PLoS ONE: Podocalyxin som prognostisk markør i Gastric Cancer

Abstrakt

Baggrund

Podocalyxin-lignende 1 (PODXL) er en celle-vedhæftning glycoprotein forbundet med aggressiv tumor fænotype og dårlig prognose i flere former for kræft. Formålet med denne undersøgelse var at undersøge PODXL udtryk i gastrisk kræft ved brug af to forskellige antistoffer.

Metoder

Ved tumor-væv microarrays og immunhistokemi evalueret vi PODXL udtryk i tumor prøver fra 337 patienter der blev opereret for gastrisk adenocarcinom ved Helsinki University Hospital. Vi brugte to forskellige antistoffer:. HPA2110, som er et polyklonalt antistof og en in-house-monoklonalt antistof kaldet HES9, at undersøge sammenhængen af ​​PODXL udtryk med clinicopathologic variable og patientoverlevelse

Resultater

PODXL-farvning var positiv med det polyklonale antistof i 153 (57,5%) tilfælde og af det monoklonale antistof i 212 (76%). Polyklonalt antistof ekspression var forbundet med tarmkræft type (p < 0,001). Monoklonalt antistof-farvning var forbundet med alder over 66 (p = 0,001), med tarmkræft (p < 0,001), og med lille tumorstørrelse (≤ 5 cm; p = 0,024). Begge antistoffer blev forbundet med høj S-fase fraktion (p = 0,022; p = 0,010), og høj tumorproliferation indeks (Ki-67; p = 0,003; p = 0,001). PODXL positivitet af det polyklonale antistof angivne reduceret gastrisk cancer-specifik 5-års overlevelse på 24,0% (95% CI 16,9-31,1), sammenlignet med 43,3% (95% CI 33,7-52,9) for patienter med PODXL negativitet (p = 0,001 ). Resultatet var betydelig i multivariabel analyse. (HR = 3,17; 95% CI 1,37-7,34, p = 0,007)

Konklusion

I mavekræft, PODXL udtryk ved polyklonale antistof HPA2110 er en uafhængig markør for dårlig prognose

Henvisning:. Laitinen A, Böckelman C, Hagström J, Kokkola A, Fermer C, Nilsson O, et al. (2015) Podocalyxin som prognostisk markør i Gastric Cancer. PLoS ONE 10 (12): e0145079. doi: 10,1371 /journal.pone.0145079

Redaktør: Yves St-Pierre, INRS, CANADA

Modtaget: September 15, 2015; Accepteret: November 29, 2015; Udgivet: 16. december 2015

Copyright: © 2015 Laitinen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra Finska Läkaresällskapet, Kurt och Doris Palander Foundation, Sigrid Juselius Foundation, og medicinska understödsföreningen Liv och Hälsa. Fujirebio Diagnostics AB og Onson Consulting ydet støtte i form af løn til forfattere CF og ON, men havde ikke nogen ekstra rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet.

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

i de seneste årtier, er forekomsten af ​​mavekræft faldet, især i de vestlige lande, tilsyneladende på grund af den faldende forekomst af Helicobacter pylori
, bedre hygiejne, og mindre overfyldt levende. Fordi mavekræft har en dårlig prognose, er det stadig globalt den næsthyppigste årsag til kræft dødsfald [1]. Den 5-årige overlevelsesrate, trods helbredende operation, er kun omkring 10-30% [2]. Den høje dødelighed skyldes hovedsagelig sene diagnose.

UICC Tumor Knude Metastase (TNM) klassificering er langt den mest sammenhængende system prognostisk klassifikation i dag. Men selv inden for samme fase gruppe tumorer, kan forløbet af sygdommen variere. Oprettelse metoder til mere præcis vurdering af neoplasi aggressivitet ville være af værdi ved vurderingen af ​​prognosen for de enkelte patienter med mavekræft.

Podocalyxin-lignende 1 (PODXL) er en anti-klæbende transmembrane glycoprotein tilhører CD34 familien . Det udtrykkes normalt ved nyre podocytterne [3], hæmopoietiske stamceller [4], vaskulær endotel [5], og bryst epitelceller [6].

