PLoS ONE: Klein-Molekül-R1498 als gut verträglich und oral wirksame Kinase Inhibitor für hepatozellulären Karzinoms und Magen-Krebs-Behandlung über Targeting Angiogenesis und Mitose Pathways

Abstrakt

Proteinkinasen spielen eine wichtige Rolle bei der Tumorentstehung und Progression. Viele von Kinase-Inhibitoren haben in Markt eingetreten und zeigen vielversprechende klinische Vorteile. Hier berichten wir über die Entdeckung eines neuen kleinen Moleküls, gut verträgliche, oral aktiven Kinase-Hemmer, R1498, majorly beide angiogenen und mitotischen Wege zur Behandlung des hepatozellulären Karzinoms (HCC) und Magenkrebs (GC) Targeting. Eine Reihe von biochemischen und zellbasierte Assays zeigten, dass die Ziel kinase Cluster von R1498 enthalten Aurora-Kinasen und VEGFR2 et al. R1498 zeigte moderate In-vitro-
Wachstumshemmung auf einem Panel von Tumorzellen mit IC50 von Mikromol Bereich. Die in vivo
Anti-Tumor-Wirksamkeit von R1498 wurde auf einem Panel von GC und HCC-Xenotransplantaten in einem parallelen Vergleich mit einem anderen Multi-Kinase-Inhibitor Sorafenib ausgewertet. R1498 demonstriert überlegene Wirksamkeit und Toxizitätsprofil über Sorafenib in allen Testmodellen mit > 80% Hemmung des Tumorwachstums und der Tumorregression in einigen xenogratfts. Das therapeutische Potential von R1498 wurde auch durch ihre Wirksamkeit auf drei menschlichen GC Primärtumor abgeleitet Xenotransplantat-Modelle mit 10-30% Tumorregressionsrate markiert. R1498 wurde die Aurora-A-Aktivität aktiv hemmen in vivo
und die Vaskularisierung in Tumoren zu verringern. Darüber hinaus R1498 präsentiert gute in vivo
Belichtung und therapeutisches Fenster in den pharmakokinetischen und Dosisfindungsstudien. Thesen Beweise zeigen, dass R1498 ein potenter ist, gut verträgliche, oral aktives Multitarget-Kinase-Inhibitor mit einem einzigartigen antiangiogene und antiproliferative Profil und bieten ein starkes Vertrauen für die weitere Entwicklung für HCC und GC-Therapie

Citation:. Zhang C, Wu X, Zhang M, Zhu L, Zhao R, Xu D, et al. (2013) Kleine Molekül-R1498 als gut verträglich und oral wirksame Kinase Inhibitor für hepatozellulären Karzinoms und Magen-Krebs-Behandlung über Targeting Angiogenesis und Mitose Pathways. PLoS ONE 8 (6): e65264. doi: 10.1371 /journal.pone.0065264

Editor: Claude Prigent, Institut de Génétique et Développement de Rennes, Frankreich

Received: 22. Februar 2013 beginnen; Akzeptiert: 23. April 2013 beginnen; Veröffentlicht am: 5. Juni 2013

Copyright: © 2013 Zhang et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Die Geldgebern hatte keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung zu veröffentlichen oder um die Herstellung des Manuskripts

Interessenkonflikt: Alle Autoren sind Mitarbeiter oder ehemalige Mitarbeiter von Roche R & D Center (China) außer Taiping Chen. , der ist ein Mitarbeiter eines CRO Firma Crown Bioscience Inc. Peking, China. Dabei werden nicht die Einhaltung der Autoren ändern, um alle Politiken PLoS ONE auf den Austausch von Daten und Materialien.

Einführung

Proteinkinasen dienen als Ziele für die therapeutische Intervention bei Krebserkrankungen, die validiert und nachgewiesen durch die erfolgreiche und breite Anwendung von Proteinkinase-Inhibitoren in verschiedenen Krebsarten, entweder als Monotherapie oder in Kombinationstherapien. Doch als heterogene durch akkumulative Multi-Gen-Mutationen verursachte Krankheit und nicht durch einzelne Kinase-Mutante, Krebs angetrieben, die eine gute Reaktion auf Monotherapie halten sind sehr begrenzt. Darüber hinaus helfen sich die erworbene Resistenz von Tumoren entziehen schnell von einer Chemotherapie, dann Rückfall. Der Komplex anomale Signalisierung bei Krebs zieht die Entwicklung von Strategien, die mehrere biologische Pfade relevanten Tumorbiologie Ziel wie Proliferation, Metastasierung und Anti-Apoptose. Eine Strategie beinhaltet rationale Arzneimittelkombinationen. Beispielsweise gezielt die Kombination des VEGF monoklonalen Antikörpers mit einer herkömmlichen Chemotherapie signifikanten Überlebensvorteil in Brust-, Darm- und Lungenkrebs [1] gezeigt hat. Eine andere Strategie ist es, die Verbindungen zu entwickeln, die mehrere Mechanismen innerhalb eines einzigen Agenten decken. Dieser Ansatz hat mehrere Vorteile gegenüber Kombination Strategien, einschließlich der Einfachheit der Entwicklungspfad, Geschwindigkeit auf den Markt, und weniger Überlappung von Nebenwirkungen. Derzeit wird als First-Line-Therapie für fortgeschrittene und metastasierende HCC mit einer Verbesserung des medianen Überlebenszeit von 7,9 Monate (Placebo-Gruppe) auf 10,7 Monate Sorafenib Multi-Kinase-Inhibitor verwendet [2]. Die Behandlung mit Sorafenib Ergebnisse in statistisch signifikant, aber klinisch mild, Verbesserungen in der Gesamtüberlebenszeit, die Zeit bis zur Progression und Krankheitskontrollrate [3]. Inzwischen traditionelle Cisplatin-basierte Therapie ist immer noch weit verbreitet in der klinischen Einstellungen für fortgeschrittene und metastasierende GC verwendet. Für HER2 /neu Magenadenokarzinomen überexprimieren, Trastuzumab in Kombination mit einer Chemotherapie verlängert die mediane Überlebenszeit von 11,1 Monate (Chemotherapie allein) auf 13,8 Monate [4]. Obwohl companioned diagnostische Methode wurde zum Screenen Zielpatienten festgestellt hat Trastuzumab keine Aktivität in einer großen Untergruppe von Patienten hohe HER2 /neu mit dem Grund beherberge identifiziert werden [5]. In Anbetracht der hohen Sterblichkeit von HCC und GC und aktuelle Therapieschemata mit begrenztem Erfolg, gibt es nach wie vor große medizinische Bedarf für beide Krebsarten.

