PLoS ONE: Små Molecule R1498 som et godt tolerert og oralt aktiv Kinase Inhibitor for leverkreft og magekreft behandling via Targeting Angiogenese og Mitosis Pathways

Abstract

Protein kinaser spiller viktige roller i tumor utvikling og progresjon. Masse kinase hemmere har inngått markedet og viser lovende kliniske fordeler. Her rapporterer vi oppdagelsen av en roman lite molekyl, godt tolerert, oralt aktiv kinase inhibitor, R1498, majorly rettet mot både angiogene og mitotiske trasé for behandling av leverkreft (HCC) og magekreft (GC). En serie av biokjemiske og cellebaserte analyser indikerte at målet kinase klynge av R1498 inkludert Aurora-kinaser og VEGFR2 et al. R1498 viste moderat in vitro
veksthemming på et panel av tumorceller med IC50 av mikromol rekkevidde. in vivo
anti-tumor effekt av R1498 ble evaluert på et panel av GC og HCC xenografter i en parallell sammenligning med en annen multikinasehemmer inhibitor sorafenib. R1498 vist overlegen effekt og toksisitet profilen over sorafenib i alle testmodeller med > 80% tumorvekstinhibitering og tumor regresjon i noen xenogratfts. Den terapeutiske potensialet R1498 ble også fremhevet av sin effekt på tre menneskelige GC primær tumor avledet xenograft modeller med 10-30% tumor regresjon rate. R1498 ble vist til aktivt å hemme Aurora A-aktivitet in vivo
, og redusere vaskularisering i svulster. Videre R1498 present god in vivo
eksponering og terapeutisk vindu i farmakokinetiske og doseringsområdet responsstudier. Avhandlinger bevisene indikerer at R1498 er en potent, godt tolerert, oralt aktiv multitarget kinase inhibitor med en unik antiangiogen og antiproliferativ profil, og gir sterk tillit for videre utvikling for HCC og GC terapi

Citation. Zhang C, Wu X, Zhang M, Zhu L, Zhao R, Xu D, et al. (2013) Små Molecule R1498 som et godt tolerert og oralt aktiv Kinase Inhibitor for leverkreft og magekreft behandling via Targeting Angiogenese og mitose Pathways. PLoS ONE 8 (6): e65264. doi: 10,1371 /journal.pone.0065264

Redaktør: Claude Prigent, Institut de Génétique et Développement de Rennes, Frankrike

mottatt: 22 februar 2013; Godkjent: 23 april 2013; Publisert: 05.06.2013

Copyright: © 2013 Zhang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Finansiering:. De bevilgende myndighet hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet

Konkurrerende interesser: Alle forfatterne er ansatte eller tidligere ansatte i Roche R & D-senteret (Kina) unntatt Taiping Chen. , som er ansatt i et CRO selskap kalt Crown Bioscience Inc. Beijing, Kina. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.

Innledning

Protein kinaser tjene som mål for terapeutisk intervensjon i kreft, som er validert og bevist av vellykket og bred anvendelse av protein kinase hemmere i flere kreftformer, enten som monoterapi eller i kombinasjon regimer. Imidlertid, som en heterogen sykdom forårsaket av akkumulerende multi-genmutasjoner i stedet drives av enkelt kinase mutant, kreft som holder god respons på enkelt middel behandlingen er meget begrenset. I tillegg har ervervet resistens av svulster forsyne seg raskt unndra fra kjemoterapi, da tilbakefall. Komplekset avvikende signalisering i kreft tiltrekker utvikling av strategier som er rettet mot flere biologiske mekanismer som er relevante for tumorbiologi som spredning, metastaser og anti-apoptose. En strategi innebærer rasjonell legemiddelkombinasjoner. For eksempel er kombinasjonen av VEGF-rettet monoklonalt antistoff med konvensjonell kjemoterapi har vist stort overlevelsesfordel i bryst, kolon og lungekreft [1]. En annen strategi er å utvikle forbindelsene som dekker flere mekanismer innenfor en enkelt agent. Denne tilnærmingen har flere potensielle fordeler i forhold til kombinasjonsstrategier, herunder enkelheten av utvikling banen, hastigheten til markedet, og mindre overlapping av bivirkninger. Foreløpig er multikinasehemmer inhibitor sorafenib brukes som førstelinjebehandling for avansert og metastatisk HCC med forbedring av median overlevelse fra 7,9 måneder (placebogruppen) til 10,7 måneder [2]. Men behandling med sorafenib resultater i statistisk signifikante, men klinisk milde, forbedringer i total overlevelse, tid til progresjon og sykdomskontrollrate [3]. Samtidig er tradisjonell cisplatin-basert terapi fortsatt mye brukt i kliniske innstillinger for avansert og metastatisk GC. For HER2 /neu overekspresjon mage adenokarsinomer, trastuzumab i kombinasjon med kjemoterapi forlenger median total overlevelse fra 11,1 måneder (kjemoterapi alene) til 13,8 måneder [4]. Selv om companioned diagnostiske metoder har blitt etablert for å målrette skjermbilde pasienter, har trastuzumab ingen aktivitet i en stor undergruppe av pasienter som hadde høyt nivå av HER2 /neu med grunnen som skal identifiseres [5]. Tatt i betraktning den høye dødelighet av HCC og GC og nåværende terapeutiske regimer med begrenset resultat, er det fortsatt stort udekket medisinsk behov for begge krefttyper.