Den kliniske betydning af PODXL i kræft progression er undersøgt i forskellige carcinoma typer, først som en stamcelle markør i testikelkræft [7]. En senere resultat er, at tumor-cellespecifik PODXL ekspression er forbundet med en mere aggressiv fænotype og komplikationer hos flere kræfttyper, for eksempel i bryst [6], prostata [8], ovarie- [9], kolorektal [10- 12], urotelial blære [13], pancreas [14], og periampullary kræft [15].

Formålet med denne undersøgelse var at undersøge PODXL udtryk i mavekræft at afsløre sin mulige rolle i aggressivitet og prognose. Vi besluttede at anvende to PODXL antistoffer, der genkender forskellige epitoper: et monoklonalt in-house HES9 antistof og et kommercielt tilgængeligt polyklonalt HPA2110 antistof. For nylig lærte vi, at disse to antistoffer er uafhængige markører for dårlig prognose i kolorektal cancer [12]. De to antistoffer kan genkende to grupper af patienter med tyktarmskræft, som begge har en dårlig prognose; Kombineret anvendelse af disse antistoffer viste en patientgruppe med endnu værre prognose [16].

Materialer og metoder

Patienter

Undersøgelsen omfattede 337 konsekutive patienter, som gennemgik kirurgi for histologisk verificerede gastrisk adenocarcinom ved Institut for Kirurgi, Helsinki University Hospital, fra 1983 til 1999. Diagnose og iscenesættelse i henhold til UICC klassifikation forudsat 100 (29,7%) stadie IA-IB, 41 (12,2%) fase II, 96 (28,5%) stadie IIIA-IIIB, og 100 (29,7%) stadie IV patienter. Lymfeknuder-node metastaser fandt sted i 184 (55%) og fjernmetastaser i 93 (28%) tilfælde. Median alder var 66 år (spændvidde 30-87), og 163 (48%) var kvinder og 174 (52%) mænd. Hel eller delvis gastrektomi med udvidet (D2-D2 +) lymphadenectomy blev udført i 34 (10%) patienter, total gastrektomi med D1-lymphadenectomy i 161 (48%), og subtotal gastrektomi med D1-lymphadenectomy i 142 (42%). I alt blev 143 (43%) patienter opereret med helbredende hensigt, mens 176 (52%) undergik palliativ kirurgi. Ingen fik neoadjuverende behandling, men 32 (9%) patienter fik postoperativ adjuverende behandling (28 kemoterapi, 2 strålebehandling; 2 fik begge). Overlevelsesdata og dødsårsag til november 2013 kom fra patientjournaler, folkeregistret Centre of Finland, og Finlands Statistik.

Undersøgelsen blev godkendt af Kirurgisk etiske komité i Helsinki University Hospital (Dnro HUS 226 /E6 /06, udvidelse TMK02 §66 2013/04/17), og den nationale tilsynsmyndighed for Velfærd og sundhed gav tilladelse til at bruge de vævsprøver uden individuel tilladelse i denne retrospektive undersøgelse (Valvira Dnro 10041 /06.01.03.01 /2012).

vævsprøver

formalin-fikseret og paraffin-embedded kirurgiske vævsprøver kom fra arkiverne i Patologisk Institut. Patienten væv blev de-identificeret og analyseret anonymt. Histopatologisk repræsentative områder af tumor prøver blev defineret og markeret på haematoxylin- og eosin-farvede objektglas. Tre kerner fra hver tumor blok blev udtaget med 0,6 mm læreboremaskiner og indlejret i en ny paraffin blok af en halvautomatisk væv microarrayer (Tissue arrayer 1, Beecher Instruments Inc., Silver Spring, MD, USA). Af de seks væv-array-blokke forberedt, hver indeholdt 24-192 tumorprøver. Dele af 4 um hver blev skåret og behandlet for immunhistokemi.

Antistoffer

Vi sammenlignede to PODXL antistoffer mod forskellige epitoper. Det polyklonale antistof (HPA2110, Atlas Antibodies, Stockholm, Sverige) blev dannet mod et peptid med aminosyreresterne 278-415 af PODXL, og det monoklonale in-house-antistof HES9 [12] anerkender aminosyreresterne 189-192 af PODXL . Begge epitoper forekommer i det ekstracellulære del af PODXL molekylet. Den epitop sekvens af HPA2110 matcher tre protein kodning PODXL splejsningsvarianter med 100% (PODXL 001, 005, og 201, det humane protein Atlas). Den fjerde splejsningsvariant kampe med 87% (PODXL 202). Epitopen sekvenser af HES9 matcher 100% med alle splejsningsvarianter. Antistofferne er beskrevet detaljeret [12,17,18].