Angiogenesis Krebstherapie einschließlich Anti-VEGFR-2-Antikörper, kleine Moleküle gegen VEGFR -2 Signalisierungs [6], [7] und VEGFR chimäres Protein [8], ist nachgewiesen worden, zur Behandlung von mehreren Krebsarten eine effiziente Strategie. Darüber hinaus würde die Wirksamkeit von Multi-Kinase-Inhibitoren Sunitinib und Sorafenib teilweise VEGF Signalgebung zurückzuführen Blockierung [9]. Jedoch sind eine Reihe von Patienten intrinsisch resistent oder entwickeln Resistenz gegenüber anti-anti-angiogene Therapie nach mehreren Behandlungszyklen [10], [11]. Somit klinischen Studien angiogenen Inhibitoren und Medikamente mit alternativen Wirkungsmechanismus kombiniert werden erwarteten Wirksamkeit zu verbessern, oder um den Widerstand zu überwinden antiangiogene Behandlung [12]. Es wurde allgemein anerkannt, dass die Überexpression von Aurora-Kinasen bei verschiedenen Krebsarten in den Prozess der Tumorentstehung beteiligt ist [13], [14]. Aurora-Kinase-Inhibitor VX-680 war in der Lage, um effektiv Krebszellen Wachstum In-vitro-
und in vivo
und anschließend trat in klinischen Studien, was darauf hindeutet, dass die Aurora-Kinasen sind druggable Ziele [15] hemmen .

Angesichts sichts~~POS=HEADCOMP der akkumulativen Evidenzen der Angiogenese und Aurora-Kinasen in Krebs und ihre therapeutische Werte durch die biologischen und Kleinmolekül-Inhibitoren erwiesen, wir ein Kinase-Inhibitor entdeckt, R1498, der im wesentlichen die Hauptwege der Angiogenese beeinflusst und Mitose. R1498 verfügt über eine einzigartige Kinaseinhibierung Profil, hohe Wirksamkeit und gute pharmakokinetische und toxikokinetische Profile, diese alle weiteren klinischen Entwicklung zu unterstützen.

Materialien und Methoden

Ethik Statement

Die Verwendung und D Center (China); Pflege von Versuchstieren wurde von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC), Roche R &genehmigt. Crown Bioscience, ein Unternehmen CRO Service verpflichtet Patienten die Privatsphäre zu schützen und alle ethischen Grundsätze für die Patienten abgeleitet Materialien zu folgen, gesammelt frisch verworfen menschlichen Tumorproben, mit IRB (örtliches Krankenhaus Äquivalent Ausschuss) die Genehmigung und Zustimmung des Patienten Anforderungen. Alle Zelllinien wurden von der ATCC, USA, oder Shanghai Institute für Biochemie und Zellbiologie, Chinesische Akademie der Wissenschaften

Verbindungen

R1498 (Reinheit > 98%). Wurde von Roche R synthetisiert & D Center (China). Für enzymatische Assays und In-vitro-
zellbasierten Assays, wurde R1498 in DMSO gelöst als 0,01 mol /l Stammlösung. Für Tierstudien R1498 wurde in 1% Klucel EF /0,1% Polysorbat 80 /0,09% Methylparaben /0,01% Propylparaben Wasser, die Lösung wurde vorbereitet auf einer wöchentlichen Basis gelöst. Sorafenib wurde von Roche R &synthetisiert; D Center (China) und in Cremophor EL /Ethanol (50:50, Sigma) mit einer 5 mg /ml Stammlösung, Folie verpackt, und bei Raumtemperatur lagern vorzubereiten. Diese Stammlösung wurde frisch alle 3 Tage vorbereitet. Endgültige Dosierungslösungen wurden am Tag der Verwendung hergestellt, indem die Stammlösung mit sterilisiertem Wasser verdünnt wird.