Angiogenese cancer behandling, inkludert anti-VEGFR-2-antistoff, små molekyler mot VEGFR -2 signale [6], [7], og VEGFR chimeriske proteinet [8], har vist seg å være en effektiv strategi for behandling av flere cancertyper. I tillegg vil effekten av multikinasehemmer inhibitorer sunitinib og sorafenib delvis tilbakeføres til VEGF-signalering blokkering [9]. Imidlertid er en rekke pasienter som er resistente bunn eller utvikle resistens mot anti-antiangiogen behandling etter flere behandlingssykluser [10], [11]. Således er kliniske forsøk kombinerer angiogene inhibitorer og medikamenter med alternative virkningsmekanismen forventes å forbedre effektiviteten, eller å overvinne motstanden til antiangiogene behandling [12]. Det har vært allment anerkjent at overekspresjon av aurora kinaser i ulike kreftformer er involvert i prosessen med tumorgenese [13], [14]. Aurora kinase inhibitor VX-680 var i stand til å effektivt hemme kreftcellene vekst in vitro Hotell og in vivo
, og senere med i kliniske studier, som tyder på at Aurora kinaser er druggable mål [15] .

i lys av de akkumulerte bevis på angiogenese og Aurora kinaser i kreft og deres terapeutiske verdier påvist av de biologiske og små molekyl hemmere, oppdaget vi en kinase inhibitor, R1498, som i stor grad påvirket de viktigste veier av angiogenese og mitose. R1498 har en unik kinase hemming profil, høy styrke og god farmakokinetiske og toksikokinetiske profiler, alle disse støtte videre kliniske utviklingen.

Materialer og metoder

Etikk erklæringen

Bruk og vare på forsøksdyr ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC), Roche R & D-senteret (Kina). Crown Bioscience, en CRO tjeneste selskapet forpliktet til å beskytte pasientenes personvern og å følge alle de etiske prinsippene for pasient avledet materiale, samlet nylig kasserte humane tumorprøver, med IRB (lokale sykehuset tilsvarende komiteen) godkjenning og pasientsamtykkekrav. Alle cellelinjer ble kjøpt fra ATCC, USA, eller Shanghai Institutes of biokjemi og cellebiologi, Chinese Academy of Science

Forbindelser

R1498 (renhet > 98%). Ble syntetisert ved Roche R & D-senteret (Kina). For enzymatiske analyser og in vitro
cellebaserte analyser, R1498 ble oppløst i DMSO som 0,01 mol /L stamløsning. For dyrestudier, ble R1498 oppløst i 1% Klucel EF /0,1% polysorbat 80 /0,09% methylparaben /0,01% propylparaben vann, løsningen ble forberedt på en ukentlig basis. Sorafenib ble syntetisert ved Roche R & D-senteret (Kina) og oppløst i Cremophor EL /etanol (50:50, Sigma) for å forberede en 5 mg /ml stamløsning, folie innpakket, og oppbevar ved romtemperatur. Denne lager løsning ble nylaget hver 3. dag. Endelige doserings ble fremstilt på dagen for bruk ved å fortynne stamløsning med sterilt vann.