Immunhistokemi

Snit blev fikseret på objektglas og tørret i 12 til 24 timer ved 37 ° C, derefter blev deparaffiniseret i xylen og rehydreret gennem gradvis aftagende koncentrationer af ethanol til destilleret vand. For antigen hentning blev snit behandlet i en forbehandling Module (Lab Vision Corp., Fremont, CA, USA) i Tris-HCI-buffer (pH 8,5) i 20 minutter ved 98 ° C. Sektioner blev farvet i en Autostainer 480 (Lab Vision) af Dako REAL EnVision Detection System, Peroxidase /DAB +, Kanin /Mus (Dako, Glostrup, Danmark). Objektglassene blev behandlet i 5 minutter med 0,3% Dako REAL Peroxidase-blokeringsopløsning til at blokere endogene peroxidaser. Efterfølgende blev objektglas inkuberet i 1 time med et polyklonalt (fortynding 1: 250 = 2,5 ug /ml) eller monoklonalt antistof (fortynding 1: 500 = 5 ug /ml) ved stuetemperatur. Som en positiv kontrol for hver farvning serie brugte vi prøver fra nyrevæv.

Scoring af immunoreaktivitet

HPA2110 og HES9 immunopositivitet blev kåret i alle tilgængelige tumor kerner. Cytoplasmatisk PODXL og HES9 immunopositivitet blev scoret som med 0 til 3 baseret på intensiteten af ​​cancercelle immunreaktivitet, og den højeste score af de tre kerner tjente til yderligere analyse. Negativ immunoreaktivitet blev scoret som 0, diffus svag cytoplasmatisk positivitet som 1, moderat positiv eller fokalt stærkt positiv intensitet som 2, og homogent stærk intensitet som 3. Alle prøver blev scoret uafhængigt af to forskere (AL og JH) blindede til kliniske status og resultatet data. Prøver med disharmoniske scoringer blev revurderet, og konsensus score tjente til yderligere analyse. Vi var i stand til at behandle og score HPA2110 farvning i 266 og HES9 farvning i 279 prøver.

Statistisk analyse

Foreninger mellem HPA2110 og HES9 positivitet og clinicopathologic variabler blev vurderet ved chi-square test eller Fishers eksakte test. Korrelationer mellem de to podocalyxin antistoffer blev vurderet af Spearman korrelation test. Sygdomsspecifikke overlevelse blev beregnet fra datoen for kirurgi til døden fra mavekræft. Salg

Overlevelseskurver blev konstrueret ifølge Kaplan-Meier-metoden og sammenlignet med logrank test. For univariable og multivariable overlevelse analyse Cox proportional hazard model havde følgende kovarianter indtastet: alder, køn, stadie, grad, Laurens klassificering, tumorstørrelse, tumor placering, PODXL udtryk bestemt af HPA2110 farvning og HES9 farvning, DNA ploidi, S- fasefraktionen, Ki-67-ekspression, og p53-ekspression. Stage, klasse, Laurens klassificering, tumorstørrelse, DNA ploidi, S-fasen fraktion, og udtryk for PODXL, HES9, Ki-67, og p53 blev opført som kategoriske kovariater. DNA ploidi og S-fase-fraktionen var blevet vurderet tidligere ved flowcytometri, og p53, og Ki-67 vævsekspression ved immunhistokemi [19,20]. En p-værdi på < 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Alle statistiske analyser blev udført med IBM SPSS Statistics-version 20,0 til Mac (IBM Corporation, Armonk, NY, USA).

Resultater

Immunhistokemi

Cytoplasmatisk HPA2110 reaktivitet, evalueret i 266 sager, var negativ i 113 (42,5%), svagt positiv i 120 (45,1%), moderat positiv i 29 (10,9%), og stærkt positiv i 4 (1,5%) tilfælde. Af de 279 sager med held farvet for cytoplasmatisk udtryk ved HES9, 67 (24,0%) var negative, 137 (49,1%) svagt positive, 54 (19,4%) moderat positiv, og 21 (7,5%) stærkt positiv. I den endelige analyse, svag til stærkt positiv HPA2110 og HES9 immunreaktivitet (scores 1-3) blev betragtet som positivt udtryk. Repræsentative billeder af immunfarvninger er i figur 1. Både HPA2110 og HES9 farves jævnt hele cytoplasmaet, med nukleare eller celle membranøs immunopositivitet mærkbar. Den cytoplasmatiske udtryk for podocalyxin af de to forskellige antistoffer HPA2110 og HES9 korreleret (r _{s = 0,455, p < 0001, Spearman rang korrelation test).}