Zelllinien

Alle Zelllinien von American Typische Sammelstelle (ATCC) und Zellbank, Shanghai Institute für Biochemie und Zellbiologie, wurden chinesische Akademie der Wissenschaften bei 37 ° C mit 5% CO _{2 befeuchteten Atmosphäre in einem Wachstumsmedium empfehlen von den Herstellern und einer in-vitro-Assays
zwischen den Passagen beibehalten 8~15 die Zelllinien für Tierstudien wurden zwischen Passagen 5~10. Menschliche Nabelschnurvenenendothelzellen (HUVEC), erhalten von Allcells (Emeryville, CA) wurde in EGM-2 (LONZA, Allendale, NJ) mit endothelialen Zellwachstumsergänzungsmitteln und 10% fötalem Rinderserum (Invitrogen, Carlsbad, CA) gehalten.}

Cell Proliferation Assay

Jede Zelllinie für eine weitere 72 durch die Verbindung in einer 96-Well-Gewebekulturplatte (Corning, NY) bei einer vorbestimmten Dichte in 180 &mgr; l Vollmedium, angebracht über Nacht und behandelt ausgesät wurde h. Dann wurde das Medium verworfen und ersetzt mit 10% CCK-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan) in komplettem Medium, dann inkubiert, die Platten für weitere 2 h. Die OD _{450 wurde mit SpectraMax 190-Spektrophotometer (MDS, Sunnyvale, CA) gemessen. Eine Hintergrundabsorption von OD leer wurde von allen Vertiefungen abgezogen. Dann Hemmungsrate (IR) wurde mit folgender Formel berechnet:. IR (%) = (OD DMSO-OD Verbindung) /OD DMSO × 100%}

In VEGF-induzierte HUVEC-Proliferationsassays, suspendiert die HUVECs in 170 &mgr; l EGM-2 mit 0,5% FBS wurden ausgesät und über Nacht inkubiert. Nachdem die anhaftenden Zellen, 10 &mgr; l 1 &mgr; g /ml rekombinantem humanen VEGF 165 (R & D Systems, Minneapolis, MN) wurde mit 20 &mgr; l Verbindungslösungen in EGM-2 mit 0,5% FBS hergestellt zu jeder Vertiefung addiert. Der CCK-8-Test, wie oben für die Bestimmung der Lebensfähigkeit der Zellen verwendet wurde.

Kinase-Assays

Die Affinität von R1498 gegen 402 Kinasen durch KINOMEScan® (Ambit Biosciences, San Diego, CA) bestimmt und die Daten wurden als Dissoziationskonstante (Kd) Werte dargestellt [16]. Die Hemmung auf Kinaseaktivität von Aurora-Kinasen und VEGFR2 wurde weiter charakterisiert durch Z'-Lyte-Kinase-Aktivität Assays unter ATP-Konzentrationen entsprechen.

HUVEC Tubusbildung Assay

HUVEC Rohrbildungstest wurde durchgeführt, wie früher berichtet [17]. Kurz gesagt wurde Matrigel ™ (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) für 3~4 h bei 4 ° C aufgetaut. 100 &mgr; l Flüssigkeit Matrigel ™ zugegeben 96-Well-Gewebekulturplatte zu vorgekühlten, und die Platte wurde bei 37 ° C inkubiert, 5% CO _{2 befeuchteten Atmosphäre für 1 h Matrigel ™ zu verfestigen. Die HUVECs wurden in EGM-2 mit 0,5% FBS über Nacht und ausgesät in 90 &mgr; l EGM-2 mit 0,5% FBS bei einer Dichte von 2,2 x 10 ^{5 Zellen /ml auf die Matrigel ™ beschichteten Platte. Die Zellen wurden durch Verbindung oder äquivalenten Menge DMSO behandelt. Die Platte bei 37 ° C, 5% CO 2 befeuchteten Atmosphäre für 7 Stunden inkubiert, dann wurde die Zellmorphologie mit Phasenkontrast-Mikroskop (IX71, Olympus, Hamburg, Deutschland) erfasst.}}

Western Blot

das Zelllysat wurde in RIPA-Puffer und quantifiziert, die durch die Bicinchoninsäure (BCA) Verfahren (Pierce, Rockford, IL). Dreißig Mikrogramm pro Probe Protein wurde auf eine 4~12% NuPAGE ® Novex SDS-Gel (Invitrogen) geladen. Das Protein wurde durch eine iBlot® Dry-Blotting Vorrichtung (Invitrogen) auf Nitrocellulosemembranen übertragen. Nach dem Blockieren mit TBS /Tween 20 (0,1%) (TBS /T), enthaltend 5% fettfreier Milch für 1 h bei Raumtemperatur wurde die Membran in phospho-Aurora A (Thr288) inkubiert (C39D8) Kaninchen monoklonale Antikörper unspezifische Bindung ( Cell Signaling Technology, CSTij9, Beverly, MA) oder Phospho-Histon H3 (Ser10) polyklonalen Kaninchen-Antikörper (CSTϊ1) (1:1000 in TBS /T, enthaltend 3% Rinderserumalbumin (BSA), und sanft geschüttelt bei über Nacht 4 ° C. die Membran wurde mit TBS /T dreimal gewaschen, um den ungebundenen Antikörper zu entfernen, und dann mit dem sekundären Antikörper (HRP-konjugiertes Ziege-anti-Maus-IgG oder Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG inkubiert, 1:10000, KangChen Biotech, Shanghai, China) für 1 h bei Raumtemperatur, respectively. Die Proteinbanden wurden mit einer verstärkten Chemilumineszenz (ECL) Kit (Pierce, Rockford, IL) sichtbar gemacht.