Cellelinjer

Alle cellelinjer fra American Typisk Collection senter (ATCC) og Cell bank, Shanghai Institutes for biokjemi og cellebiologi, ble Chinese Academy of Sciences holdt ved 37 ° C med 5% CO _{2 fuktig atmosfære i vekstmedium anbefaler av leverandørene og utsatt for in vitro
analyser mellom passasjer 8~15 , cellelinjer for dyrestudier var mellom passasjene 5~10. Human navlevene endotelceller (HUVEC) fås fra Allcells (Emeryville, CA) ble holdt i EGM-2 (Lonza, Allendale, NJ) med endotelial celleveksttilskudd og 10% føtalt bovint serum (Invitrogen, Carlsbad, CA).}

Cell Proliferation Assay

Hver cellelinje ble podet i en 96-brønners vevkulturplate (Corning, NY) med en forutbestemt tetthet i 180 pl komplett medium, festet over natten og ble behandlet med forbindelse til en annen 72 h. Deretter ble mediet fjernet og erstattet med 10% CCK-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan) i komplett medium og deretter inkubert platene i ytterligere 2 timer. OD _{450 ble målt med Spectramax 190 spektrofotometer (MDS, Sunnyvale, CA). En bakgrunn absorbans av OD blank ble trukket fra alle brønnene. Deretter inhibering hastighet (IR) ble bestemt med følgende formel:. IR (%) = (OD DMSO-OD forbindelse) /OD DMSO x 100%}

VEGF-indusert HUVEC proliferasjonsanalyse, de HUVECs suspendert i 170 ul EGM-2 med 0.5% FBS ble podet og inkubert over natten. Etter at cellene festet, 10 ul 1 pg /ml rekombinant human VEGF165 (R &D systemer, Minneapolis, MN) ble tilsatt til hver brønn sammen med 20 pl sammensatte oppløsninger fremstilt i EGM-2 med 0.5% FBS. CCK-8-analyse som ovenfor ble benyttet for bestemmelse av celle levedyktighet.

Kinase Analyser

affinitet R1498 mot 402 kinaser ble bestemt ved KINOMEScan® (Ambit biovitenskap, San Diego, CA) og data ble presentert som dissosiasjon konstant (Kd) verdier [16]. Inhiberingen på kinaseaktiviteten av Aurora-kinaser og VEGFR2 ble videre karakterisert ved Z'-Lyte kinase aktivitetsanalyser i henhold til tilsvarende ATP-konsentrasjoner.

HUVEC Tube Formation Assay

HUVEC rør-analysen ble utført som tidligere rapportert [17]. I korthet ble Matrigel ™ (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) tint ved 4 ° C i 3~4 timer. 100 ul væske Matrigel ™ ble tilsatt til pre-avkjølt 96-brønners vevkulturplate, og platen ble inkubert ved 37 ° C, 5% CO _{2 fuktig atmosfære i 1 time for å størkne Matrigel ™. Den HUVECs ble dyrket i EGM-2 med 0.5% FBS over natten, og sådd ut i 90 ul EGM-2 med 0.5% FBS ved en tetthet på 2,2 x 10 ^{5 celler /ml på Matrigel ™ belagt plate. Cellene ble behandlet med forbindelse eller tilsvarende mengde DMSO. Platen ble inkubert ved 37 ° C, 5% CO 2 fuktig atmosfære i 7 timer, deretter celle morfologi ble tatt med fasekontrastmikroskop (IX71, Olympus, Hamburg, Tyskland).}}

Western Blot

Cell lysat ble utarbeidet i RIPA buffer og kvantifisert ved bicinchoninic syre (BCA) metode (Pierce, Rockford, IL). Tretti mikrogram protein per prøve ble applisert på en 4~12% NuPAGE® Novex SDS-gel (Invitrogen). Proteinet ble overført ved en iBlot® tørrblotting anordning (Invitrogen) på nitrocellulosemembraner. Etter blokkering av ikke-spesifikk binding med TBS /Tween 20 (0,1%) (TBS /t) inneholdende 5% ikke-fettmelk i 1 time ved romtemperatur, ble membranen inkubert i fosfo-Aurora A (Thr288) (C39D8) kanin-monoklonalt antistoff ( Cell Signaling Technology, CSTij9, Beverly, MA) eller fosfo-Histone H3 (Ser10) kanin-polyklonalt antistoff (CSTϊ1) (1:1000 i TBS /t inneholdende 3% bovint serumalbumin (BSA), og forsiktig ristet ved 4 ° C over natten. membranen ble vasket med TBS /T tre ganger for å fjerne ubundet antistoff og deretter inkubert med det sekundære antistoff (HRP-konjugert geit anti-mus IgG eller geite-anti-kanin-IgG, 1:10000, KangChen Biotech, Shanghai, Kina) i 1 time ved romtemperatur, henholdsvis. Proteinbånd bånd~~POS=HEADCOMP ble visualisert med en forsterket kjemiluminescens (ECL) kit (Pierce, Rockford, IL).

