elemezzük a hatása alapján természetvédelmi segítségével SZITÁL, azt is megállapította, hogy sem a mutáció ártalmatlan, mert a védettségi foka alacsony (táblázat S3). Ezek az eredmények azt jelzik, hogy a kórokozó képesség az E-cadherin USVs lokalizálódik a prodomén valószínűleg nem függ a destabilizáció. Azt is megállapították, nincs hatással a hasítása a propeptid, ahogy megjósolta Prop (adatokat nem mutatjuk). Ennek megfelelően, úgy véljük, hogy a kórokozó képesség az E-cadherin mutációk ezen a területen vezethet a beavatkozás a dokkoló fehérjék részt vesznek prodomén feldolgozás, lehetetlen megjósolni, in silico katalógusa.

Örökletes E -cadherin USVs átfogja a teljes hosszúságú extracelluláris domén, míg szórványos mutációk túlnyomórészt a EC2-EC3, mint összhangban hotspot korábban leírt exonok 7-9 [5]. A teljes 18 csíravonal HDGC /EODGC mutációk lokalizált ezen a területen, azt találtuk, hogy 10 jelentős strukturális hatást a protein (1. táblázat). Mintegy fele a szórványos mutációk szintén destabilizálják (táblázat S3), függetlenül az EK-tartományban, ahol ezek lokalizáltak, ami arra utal, hogy a natív állapot destabilizáció is be lehet vonni egy jelentős hányada sporadikus daganatok járó E-cadherin veszteség pontmutáció.

Csak három mutáció lokalizálódik a régió által leképezett a modell a citoplazmatikus β-catenin kötő domén (P799R, V832M, S838G): az első két azonosított HDGC /EODGC beállítás, és a másik szórványos, talált a petefészek-karcinóma [31]. Ezen mutációk elemeztük közötti kötési energiát az E-cadherin és β-catenin és megállapította, hogy egyikük sem jelentősen megváltoztatja a kötési affinitása β-catenin szerint FoldX előrejelzést. Ez összhangban van az in vitro
eredmények azt mutatják, hogy az örökletes mutáció V832M hatékonyan kötődik β-catenin, és annak patogenitási úgy tűnik, hogy függ a képtelen az E-kadherin /β-catenin komplex kötődni α katenin [32], [33]. katalógusa

Mi összegyűjtöttük a jóslatok és funkcionális in vitro katalógusa adatait HDGC /EODGC mutációk és elemezték a megbízhatóság a prediktor használt (1. táblázat). Soroltuk az eredmények a jóslatok, mint: valódi pozitív (TP), ha a mutáció jósolt káros in silico katalógusa (akár FoldX vagy SZITÁL) és kiállítóterem funkciójának elvesztése in vitro katalógusa; Igaz Negative (TN), ha a mutáció jósolt tolerálható in silico katalógusa és funkcionális in vitro katalógusa; Hamis pozitív (FP), ha a mutáció jósolt káros in silico katalógusa de működőképes in vitro katalógusa; és hamis negatív (FN), ha a mutáció jósolt tolerálható in silico katalógusa, de kiváló in vitro katalógusa elvesztése a funkció. TP és TN pozitív eredményt, vagyis a előrejelzője képesek érzékelni a mutáció hatása függvényében; FP és FN képviselhetik mértékű kudarc. Azt találtuk, hogy mindkét algoritmus képes megjósolni a funkcionális hatását akár 70% -át a csíravonal HDGC /EODGC mutációk (11 16-ból mutációk), és az előrejelzések átfedő a felét a mutációk (az 1. táblázat, a 2B ábra).

elemeztük az adat csíravonalához HDGC /EODGC mutációkat hordozók, és bár az adatok korlátozottak, azt találtuk, hogy a legteljesebb adathalmazt az életkorban alakul ki, vagy halál jár a DGC. Amikor box-plot az adatokat, csoportosítás "destabilizálás" és a "nem-destabilizáló" mutáció hordozók megfigyelhetjük, nyilvánvaló fiatalabb korban a betegség kialakulását (diagnózis vagy halál) az első csoport (2D, ábra), ami arra utal, hogy a természetes állapot destabilizációját elszámolását a korábbi fejlődése DGC. katalógusa

3. Biológiai jelentősége E-cadherin destabilizációját katalógusa

Az egyes biológiai jelentőségét E-cadherin destabilizációját használtuk, mint a modell-rendszer három újonnan azonosított E-cadherin csírasejt missense mutációk jelentik a labor funkcionális jellemzése: E185V, S232C és L583R, a későbbi nemrég az irodalomban leírt [22]. A in silico
elemzés korábban leírt végeztük erre a három új mutáció, és az eredményeket az 1. táblázat tartalmazza (lásd alább a sötét vonal). Mutációk E185V és S232C szerkezetileg tolerálható, AAG = 0,29 kcal /mol és -0,9 kcal /mol volt (1. táblázat), jelentéktelennek hatását illetően a szerkezet. Mutáció S232C elősegíti csökkenése energia, stabilizálja a fehérje, és ez annak köszönhető, hogy a veszteséget a magas energiája egy szerin eltemetett OH csoport, amely nem vesz részt egy H-kötés, és az elhelyezés a oldalláncot a cisztein. Mutáció L583R indukál destabilizáció, a AAG = 2,72 kcal /mol, ami a drámai változás a hidrofób és a hidrofil aminosav, amely azt eredményezi, hogy az arginin nem képesek alkotni H-kötések, hogy kedvezőtlenül eltemetve. Katalógusa

N vitro
funkcionális vizsgálatokat végeztünk a fent említett HDGC /EODGC mutációkat, és találtunk egy tökéletes korrelációt a funkcionalitás in vitro
és a jelenléte /hiánya szerkezeti hatás: E185V és S232C megtartják a ragasztó funkció az E-cadherin, és képesek alkotni szoros sejt aggregátumok, míg L583R mutat egyértelmű szétszórt minta, hasonlít Mock sejtek (3A ábra), jelezve, hogy E185V és S232C nem patogén, és L583R patogén.