Immunofluorescence

Zellen auf Kammer ausgesät Objektträger wurden in 4% Paraformaldehyd bei Raumtemperatur fixiert, dann permeabilisiert mit 0,15% Triton-X100 in TBS und in 3% BSA in TBS /T. Die primären Antikörper (Phospho-Aurora A (Thr288) (CSTĵ7) blockiert wird, phospho -Histon H3 (Ser10) (CSTϊ1) und MPM2 (anti-Phospho-Ser /Thr-Pro) Millipore-368) wurden über Nacht bei 4 ° C mit Wasserrutschen in einer feuchten Kammer inkubiert. Die Sekundärantikörper Alexa Fluor ® 488 Ziege-Anti-Kaninchen-IgG (H + L) oder Alexa Fluor ® 594 Ziege-Anti-Maus-IgG (H + L) (Invitrogen) wurden jeweils für eine Stunde angelegt, nachdem die Objektträger mit TBS gründlich gewaschen wurden. Nachdem die ungebundene Antikörper entfernt wurden, wurden die Objektträger getrocknet und mit DAKO antifide Montagemedium montiert. Die Bilder wurden mit IX71 unter geeigneten Anregungs- und Emissionsfiltern erfasst.

Durchflusszytometrie

DNA-Gehalt mit einem FACS-Calibur-Zytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA) und Zellzyklus-Verteilung gemessen wurde wie zuvor beschrieben wurde berechnet [18].

Tubulin in vitro
Polymerization Assay

in vitro
Tubulinpolymerisation Assay wurde durchgeführt, wie zuvor beschrieben [18 ]

pharmakokinetische Einzeldosis (SDPK) Studie

Die Verwendung und Pflege von Versuchstier von Institutional animal Care und Use Committee, Roche R &genehmigt wurde;. D Center (China). Männliche nackte Mäuse (Körpergewicht: 19-24 g) wurden in SDPK Studie verwendet. Vor der pharmakokinetischen Studie wurden die Tiere zu den Probengruppen randomisiert (3 Tiere pro Zeitpunkt). Zehn weitere Mäuse wurden gesammelt Plasma leer für Kalibrierungskurven verwendet. Die Mäuse wurden über Nacht vor der oralen Verabreichung gefastet.

Blutproben durch retro-orbitale Punktion vor der Dosierung gesammelt wurden und 0,033, 0,083, 0.25,0.5, 1, 2, 4, 6, 8 und 24 Stunden Post-Dosis. Die Plasmaproben und die Dosis-Formulierung wurden bei -20 ° C bis Bioanalyse gespeichert. Die Datenerfassung und Steuerungssystem wurden Analyst 1.4 Software von ABI Inc. Die Konzentrationen im Plasma unterhalb der Nachweisgrenze (LOQ = 1 ng /ml) erstellt wurden als Null bezeichnet. Die pharmakokinetische Datenanalyse wurde mit noncompartmental Analysemodule in WinNonlin Professionelle v5.2 ausgeführt (Pharsight, USA) .Die Bioverfügbarkeit als F berechnet (%) = (Dose _{iv × AUC po (0-∞)) /(Dose po × AUC iv (0-∞)) * 100%. Für Ratte, Hund und Affe SDPK wurden die Blutproben von Halsvene Einstich gesammelt.}

Xenograft Wirksamkeitsstudie mit Zelllinien und Patienten Abgeleitet Tumoren

Die Verwendung und Pflege von Versuchstier wurde genehmigt durch Institutional Animal Care und Use Committee, Roche R & D Center (China). Die Tumorzellen in die rechte Flanke von Balb /C beimpft nu /nu
weibliche Nacktmäuse (5~6 Wochen, 16~18 g, erhalten von der chinesisch-britischen SIPPR /BK Lab. Tier Ltd, Shanghai, China) bei optimaler Dichte basierend auf unserer hauseigenen Validierungsstudie. Nachdem der Tumor festgestellt wurde und erreichte 100~150 mm ^{3, wurden die Mäuse in zehn Mäuse pro Gruppe randomisiert und erhielten eine Behandlung nach dem Zeitplan. Das Tumorwachstum wurde mit der Messung der Länge (L) dreimal wöchentlich aufgezeichnet und die Breite (W) durch Sattels und berechnet als Tumorvolumen (TV, mm 3) = 0,5 * L * W * W (mm) . Die Hemmung des Tumorwachstums wurde als TGI% berechnet = (1- (Tumorvolumen der Behandlungsgruppe am ersten Tag-mittlere Tumorvolumen der Behandlungsgruppe am Ende Tag bedeuten) /(Tumorvolumen der Kontrollgruppe auf der ersten bedeuten Tages mittlere Tumorvolumen der Kontrollgruppe am Ende Tag)) × 100%. Die Tumorregression einzelner Maus definiert wurde -. Das Volumen Tumor am Ende war weniger als das Tumorvolumen, wenn die Behandlung begonnen wurde}