Immunofluorescence

celler utsådd på kammeret objektglass ble fiksert i 4% paraformaldehyd ved romtemperatur, deretter permeabilisert med 0,15% Triton-X100 i TBS og blokkert i 3% BSA i TBS /t. De primære antistoffer (fosfo-Aurora A (Thr288) (CSTĵ7), fosfo -Histone H3 (Ser10) (CSTϊ1) og MPM2 (anti-fosfo-Ser /Thr-Pro) Millipore-368) ble inkubert med lysbilder i en fuktig kammer ved 4 ° C over natten. De sekundære antistoffer Alexa Fluor® 488 geit-anti-kanin IgG (H + L) eller Alexa Fluor® 594 geit-anti-mus IgG (H + L) (Invitrogen) ble anvendt for henholdsvis en time etter at Objektglassene ble vasket med TBS grundig. Etter at de ikke-bundne antistoffer ble fjernet, ble platene tørket og montert med DAKO antifide monteringsmedium. Bildene ble tatt med IX71 under egnede eksitasjon og emisjonsfiltre.

flowcytometrisystemer

DNA ble målt med en FACS-Calibur cytometer (Becton Dickinson, San Jose, California) og cellesyklus distribusjon ble beregnet som tidligere beskrevet [18].

tubulin in vitro
polymerisering assay

in vitro
tubulinpolymerisering assay ble utført som beskrevet tidligere [18 ]

enkelt-dose farmakokinetikk (SDPK) Study

bruk og stell av forsøksdyr ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité, Roche R &. D-senteret (Kina). Hann nakne mus (kroppsvekt 19 til 24 g) ble anvendt i SDPK studien. Før farmakokinetisk studie ble dyrene randomisert til prøvetaking grupper (3 dyr per tidspunkt). Ytterligere ti mus ble brukt for å oppsamlet plasma emne for kalibreringskurver. Musene ble fastet over natten før oral administrering.

Blodprøver ble tatt ved retro-orbital punktering ved pre-dose og 0,033, 0,083, 0.25,0.5, 1, 2, 4, 6, 8 og 24 timer etter dosering. Plasmaprøvene og doseformulering ble lagret ved -20 ° C inntil bioanalyse. Datainnsamlings- og kontrollsystem ble opprettet ved hjelp av Analyst 1.4 software fra ABI Inc. Konsentrasjonene i plasma under kvantifiseringsgrensen (LOQ = 1 ng /ml) ble utpekt som null. Den farmakokinetiske data Analysen ble utført ved hjelp noncompartmental analysemoduler i WinNonlin Professional v5.2 (Pharsight, USA) sikret biotilgjengelighet ble beregnet som F (%) = (Dose _{iv × AUC po (0-∞)) /(Dose po × AUC iv (0-∞)) * 100%. For rotte, hund og ape SDPK, ble blodprøver fra halspulsåren punktering.}

Xenotransplantat effektstudie med cellelinjer og Avledet Pasient Svulster

Bruk og stell av forsøksdyr ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité, Roche R & D-senteret (Kina). Tumorceller ble podet inn i den høyre flanken til BALB /C nu /nu
kvinnelig hårløse mus (5~6 uker, 16~18 g, hentet fra Sino-britiske SIPPR /BK Lab. Animal Ltd, Shanghai, Kina) ved optimal tetthet basert på vår interne valideringsstudie. Etter at svulsten ble etablert og nådde 100~150 mm ^{3, musene ble randomisert til ti mus per gruppe og fikk behandling i henhold til planen. Tumorvekst ble tatt opp tre ganger i uken med måling av lengde (L) og bredden (W) av målepunktet, og beregnet som tumorvolum (TV, mm 3) = 0,5 * L * W * W (mm) . Tumorvekst-hemming ble beregnet som% TGI = (1- (gjennomsnittlig tumorvolum av behandlingsgruppen på den første dagen-midlere tumorvolum av behandlingsgruppen på enden dag) /(gjennomsnittlig tumorvolum til kontrollgruppen på den første dag-gjennomsnittlig tumorvolum til kontrollgruppen på enden dag)) x 100%. Svulsten regresjon av individuelle mus ble definert -. Tumorvolumet på slutten var mindre enn tumorvolumet når behandlingen ble startet}