Amikor elemeztük az E-cadherin expresszió a különböző sejtvonalakban, azt találtuk, hogy a teljes összeg a mutáns L583R alacsonyabb, hogy a vezeték nélküli terminál kifejezés azonos körülmények között, míg a mutációk E185V és S232C, megtartják a normális szint (3B ábra). Érdekes, hogy a megfelelő sáv L583R megmarad a gél, jelezve, hogy L583R nem képes megfelelően érett (éretlen forma az E-cadherin 130 kDa, érett 120 kDa), és áramlási citometriás eredmények azt mutatják, hogy ez kevésbé kifejezett a plazma membrán (3C, ábra).

Amikor a protein érési sikertelen, ez általában azt eredményezi, endoplazmás retikulum (ER) megtartása éretlen fehérje. Annak ellenőrzésére, hogy L583R valóban megmarad éretlen, elemeztük, ha megmarad az ER által közösen immunfluoreszcenciával az ER marker kalnexin (4A), és megállapította, hogy része az L583R jel egymásra az ER marker, jelezve fokozott ER-visszatartás. katalógusa

Ahhoz, hogy megértsük, ha destabilizáció mutatható in vitro katalógusa elemeztük stabilitását L583R a cellába, és értékeli annak forgalmát. Mi blokkolt fehérjeszintézist cikloheximiddel és megállapította, hogy L583R hamar lebomlik, mint értékeltük a maradék expresszió után hamarosan 8 óra fehérjeszintézis gátlása, szemben a WT és a többi mutánsok, amelyek még mindig erősen expresszálódik ugyanabban az állapotban (4b ábra) , jelezve, hogy L583R instabil a cellában. A jelenléte éretlen sáv a WT vagy mutáns az E-cadherin mintákat (felső sáv, 4b ábra) annak köszönhető, hogy a túlterhelés-fehérje eredő tranziens transzfekció.

Instabil vagy rosszul feltekeredett fehérjék szorosan szabályozza Protein minőség-ellenőrzési mechanizmusokat hogy megvédje a sejt által irányítja újonnan szintetizált kitekeredett fehérjék lebomlását a proteaszóma [34]. Kell, ha ez a helyzet a L583R, gátoltuk a proteaszóma aktivitását MG132 és megfigyelték, hogy annak ellenére, hogy a különböző kiindulási szintje E-cadherin, a kifejezés a mutáns L583R teljesen helyreáll kezelés hatására (4C), jelezve, hogy ez idő előtt lebomlik a proteaszóma szintézis után, mint a korábban leírt egyéb juxtamembranar HDGC-asszociált E-cadherin mutációk [35]. Érdekes módon, amikor a proteaszóma degradációs gátolt, van egy felhalmozódása éretlen E-cad minden sejtvonal, megnyilvánuló fontos a proteaszóma szabályozásában újonnan szintetizált E-cad, függetlenül Lét mutált vagy sem.

további érvényesítéséhez in silico katalógusa jóslatok, elemeztük a fenotípusa a visszatért destabilizálódna mutáció indukálva szerkezetileg tolerált változást ugyanabban a helyzetben a mutáns formája az E-cadherin. Segítségével FoldX kiszámoltuk a hatását minden lehetséges változást helyzetben 583, és megállapította, hogy a változtatás indukáló kevésbé destabilizációját volt L583I (AAG = 0,56 kcal /mol, mint előre az egérmodellben táblázat S3). Érdekes, hogy ez a mutáció megtartja a ragasztóanyag függvényében E-cadherin, ami a kompakt sejt aggregátumok (ábra 4D), és nem destabilized in vitro katalógusa, kiállító cicloheximide ellenállás hasonló a WT formában (ábra 4E). Ezek az eredmények hangsúlyozzák a megbízhatóság a in silico katalógusa alapú előrejelzések az E-cadherin stabilitás és a tiszta összefüggést az E-cadherin destabilizációját elvesztése ragasztó funkciót. Katalógusa

Vita katalógusa

E-cadherin változások (mutációk, törléseket és metiláció) az egyetlen elismert genetikai oka HDGC [36], [37], [38]. A legtöbb azonosított mutációk HDGC vannak a nonszensz típus, de egy jelentős része (20%) mennyiségben a csíravonal mutációk ad okot egyetlen aminosav szubsztitúciók, amelyek közül a patogenitás nehéz értékelni, és gyakran tisztázatlan [39], [40]. A legfontosabb információk a genetikai tanácsadás csíravonal missense mutációt hordozók familiáris klinikai adatok (szegregációs elemzés többnyire), de ez az információ gyakran szűkös a méret a származási gyakran túl kicsi ahhoz, hogy a szegregáció tanulmányok, valamint a kórokozó képesség értékelése általában származik sejt-alapú in vitro katalógusa funkcionális vizsgálatokhoz [15], [17], amely időigényes és technikailag igényes, és ezért nem széles körben alkalmazható a rutin molekuláris labs. Következésképpen szükség van új eljárásokra, hogy meghatározzák a patogenitását az E-cadherin missense mutáció társult HDGC [40].

• PLoS One: Az integráció DNS kópiaszámától és transzkripciós Expression Analysis in Human gyomorkarcinóma
• PLoS One: fermentált tej Propionibacterium freudenreichii apoptózist indukál HGT-1 humán gyomorkarcinóma Cells