In primären humanen Tumormodellen, frischen menschlichen Magentumorgewebe wurden direkt in nonobese Diabetiker implantiert und schwere kombinierte Immunschwäche (NOD-SCID) Mäusen innerhalb von 5 Stunden nach der Operation mit 5 mm ^{3 Fragmente Primärtumor Xenotransplantatmodellen zu etablieren. Jedes Tumormodell wurde von mindestens drei serielle in vivo
Passagen überprüft Verpflanzung Stabilität zu demonstrieren. Tumore von Passagen 4-7 wurden subkutan mit Trokare in die rechte Flanke von Balb /C nu /nu weibliche Nacktmäuse (5~6 Wochen, 16~18 g) geimpft. Die Behandlung begann, wenn das Tumorvolumen 100~150 mm erreicht 3. Die Tumormessung und der Betrieb Protokoll war das gleiche wie abgeleitet Tumormodell Zelllinie.}

Immunhistochemie

Die 8 um Paraffin eingebettet Dias Tumorgewebe hergestellt aus Tumor von In-vivo-Wirksamkeit
Studien wurden für 1 Stunde in einem Trockenofen bei 60 ° C erhitzt, dann entparaffiniert und durch Leica Autostainer XL ST5010 bei Raumtemperatur hydrolysiert. Antigen Retrieval wurde 5 min bei 95~99 ° C in Citratpuffer (0,01 M, pH 6,0) erhitzt, durch eine medizinische Mikrowelle bei 92-98 ° C durchgeführt, dann abgekühlt auf Raumtemperatur. Dann Peroxidase-Blockierungsreagenz (DAKO, DK-2600, Glostrup Dänemark) wurde die endogene Peroxidase zu löschen angewendet. Die Objektträger wurden in Blocking-Serum für 20 min inkubiert, dann mit 100 &mgr; l bedeckt Phospho-Aurora A (Thr288) (C39D8) Kaninchen mAb (CSTij9, 1:200 in TBS /T) oder Kaninchen-Anti-Human-CD31 polyklonalen Antikörper ( Santa Cruz Biotech, sc-8306, Santa Cruz, CA, USA; 1:200 in TBS /T) bei 4 ° C über Nacht, dann in 100 ul DAKO Envision + /HRP, Kaninchen /Maus inkubiert, nachdem gründlich mit TBS gewaschen. Einhundert Mikroliter Substrat-chromogenen Lösung (DAB) wurden auf die Objektträger aufgebracht und bei Raumtemperatur für 10 min inkubiert. Die Objektträger wurden 15 Minuten lang vorsichtig mit Leitungswasser gespült. Counterstain und Entwässerung wurde durch XL ST5010 bei Raumtemperatur durchgeführt. Schließlich wurden die Objektträger mit Permount Eindeckmediums (Fisher Scientific, Miami, FL) montiert.

Dosisfindungs ​​und Toxikokinetische Studie

Dosisfindungs ​​und toxikokinetischen Studie wurde bei Ratten und Beagle durchgeführt Hunde basierend auf in-vitro-
Metaboliten Identifizierung. Wistar-Ratten (männlich: 3, weiblich 3 in jeder Gruppe von Vital-Fluss, Beijing, China) wurden über Nacht fasten, und erhielt dann Testartikel als 0, 6,25, 50 und 100 mg /kg zweimal täglich per Schlundsonde für einen 14 -Tages kontinuierliche Regime. Motilität Beobachtung wurde auf einer täglichen Basis angewendet, um die maximale tolerant Dosis für die Tiere zu finden. Die Tiere wurden auf d14 geopfert, und die folgende Toxikologie Beobachtung wurden einschließlich Änderungen des Körpergewichts durchgeführt wird, die klinische Beobachtung, makroskopische, Hämatologie Chemie und Histopathologie. Am Tag 1 und Tag 14 wurden Blutproben über Halsvene Einstich von allen Tieren (wenn am Leben, EDTA-K2 Röhren verwendet wird) erhalten. Die Proben wurden auf zerquetschten nassen Eis bis Zentrifugation sanft und legte gemischt, die sofort durchgeführt wurde. Die Proben wurden für ungefähr 15 Minuten bei 4 ° C 2.700 rpm zentrifugiert. Das resultierende Plasma wurde abgetrennt, übertragen eindeutig beschriftet klare Polypropylen-Röhrchen und sofort über festem Kohlendioxid (Trockeneis) eingefroren, bis auf etwa -80 ° C übertragen. Jedes Tier wurde in den folgenden Zeitpunkten Blut entnommen: ca. 5 min, 15 min, 30 min, 1, 2, 4, 8 und 24 Stunden nach der ersten Dosis an dem bestimmten Tag. Die Arzneimittelkonzentrationen im Plasma wurden durch LC-MS /MS bestimmt. Die pharmakokinetische Analyse wurde unter Verwendung von WinNonlin-Software (Version 5.2, Pharsight Corporation CA, USA) durchgeführt, und die pharmakokinetischen Parameter wurden ein Nicht-Kompartment-Modell-Methode berechnet.