I humane primære tumormodeller, ble friske menneskelige mage tumorvev direkte implantert i nonobese diabetiker og alvorlig kombinert immunmangel (NOD-SCID) mus i løpet av 5 timer etter operasjonen med 5 mm ^{3 fragmenter å etablere primære svulst xenograft modeller. Hver tumormodell ble verifisert ved hjelp av minst tre serielle in vivo
passasjer for å demonstrere engraftment stabilitet. Svulster fra passasjer 4-7 ble subkutant inokulert med trokarer til rette flankene av BALB /C nu /nu kvinnelig naken mus (5~6 uker, 16~18 g). Behandling begynte da tumorvolumet nådde 100~150 mm 3. Svulsten måling og drift protokollen var det samme som cellelinje avledet tumor modell.}

Immunohistochemistry

De 8 mikrometer parafin innebygd svulstvev objektglass preparert fra svulst in vivo
effekt studiene ble oppvarmet i en tørr ovn ved 60 ° C i 1 time, deretter deparaffinized og hydrolysert ved Leica Autostainer XL ST5010 ved romtemperatur. Antigen gjenfinning ble utført ved 95~99 ° C i citrat-buffer (0,01 M, pH 6,0) oppvarmes ved hjelp av et medisinsk mikrobølge ved 92-98 ° C i 5 minutter, deretter avkjølt til romtemperatur. Deretter peroksidase-blokkerende reagens (DAKO, DK-2600, Glostrup Danmark) ble påført for å stanse endogen peroksidase. Platene ble inkubert i blokkeringsserum i 20 minutter, deretter dekket med 100 ul fosfo-Aurora A (Thr288) (C39D8) kanin-mAb (CSTij9, 1:200 i TBS /T) eller kanin-anti-human CD31 polyklonalt antistoff ( Santa Cruz Biotech, sc-8306, Santa Cruz, CA, USA; 1:200 i TBS /T) ved 4 ° C over natten, deretter inkubert i 100 mL DAKO Envision + /HRP, kanin /mus etter å ha blitt vasket grundig med TBS. Ett hundre mikro liter substrat-kromogen oppløsning (DAB) ble påført på objektglassene og inkubert ved romtemperatur i 10 min. Skinnene ble skylt forsiktig med vann fra springen i 15 min. Counterstain og dehydrering ble utført ved XL ST5010 ved romtemperatur. Til slutt ble lysbilder montert med Permount montering medium (Fisher Scientific, Miami, FL).

Dose Range Finne og toksikokinetikkstudier

Dose avstandsmåling og toksikokinetisk Studien ble utført på rotter og Beagle hunder basert på in vitro
metabolitter identifikasjon. Wistar rotter (hann: 3, kvinnelig tre i hver gruppe, fra Vital River, Beijing, Kina) ble fastet over natten, og deretter fikk test artikler som 0, 6,25, 50 og 100 mg /kg to ganger daglig per oralt inntak for en 14 -dag kontinuerlig regime. Motilitet observasjon ble påført på en daglig baser for å finne den maksimale tolerant dose for dyrene. Dyrene ble avlivet på D14, og følgende toksikologi observasjonen ble utført blant kroppsvektendringer, klinisk observasjon, brutto obduksjon, hematologi kjemi og histopatologi. På dag 1 og dag 14 ble blodprøver oppnådd via halsvenen punktering fra alle dyr (hvis i live, ved hjelp av EDTA-K2-rør). Prøvene ble blandet forsiktig og plassert på knust våt-is inntil sentrifugering, som ble foretatt umiddelbart. Prøvene ble sentrifugert i ca. 15 minutter ved 4 ° C 2.700 rpm. Det resulterende plasma ble separert, overført til unikt merkede klare polypropylenrør og frosset umiddelbart i løpet av fast karbondioksyd (tørris) inntil overført til ca. -80 ° C. Hvert dyr ble tappet for blod ved de følgende tidspunkter: ca 5 min, 15 min, 30 min, 1, 2, 4, 8 og 24 timer etter første dose av den spesifikke dag. Den medikamentkonsentrasjoner i plasma ble bestemt ved LC-MS /MS. Den farmakokinetiske analyser ble utført ved hjelp WinNonlin programvare (versjon 5.2, Pharsight Corporation, CA, USA), og de farmakokinetiske parametrene ble beregnet ved hjelp av en ikke-kompartment modell metoden.