Foreningen af ​​HPA2110 og HES-9 med klinisk-patologiske variabler og biomarkører

De sammenslutninger af HPA2110 og HES9 med klinisk-patologiske variable og molekylære biomarkører var som følger: positive (scores 1-3) HPA2110 farvning blev forbundet med tarmkræft type (p < 0,001), positiv HES9 farvning var forbundet med alder over 66 (p = 0,001), med tarmkræft (p < 0,001), og med små (≤ 5 cm) tumorstørrelse (p = 0,024). Både HPA2110 og HES9 blev forbundet med høj S-fase fraktion (SPF, p = 0,022; p = 0,010) og høj proliferationsindeks af tumoren (Ki-67, p = 0,003; p = 0,001) (tabel 1 og 2).

overlevelse analyser

Positiv HPA2110 udtryk angivet en mavekræft-specifikke 5-års overlevelse på 24% (95% CI 16,9-31,1), sammenlignet med patienter med negativ HPA2110 farvning med 5-års overlevelse på 43% (95% CI 33,7-52,9) (p = 0,001 log-rank test) (figur 2 og tabel 3). Den mavekræft-specifikke 5-års overlevelse af patienter med HES9-positive tumor farvning var 30% (95% CI 23,1-36,1), og for dem med negativ farvning, 40% (95% CI 27,7-52,1; p = 0,130 log -rank test) (figur 2).

i undergruppe analyse, HPA2110 var en betydelig markør for dårlig prognose i grupper af yngre patienter (under 66 år) (p = 0,006), og for mandlige køn (p = 0,002), diffus type kræft (p = 0,001), og fase I patienter (p = 0,048) (figur 3 og tabel 3). I de øvrige undergrupper undersøgte, havde HPA2110 ikke tjene som en prognostisk markør

HPA2110 udtryk forblev betydelige i multivariabel analyse. (HR = 3,17; 95% CI 1,37-7,34; p = 0,007; tabel 4). Andre uafhængige prognostiske faktorer i multivariabel analyse var scenen, kvalitet, og DNA ploidi.

Diskussion

Vi viser her, at kræft-specifikke 5-års overlevelse var signifikant bedre for mavecancerpatienter har en PODXL -negativ tumor. Faktisk, blandt etape 1 patienter med PODXL-negative tumorer, kun én patient døde af kræft. I multivariable analyse, positiv PODXL udtryk fungerede som en uafhængig markør for dårlig prognose. Positive PODXL ekspression både af det polyklonale antistof HPA2110 og det monoklonale antistof HES9 var forbundet med høj SPF ved flowcytometri og Ki-67-farvning, som begge er markører for høj proliferation af cancerceller og dermed dårligere prognose.

Positive ekspression af PODXL af begge antistoffer var forbundet med tarmkræft type, men en PODXL-negativ tumor viste sig ikke at være en prognostisk markør i tarmkræft. Omvendt cancer-specifikke 5-års overlevelse i undergruppen af ​​diffuse form kræft var betydeligt værre for patienter med en PODXL-positiv tumor. Generelt har diffus form kræft været forbundet med dårligere prognose end har den intestinale typen [21].

Så vidt vi ved, er vi de første til at rapportere en prognostisk værdi for PODXL i mavekræft. Det har været tydeligt i flere andre typer kræft, ligesom bryst [6], prostata [8], æggestokkene [9], kolorektal [10-12], urotelial blære [13], pancreas [14], og periampullary kræft [15] . En undersøgelse af kolorektal cancer show overensstemmelse mellem primære tumorer og tilsvarende lymfeknudemetastaser i de enkelte patienter, og PODXL udtryk er også stadig upåvirket af neoadjuverende strålebehandling. Disse resultater understøtter den kliniske anvendelighed af PODXL som en markør for dårlig prognose [22]. Her har vi ikke studerer PODXL udtryk i lymfeknudemetastaser i mavekræft, og ingen af ​​patienterne i denne kohorte modtaget præoperativ kemoterapi, selv om det er i øjeblikket temmelig rutine. Disse virkninger af præoperativ kemoterapi på PODXL udtryk i mavekræft behov for yderligere vurdering.