Beagle-Hunde (ca. 8-10 Monate, gerechnet ab Peking Marshall Biotechnology Co. Ltd., Peking, China) wurden dem Studienprotokoll unterzogen, wie oben beschrieben. Jede Gruppe hat ein Männchen und ein Weibchen Hund, die Dosierungen von Testartikel waren: 0, 1, 7,5 und 15 mg /kg. Die Verwendung und Pflege von Versuchstier wurde von Institutional Animal Care und Use Committee, Roche R &genehmigt;. D Center (China)

Datenanalyse und Statistik

Unabhängige t-Test für kontinuierliche Daten verwendet wurde, Analyse und χ2-Test wurde auf kategorische Daten angewendet. Die Daten wurden als signifikant angesehen, wenn p-Werte waren. ≪ 0,05

Ergebnisse |

1. Charakterisierung von R1498 als ein Multi-Kinase-Inhibitor

Pyrazolobenzodiazepine analog R1498, mit einem Gerüst auf der Grundlage der Fusion eines Benzodiazepin und Pyrazolring (1A), die zuvor eine schwache Cyclin-abhängige Kinase 2 (CDK2) werden identifiziert Inhibitor [19]. Dieses Molekül zeigte die Natur eines Multi-Kinase-Inhibitor, wenn wir die Kinase-Inhibitor-Bibliothek analysiert. Die Kinaseinhibierung Profil von R1498 (1 &mgr; M) wurde über KINOMEScan® bei ATP-Konzentration um die Km jeder Kinase gekennzeichnet. Die Hemmungsrate von R1498 ist mehr als 80% gegenüber 39 Kinasen aus 402 Kinasen, einschließlich 359 Wildtyp-Kinasen und 43-Kinase-Mutanten (Abbildung S1). Die Dissoziationskonstanten (Kd) von 39 Hit-Kinasen wurden dann bestimmt und die Kinasen mit Kd < 0,2 &mgr; M wurden in 1B gezeigt. Die meisten der potentiellen Hits gehören zu der Tyrosinkinase (TK) Familie und AGC-Familie. Zusätzlich wurde Z-Lyte Assay zur weiteren Bestimmung der Kinase Inhibierungsaktivität von R1498 durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass IC50s von R1498 waren 25 ± 6, 67 ± 4, 167 ± 13 nM gegen VEGFR2, Aurorakinase A bzw. B (Abbildung 1C). Dann sind unsere Studie über die anti-angiogenen und anti-mitotische Wege majorly betroffen von R1498 konzentriert.

Eine Gruppe von 16 Krebszelllinien, einschließlich Leberzellkarzinom, Magenkrebs und Nasen-Rachen-Karzinom-Zelllinien, wurde verwendet, um zu bestimmen, die in-vitro-
Antiproliferationsfähigkeit von R1498. Die meisten der Zelllinien werden aus den asiatischen Krebserkrankungen etabliert, wie die asiatischen vorherrschenden Krebsarten unser Fokus sind. Die hepatocarcinoma und Panel-Magenkrebs-Zelllinie waren empfindlicher auf R1498-Behandlung als Nasen-Rachen-Krebs-Zelllinien. Die Gesamtmittel IC50s waren 7,81, 7,55 und 30,07 &mgr; M, entspricht, Karzinom, Magenkrebs zu epatocellular und Nasen-Rachen-Karzinom-Zelllinien, respectively. Die Empfindlichkeit von Zelllinien aus asiatischen Bevölkerung (BEL-7402, QGY-7701 und QGY-7703) wurde auf die Empfindlichkeit von Hep3B vergleichbar, die von Weiß (1D) war.

2. R1498 Hemmt Aurora-Kinasen und führt zu Zellzyklusarrest

Aurora-Kinase-Hemmung durch R1498 durch Immunofluoreszenz bei Magenkrebs-Zelllinie SGC-7901 sichtbar gemacht wurde. Direkte Phosphorylierungsstellen phospho-Aurora-Kinase A (T288) und Phospho-Histon H3 (S10) verwendet wurden, um die Kinase-Aktivität von Aurora A und B zeigen jeweils [20], [21]. Phospho-Ser /Thr-Pro Mitotic Protein monoklonaler(MPM2) wurde als Marker mitotischen (rot) zur Kennzeichnung mitotischen Zellen verwendet. Aurorakinase A (T288) Phosphorylierung tritt in der Zentrosomen der mitotischen Zellen (grün). Nachdem die Zellen mit 5 uM MR1498 für 24 h behandelt wurden, wurde die Aurora A T288 grüne Herde in mitotischen Zellen schwächer oder verschwunden (2A, oberes Feld), die zeigen, dass die Aktivität der Aurora-Kinase-A auf R1498 Behandlung verringert. Die Phosphorylierung von Histon H3 (S10) wird hauptsächlich in den Zentromeren der mitotischen Zellen lokalisiert. Nachdem die Zellen mit R1498 behandelt wurden, verringerte sich die Phospho-Histon H3 (S10) scharf (grün). Diese Beobachtung legte nahe, dass die Aktivität der Aurora-Kinase-B auch auf R1498 Behandlung fiel nach unten. Diese Ergebnisse aus Immunofluoreszenz wurden durch Western-Blot bestätigt. Wie in 2B gezeigt ist, verringert die Phosphorylierung von Phospho-Aurora-Kinase A (T288) und Phospho-Histon H3 (S10) in einer konzentrationsabhängigen Weise in der Akutbehandlung von R1498.