Beagle hunder (ca 8-10 måneder, fra Beijing Marshall Bioteknologi Co Ltd, Beijing, Kina) ble utsatt for studieprotokollen som beskrevet ovenfor. Hver gruppe har en mannlig og en kvinnelig hund, de doser av test artikkelen var: 0, 1, 7,5 og 15 mg /kg, henholdsvis. Bruk og stell av forsøksdyr ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité, Roche R &. D-senteret (Kina)

dataanalyse og statistikk

Uavhengig t-test ble brukt for kontinuerlig data analyse, og χ2 test ble anvendt for å kategoriske data. Data ble betraktet som signifikant når p-verdiene var. ≪ 0,05

Resultater

1. Karakterisering av R1498 som en multikinasehemmer Inhibitor

Pyrazolobenzodiazepine analog R1498, med et stillas basert på fusjon av et benzodiazepin og pyrazolringen (figur 1A), ble tidligere identifisert til å være en svak cyklin-avhengig kinase 2 (CDK2) -inhibitor [19]. Dette molekylet viste karakter av en multikinasehemmer inhibitor når vi analyserte kinase inhibitor biblioteket. Kinase hemming profil R1498 (1 mm) ble karakterisert via KINOMEScan® på ATP konsentrasjon rundt Km av hver kinase. Hemmingshastigheten av R1498 er over 80% mot 39 kinaser av 402 kinaser, inkludert 359 villtype-kinaser og 43 kinase-mutanter (figur S1). Dissosiasjonskonstantene (Kd) av 39 treff kinaser ble deretter bestemt, og de kinaser med Kd < 0,2 uM ble vist i Figur 1B. De fleste av de mulige treff hører til tyrosin-kinase (TK) familie og AGC familie. I tillegg ble Z-lytt analyse utført for ytterligere bestemmelse av kinase-inhiberende aktivitet av R1498. Resultatene viste at IC50s av R1498 var 25 ± 6 67 ± 4 167 ± 13 nM mot VEGFR2, Aurora-kinase A og B, respektivt (figur 1C). Deretter vår studie ble fokusert på de anti-angiogene og anti-mitotiske trasé majorly påvirkes av R1498.

Et panel av 16 cancercellelinjer, inkludert hepatokarsinom, magekreft og nasopharyngeal carcinoma-cellelinjer, ble brukt til å bestemme in vitro
anti-spredning evne til R1498. De fleste av cellelinjer er etablert fra asiatiske kreftformer, som den asiatiske utbredte kreftformer er vårt fokus. Den hepatokarsinom og magekreft cellelinje panel var mer følsomme overfor R1498 behandling enn nasofaryngeale cancercellelinjer. Den samlede gjennomsnittlige IC50s var 7,81, 7,55 og 30,07 mikrometer, tilsvarende epatocellular karsinom, magekreft, og nasopharyngeal carcinoma cellelinjer, henholdsvis. Sensitiviteten av cellelinjer som stammer fra asiatiske befolkningen (BEL-7402, QGY-7701 og QGY-7703) var sammenlignbar med følsomheten Hep3B som var fra kaukasisk (figur 1D).

2. R1498 hemmer Aurora kinaser og induserer cellesyklus arrest

Aurora kinase hemming av R1498 ble visualisert ved immunfluorescens i magekreft cellelinje SGC-7901. Direkte fosforyleringsseter fosfo-Aurora-kinase A (T288) og fosfo-histon H3 (S10) ble anvendt for å indikere den kinase-aktiviteten til Aurora A og B henholdsvis, [20], [21]. Fosfo-Ser /Thr-Pro Mitotisk protein monoklonalt(MPM2) ble anvendt som en mitotisk markør (rød) for merking av mitotiske celler. Aurora kinase A (T288) fosforylering skjer i sentrosomen av mitotiske celler (grønn). Etter at cellene ble behandlet med 5 uM MR1498 i 24 timer, Aurora A T288 grønn foci i mitotiske celler ble svakere eller forsvunnet (figur 2A, øvre panel), som viser at aktiviteten til Aurora-kinase A ble redusert ved behandling R1498. Fosforyleringen av histon H3 (S10) er hovedsakelig lokalisert i den sentromerer av mitotiske celler. Etter at cellene ble behandlet med R1498, fosfo-histon H3 (S10) en kraftig nedgang (grønn). Denne observasjon antydet at aktiviteten til Aurora-kinase B også falt ned på R1498 behandling. Disse resultatene fra immunofluorescens ble bekreftet ved western blot. Som vist i figur 2B, fosforyleringen av fosfo-Aurora-kinase A (T288) og fosfo-histon H3 (S10) ble redusert i en konsentrasjonsavhengig måte ved akutt behandling av R1498.