Vi brugte to antistoffer, der genkender PODXL, et kommercielt tilgængeligt polyklonalt antistof HPA2110 og en in-house-monoklonalt antistof HES9 [16]. Immunoexpression af det monoklonale antistof HES9 var stærkere end med det polyklonale antistof. Begge antistoffer farvede jævnt i hele cytoplasmaet, og hverken farves kerner eller cellemembranen. Sorten i farvningsintensitet og distribution var spinklere ved brug af polyklonale antistof, hvilket gør scoring vanskeligere. Dybest set PODXL er et transmembrant molekyle, og det blev derfor overraskende ikke at finde det på cellemembraner i gastrisk kræftceller ved enten antistof. Betydningen af ​​cytoplasmatiske, ikke-membranagtige, udtryk for PODXL, dets rolle og funktion, har brug for yderligere vurdering.

Disse forskellige antistoffer, vi brugte genkende ulige dele af PODXL molekylet, sandsynligvis forklare, hvorfor deres udtryk i nogle af de prøver afveg og resultaterne var ikke identiske. Kaprio et al. [16], anvendes disse samme antistoffer i kolorektal cancer, og fundet en interessant forskel mellem farvningsmønstrene. Det polyklonale antistof positivitet var membranøs [9,10], men det monoklonale antistof positivitet var tydelig hovedsagelig i cytoplasmaet. I kolorektal cancer, stærk positivitet med både det monoklonale og polyklonale antistof afslørede en undergruppe af patienter med endnu værre overlevelse. Vi kunne ikke finde denne form for sammenhæng i mavekræft prøver. Samlet set positivitet blandt mavecancerpatienter var lavere end hos patienter med tyktarmskræft. I kolorektal cancer var omkring 94% af tilfældene positive for PODXL med disse to antistoffer, mens der i mavekræft positivitet dukkede op i 76% tilfælde med det monoklonale antistof og i 58% med polyklonale antistof. Hyppigheden af ​​PODXL positivitet i gastrisk cancer var tæt på den, der ses i bryst- og ovariecancer (40% og 67%) [6,9].

PODXL er et transmembrant glycoprotein. Det er blevet vist, at muciner, der er også glycoproteiner, spiller en rolle i epitelial til mesenkymale overgang (EMT) [23,24]. Rolle PODXL i cancer er ukendt, men det kan spekuleret, at også PODXL kan have en rolle i EMT. EMT kan forklare, hvorfor patienter med forhøjet PODXL udtryk har dårligere overlevelse.

Styrken af ​​denne undersøgelse er et stort patient kohorte med gastrisk kræft og en lang opfølgning med pålidelig klinisk opfølgning tid og overlevelsesdata. Ved TMA-teknik, er det kun små områder af tumoren evalueret i forhold til hel-vævssnit. I kolorektal cancer, Larsson et al. [22] fandt, at anvendelse af hele sektioner tillod identifikation af et større antal tumorer som PODXL-positive end gjorde TMA-analyse. Fordi PODXL udtryk er heterogen, kan brug af TMA-teknik føre til undervurdering af positive tilfælde. Scoring af både monoklonale-antistof og polyklonalt-antistofekspression var for nogle prøver vanskelige; tilfælde med kun nogle få cancerceller og dem, ved hvilken værdien af ​​kræftcellerne var uidentificerbare blev derfor udelukket fra analysen. Dette til dels forklarer det store antal udstødte tilfælde. På den anden side, TMA teknik muliggør analyse af store patientkohorter med en homogen farvning metode.

Afslutningsvis PODXL immunfarvning tjener som en uafhængig markør for dårlig prognose i gastrisk cancer. Det er, så vidt vi ved, den første rapport om den prognostiske værdi af PODXL udtryk i mavekræft. Fremtidige undersøgelser bør bekræfte denne forening og løse de mekanismer, som PODXL påvirker udvikling og adfærd af mavekræft.

Tak

Vi takker Päivi Peltokangas og Elina Aspiala for deres fremragende teknisk bistand.

• Typer af mavekræft
• PLoS ONE: DBGC: En Database for Human Gastrisk Cancer