Inhibition von Aurora-Kinasen A und B produziert verschiedene phänotypische Veränderungen in der Zellzyklus. Unterdrückung von Aurora A induzierten G2-Phase des Zellzyklus Verhaftung [22], während die Hemmung auf Aurora-Kinase-B wird berichtet Polyploidie in Zellen aufgrund endoduplication ohne Zytokinese verursachen [15]. Nachdem die Zellen wurden mit 10 uM R1498 behandelten sowohl SGC-7901 (Magenkrebszelle) und BEL-7402 (hepatozelluläres Karzinom-Zell) zeigte G2 /M Phase Arrest und Akkumulation von polyploiden Zellen. Für BEL-7402 erhöhte sich die Verteilungs Zellen in G2 /M-Phase von 25,6% bis 57,0%, inzwischen die Zellen mit > 4 N-DNA-Gehalt von 6,7% auf 17,6% erhöht. SGC-7901 war empfindlicher, mit der G2 /M Population von 25,2% auf 75,5% erhöht und polyploiden Zellen von 3,1% auf 21,6% (Abbildung 2C) erhöht. Mikrotubuli-Stabilisator (zB Taxol) und destabilizer (zB Colchicin) als auch G2 /M-Phase Stillstand führen. Um zu verstehen, ob R1498 ein Mikrotubulus gezielte Reagenz ist, In-vitro-
Tubulin-Polymerisation-Test wurde durchgeführt. Die Daten zeigten, dass R1498 weder stabilisiert noch destabilisiert Mikrotubuli Polymerisation auch unter hohen R1498 Konzentration (40 &mgr; M) In-vitro-
(2D), was darauf hindeutet, dass der Zellzyklus-G2 /M Arrest nicht von Mikrotubuli-Zytoskelett Störung verursacht wurde. Zusammengenommen lassen diese Daten, dass R1498 die Aurora-Kinasen A und B in den Zellen gehemmt und produzierte die phänotypische Veränderungen in den Zellen.

3. R1498 antagonisiert die Angiogenesis Fortschritt der menschlichen Endothelial Cells

Die Angiogenese durch Sekretion von angiogenen Wachstumsfaktor aus Tumorzellen initialisiert wurde, und dann vermehren sich die Endothelzellen, wandern und Form Gefäßröhrchen in Reaktionen auf die Stimulation des VEGF. Ansprechen wurden die Spezifität von R1498 die endotheliale Zellwachstum stimuliert durch VEGF, human umbilical vein endothelial Zellen (HUVECs) Antagonisierung zwei verschiedenen Reizen ausgesetzt, VEGF und FBS, unter der Behandlung von R1498 für 72 h. Unter den Kulturbedingungen, enthaltend VEGF oder FBS zeigte HUVECs unterschiedliche Reaktion auf R1498. Die IC50s waren 89 und 2064 nM für VEGF und FBS sind; diese schlug vor, dass R1498 die HUVEC Wachstum angetrieben durch VEGF stärker als von FBS (3A) antagonisiert. In HUVEC Rohrbildungstest, nach 8 h Exposition gegenüber R1498, gebildet HUVECs weniger intakte Rohr Maschen als DMSO behandelten Gruppen (3B). R1498 hatte keinen Einfluss auf HUVEC Proliferation unter dieser Behandlungszustand (Daten nicht gezeigt).