Inhibering av Aurora-kinaser og A B frembringer forskjellige fenotypiske forandringer i cellesyklusen. Undertrykkelse av Aurora A indusert cellesyklus G2 fase arrest [22], mens hemming på Aurora kinase B er rapportert å forårsake polyploidi i cellene på grunn av endoduplication uten cytokinese [15]. Etter at cellene ble behandlet med 10 uM R1498, både SGC-7901 (magekreft celle) og BEL-7402 (leverkreft celle) viste G2 /M fase rest og akkumulering av polyploide celler. For BEL-7402, cellene distribusjon i G2 /M faser økt fra 25,6% til 57,0%, i mellomtiden, cellene med > 4 N DNA innholdet økt fra 6,7% til 17,6%. SGC-7901 var mer følsom, med G2 /M befolkning økt fra 25,2% til 75,5%, og polyploide celler økte fra 3,1% til 21,6% (figur 2C). Microtubule stabilisator (for eksempel taxol) og avstabiliseringsmidlet (for eksempel kolkisin) vil føre til G2 /M fase arrest i tillegg. For å forstå om R1498 er en microtubule målrettet reagent, in vitro
tubulinpolymerisering analysen ble utført. Dataene viste at R1498 verken stabilisert eller destabilisert microtubule polymerisasjon selv under høy R1498 konsentrasjon (40 mm) in vitro plakater (figur 2D), noe som tyder på at cellesyklus G2 /M arrest ikke var forårsaket av microtubule cytoskjelettet forstyrrelse. Samlet utgjør disse dataene antydet at R1498 hemmet Aurora kinaser A og B i celler og produserte de fenotypiske forandringer i cellene.

3. R1498 motvirker den Angiogenese Fremskritts av humane endotelceller

Angiogenese ble initialisert av sekresjon av angiogen vekstfaktor fra kreftceller, og deretter endotelcellene spre seg, migrere og form fartøy rør i respons på VEGF stimulering. For å løse spesifisiteten av R1498 antagonisere endotelial cellevekst stimuleres av VEGF, ble humane umbilikalvene endotelceller (HUVECs) som utsettes for to forskjellige stimuli, VEGF og FBS, under behandling av R1498 i 72 timer. Under dyrkningsforholdene som inneholder VEGF eller FBS, HUVECs viste forskjellig respons på R1498. De IC50s var 89 og 2064 nM for henholdsvis VEGF og FBS,; disse antydet at R1498 motvirket den HUVEC vekst drevet av VEGF mer potent enn ved FBS (figur 3A). I HUVEC tube-analysen, etter 8 timers eksponering for R1498, HUVECs dannet færre intakte tube masker enn DMSO behandlede gruppene (Figur 3B). R1498 påvirket ikke HUVEC spredning under denne behandlingen tilstanden

4 (data ikke vist).. R1498 Undertrykker Growth of Human Cancer xenografter

De farmakokinetiske egenskapene med enkeltdose av R1498 i flere arter ble bestemt. Den halveringstiden (T1 /2) og oral biotilgjengelighet (Oral BA%) favoriserer videre effektstudie i naken mus (tabell S1) med en to ganger daglig oralt inntak timeplan. Et panel av transplantater, inkludert asiatiske magekreft, hepatokarsinom og nasofaryngeal kreft ble ansatt for sammenligning mellom R1498 og et annet multikinasehemmer inhibitor sorafenib (figur 4, tabell S2). Sorafenib er godkjent som førstelinjebehandling for hepatokarsinom [2], og er i klinisk utprøving for kombinatorisk behandling ved avansert magekreft [23]. Den parallelle sammenligning besto av tumorvekstinhibering, regresjon og kroppsvektendring av animalsk med dosering på 25 mg /kg, to ganger daglig per oralt. I alle testede xenografter, R1498 viste bedre tumorvekstinhibitering rate (TGI%) over sorafenib. For hepatokarsinom, er TGI% av R1498 10-19% mer enn TGI% av sorafenib, for magekreft, 2-12% over TGI% av sorafenib. Den regresjon av tumor ble også innlemmet som et annet terapeutisk endepunkt. I hepatokarsinom panel, ble tumor regresjon observert i BEL-7402 modell, 8/10 (80%) dyr hadde regresjon i R1498 gruppe, mens 1/10 (10%) dyr hadde regresjon i sorafenib gruppe (Figur 4, BEL-7402) . For magekreft panel, MGC-803 og SGC-7901 xenografter hadde samme regresjon satsen i respons til test artikler: 5/10 (50%) for R1498 og 2/10 (20%) for sorafenib (figur 4, SGC -7901, og tabell S2). Basert på effektendepunktene fra alle 7 testede modeller, har R1498 bedre effekt enn sorafenib under samme behandlingsregimet. Videre R1498 viste god effekt på en nasofaryngeal karsinom xenograft, TGI% av R1498 (90%, 25 mg /kg, to ganger daglig, per oral gavage) var overlegen i forhold til standard for pleie-cyklofosfamid (60%, hver 10. dag, intraperitoneal injeksjon) (figur 4, CNE-2). De kroppsvektendringer som ble registrert i alle modeller for toksisitet sammenligning viste at naken mus viste mer utholdelig å R1498 under hele behandlingen i BEL-7402, SGC-7901 og CNE-2 modeller, selv om vektøkning gått noe ned 10 dager etter behandling (figur 4, tabell S2). Imidlertid sorafenib forårsaket kontinuerlig dråpe av dyrets kroppsvekt. For sorafenib behandlet mus i BEL-7402 og SGC-7901-modeller, prosentandel av kroppsvekt tap oversteg 15% på oppsigelse dag. Som vist i tabell S2, R1498 viste mindre innvirkning på musekroppsvekt enn sorafenib gjorde, som foreslo at R1498 holdt bedre sikkerhetsprofil.

5. R1498 nedregulerer Fosforylering av Aurora A and Vascular Tetthet i Tumor

Fosforylert Aurora A (T288) og CD31 i svulster fra effektstudie ble brukt for bestemmelse av på målet effekten av R1498. Tumormassen høstet fra BEL-7402 xenograft Studien ble utarbeidet i parafin innebygde lysbilder og utsatt for immunohistochemisty for å visualisere angiogenese maker human CD31 og Aurora kinase A-aktivitet markør fosfor-Aurora A (T288). I BEL-7402 tumorer, den CD31 farging av R1498 behandlingsgruppene ble redusert på en doseavhengig måte, som antydet i vaskulariseringen i tumorer ble inhibert (figur 5A). Aktiviteten av Aurora kinase A ble også redusert på R1498 behandling, som ble reflektert av svakere farging av fosfo-Aurora A (T288) i R1498 behandlet svulster (figur 5B).

Menneskelig primære mage svulst avledet xenograft modell ble brukt til å forutsi effekten for klinisk oversettelse. Kreft vev av tre individuelle mage kreftpasienter ble innpodet i mus, og xenografter avgrenset ulike vekstkurver in vivo
. De xenotransplantater viste forskjellig innvirkning på kroppsvekt endringer av vertene. Musene ble behandlet med R1498 (25 mg /kg) for de angitte tidsrom, den endelige TGI% nådde 73,6 ~ 91,6%, med regresjons priser 10~30%. De begrensede kroppsvekt endringene foreslått at den tumorbærende mus var også tolerante for å R1498 (figur 6).

6. R1498 har god Farmakokinetiske Profile (PK) og terapeutiske vinduet

SDPK indikerte at de akseptable biotilgjengelighet og halveringstid egenskaper R1498 blant naken mus, rotter og hunder (tabell S1). Samlede levermikrosomer ble brukt til å forutsi de viktigste metabolittene hos ulike arter. Rotte og beagle hund med liknende mikrosomtilberedning metabolitter av menneskelig ble brukt i maksimal tolerant dose (MTD) studie for å fastslå det terapeutiske vinduet mellom effektive og giftige eksponeringer (tabell S4). Kvinnelige og mannlige rotter viste forskjellig respons til de eskalerte doser av R1498.

• PLoS ONE: pyruvatkinasepåviser M2 har en dobbeltrolle på forordning av EGF /EGFR Signa via E-cadherin avhengig måte i magekreft Cells
• PLoS ONE: en prospektiv studie på forekomsten av postoperative venøs tromboembolisme hos koreanske Gastric kreftpasienter: en gransking av Application vestlige retningslinjer til asiatiske kreftpasi…