4. Unterdrückt R1498 das Wachstum von menschlichen Krebs Xenografts

Die pharmakokinetischen Eigenschaften mit Einzeldosis von R1498 in mehreren Spezies bestimmt. Die Halbwertszeit (T1 /2) und orale Bioverfügbarkeit (Oral BA%) begünstigt weitere Wirksamkeitsstudie in Nacktmäusen (Tabelle S1) mit einer zweimal täglich orale Gabe Zeitplan. Ein Gremium von Xenotransplantaten einschließlich asiatischer Magenkrebs, Leberkarzinom und Nasen-Rachen-Krebs wurde zum Vergleich zwischen R1498 und anderen Multi-Kinase-Inhibitor Sorafenib (Abbildung 4, Tabelle S2) eingesetzt. Sorafenib ist als First-Line-Therapie für hepatocarcinoma genehmigt [2], und ist in der klinischen Studie für die kombinatorische Behandlung von fortgeschrittenem Magenkrebs [23]. Der Vergleich bestand aus parallel Hemmung des Tumorwachstums, Regression und Änderungen des Körpergewichts des Tieres mit Dosierung von 25 mg /kg, zweimal täglich per oral. In allen getesteten Xenotransplantate zeigte R1498 besser Hemmungsrate des Tumorwachstums (TGI%) über Sorafenib. Für hepatocarcinoma ist das TGI% der R1498 10-19% mehr als TGI% von Sorafenib, für Magenkrebs, 2-12% über TGI% von Sorafenib. Die Regressionsrate des Tumors wurde auch als ein weiteres therapeutisches Endpunkt integriert. In hepatocarcinoma Panel wurde im BEL-7402-Modell beobachtet Tumorregression, 8/10 (80%) Tiere hatten Regression in R1498-Gruppe, während 1/10 (10%) Tier Regression in Sorafenib-Gruppe hatte (Abbildung 4, BEL-7402) . Für Magenkrebs-Panel, MGC-803 und SGC-7901-Xenotransplantaten hatte die gleiche Regressionsrate in Reaktion auf die Testartikel: 5/10 (50%) für R1498 und 2/10 (20%) für Sorafenib (Abbildung 4, SGC -7901; und Tabelle S2). Basierend auf den Wirksamkeitsendpunkte aus allen sieben getesteten Modelle, hat R1498 eine bessere Wirksamkeit als Zeitplan unter der gleichen Behandlung Sorafenib. Außerdem R1498 Nasopharynxkarzinom Xenotransplantat auf eine gute Wirksamkeit zeigte, die TGI% der R1498 (90%, 25 mg /kg, zweimal täglich, per Schlundsonde) überlegen war gegenüber Standard von Pflege- Cyclophosphamid (60%, alle 10 Tage, intraperitoneale Injektion) (Abbildung 4, CNE-2). Die Änderungen des Körpergewichts, die in allen Modellen für Toxizität Vergleich aufgenommen wurden, zeigten, dass die Nacktmaus erträglicher zu R1498 während der gesamten Behandlung in BEL-7402, SGC-7901 und CNE-2-Modelle zeigten, obwohl die Körpergewichtszunahme leicht verringert von 10 Tagen nach Behandlung (Abbildung 4, Tabelle S2). Allerdings Sorafenib verursacht kontinuierlichen Abfall des Körpergewicht des Tieres. Für Sorafenib behandelten Maus in BEL-7402 und SGC-7901-Modelle übertraf der Anteil des Körpergewichtsverlust von 15% auf die Beendigung Tag. Wie in Tabelle S2 gezeigt, zeigte R1498 weniger Auswirkungen auf das Körpergewicht der Maus als Sorafenib tat, was vorgeschlagen, dass R1498 besseres Sicherheitsprofil gehalten.

5. R1498 herunterreguliert Phosphorylierung von Aurora A und Gefäßdichte in der Tumor

Phosphorylated Aurora A (T288) und CD31 in Tumoren von Wirksamkeitsstudie zur Bestimmung der On-Target-Wirkung von R1498 verwendet wurden. Die Tumormasse von der BEL-7402 Xenotransplantat Studie geerntet wurde in Paraffin eingebettet Folien hergestellt und zur Visualisierung der Angiogenese Hersteller menschliche CD31 zu immunohistochemisty unterworfen und Aurorakinase A-Aktivität Marker Phospho-Aurora A (T288). In BEL-7402-Tumoren verringerte sich die CD31-Färbung von R1498 Behandlungsgruppen in einer dosisabhängigen Art und Weise, die der Vaskularisation in Tumoren vorgeschlagen wurde inhibiert (5A). Die Aktivität der Aurora-Kinase-A wurde auch auf R1498 Behandlung reduziert, die durch die schwächere Färbung von Phospho-Aurora A (T288) in R1498 behandelten Tumoren (5B) reflektiert wurde.

Menschliche primäre Magentumor abgeleitet Xenograftmodell wurde verwendet, um die Wirksamkeit für die klinische Übersetzung vorherzusagen. Die Krebsgewebe von drei einzelnen Magenkrebs-Patienten wurden in Maus transplantiert, und Xenotransplantate unterschiedliche Wachstumskurven in vivo
abgegrenzt. Die Xenotransplantate zeigten unterschiedliche Auswirkungen auf die Änderungen des Körpergewichts der Gastgeber. Die Mäuse wurden mit R1498 (25 mg /kg) für den angegebenen Zeitraum behandelt, erreichte das Finale TGI% 73,6 ~ 91,6%, mit Regressionsraten 10-30%. Die begrenzten Änderungen des Körpergewichts vorgeschlagen, dass der Tumor Mäuse waren auch tolerant zu R1498 (Abbildung 6).

6 trägt. R1498 hat gutes pharmakokinetisches Profil (PK) und therapeutisches Fenster

SDPK zeigten, dass die akzeptable Bioverfügbarkeit und Halbwertszeit Eigenschaften von R1498 unter nackten Maus, Ratte und Hund (Tabelle S1). Die gepoolten Lebermikrosomen wurden verwendet, um die Hauptmetaboliten in verschiedenen Spezies zu prognostizieren. Ratten und Beagle-Hund mit ähnlichen Mikros Metaboliten von Menschen wurden in maximal tolerant Dosis (MTD) Studie zur Bestimmung des therapeutischen Fensters zwischen wirksamen und toxischen Exposition (Tabelle S4) verwendet. Weibliche und männliche Ratten zeigten unterschiedliche Reaktion auf die eskalierte Dosen von R1498.

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