PLoS ONE: podocalixina come marcatore prognostico nei gastrico Cancer

Estratto

Sfondo

podocalixina-simile 1 (PODXL) è una glicoproteina cellulare-adesione associata con fenotipo tumore aggressivo e prognosi infausta a varie forme di cancro. Lo scopo di questo studio era di valutare l'espressione PODXL nel cancro gastrico mediante l'uso di due anticorpi differenti.

Metodi

Per microarrays tumore dei tessuti e immunoistochimica abbiamo valutato l'espressione PODXL in campioni tumorali da 337 pazienti che ha subito un intervento chirurgico per adenocarcinoma gastrico di Helsinki University Hospital. Abbiamo utilizzato due diversi anticorpi:. HPA2110, che è un anticorpo policlonale e un anticorpo monoclonale in-house chiamata HES9, per valutare l'associazione di espressione PODXL con le variabili clinico-patologiche e la sopravvivenza del paziente

Risultati

PODXL colorazione è positivo per l'anticorpo policlonale in 153 casi (57,5%) e l'anticorpo monoclonale in 212 (76%). espressione anticorpo policlonale è stata associata con il tipo di cancro intestinale (p < 0,001). Monoclonale colorazione anticorpo è stato associato con età superiore ai 66 (p = 0,001), con il cancro intestinale (p < 0,001), e con il formato piccolo tumore (≤ 5 cm, p = 0,024). Entrambi gli anticorpi sono stati associati con frazione alta fase S (p = 0.022; p = 0.010), e indice di proliferazione tumorale (Ki-67; p = 0,003; p = 0.001). PODXL positività per l'anticorpo policlonale indicato ridotta sopravvivenza a 5 anni-specifici gastrica-cancro del 24,0% (95% CI 16,9-31,1), rispetto al 43,3% (95% CI 33,7-52,9) nei pazienti con PODXL negatività (p = 0.001 ). Il risultato è rimasto significativo nell'analisi multivariata. (HR = 3.17; 95% CI 1,37-7,34, p = 0,007)

Conclusione

Nel cancro gastrico, PODXL espressione dal HPA2110 anticorpo policlonale è un marcatore indipendente di prognosi infausta

Visto:. Laitinen A, Böckelman C, Hagström J, Kokkola A, fermer C, Nilsson O, et al. (2015) podocalixina come marcatore prognostico nel cancro gastrico. PLoS ONE 10 (12): e0145079. doi: 10.1371 /journal.pone.0145079

Editor: Yves St-Pierre, INRS, Canada |

Ricevuto: 15 settembre 2015; Accettato: 29 Novembre 2015; Pubblicato: 16 Dicembre 2015

Copyright: © 2015 Laitinen et al. Questo è un articolo ad accesso libero distribuito sotto i termini della Creative Commons Attribution License, che permette l'uso senza restrizioni, la distribuzione e la riproduzione con qualsiasi mezzo, a condizione che l'autore originale e la fonte sono accreditati

disponibilità dei dati: Tutti i dati rilevanti sono all'interno della carta

Finanziamento:. Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni dal Finska Läkaresällskapet, il Kurt och Doris Palander Foundation, la Fondazione Juselius Sigrid, e Medicinska understödsföreningen Liv och Hälsa. Fujirebio Diagnostics AB e Onson Consulting fornito un sostegno sotto forma di stipendi per gli autori CF e ON, ma non ha avuto alcun ruolo aggiuntivo nel disegno dello studio, la raccolta e l'analisi dei dati, la decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto.

Competere interessi:. gli autori hanno dichiarato che non esistono interessi in competizione

Introduzione

Negli ultimi decenni, l'incidenza del cancro gastrico è diminuito, soprattutto nei paesi occidentali, a quanto pare a causa della diminuzione dell'incidenza di Helicobacter pylori
, per una migliore igiene, e di vivere meno affollata. Dato che il cancro gastrico ha una prognosi infausta, è ancora a livello globale la seconda causa più comune di morte per cancro [1]. Il tasso di sopravvivenza a 5 anni, nonostante la chirurgia curativa, è solo circa il 10-30% [2]. L'elevata mortalità è in gran parte a causa di una diagnosi tardiva.

Il nodo Metastasi (TNM) classificazione UICC tumore è di gran lunga il sistema di classificazione prognostica più consistente oggi. Tuttavia, anche all'interno degli stessi tumori gruppo fase, il corso della malattia può variare. La creazione di metodi per la valutazione più accurata della aggressività neoplasia sarebbe di valore al momento di valutare la prognosi dei singoli pazienti con cancro gastrico.

podocalixina-simile 1 (PODXL) è una glicoproteina transmembrana antiadesivo appartenente alla famiglia CD34 . Si esprime normalmente podociti renali [3], le cellule progenitrici emopoietiche [4], endoteli vascolari [5], e le cellule epiteliali della mammella [6].

Il significato clinico di PODXL nella progressione del cancro è stato studiato in vari tipi di carcinoma, prima come un marcatore di cellule staminali nel tumore del testicolo [7]. Un risultato successivamente è che espressione PODXL cellule tumorali-specifico è associato con un fenotipo più aggressivo ed esito negativo in numerosi tipi di cancro, per esempio, in seno [6], prostata [8], dell'ovaio [9], colorettale [10- 12], della vescica uroteliale [13], del pancreas [14], e il cancro periampollare [15].

Lo scopo di questo studio era di valutare l'espressione PODXL nel carcinoma gastrico per rivelare il suo possibile ruolo in aggressività e la prognosi. Abbiamo deciso di usare due anticorpi che riconoscono PODXL diversi epitopi: un anticorpo monoclonale HES9 in-house e un anticorpo policlonale HPA2110 disponibile in commercio. Recentemente abbiamo appreso che questi due anticorpi sono indicatori indipendenti di prognosi sfavorevole nel carcinoma del colon-retto [12]. I due anticorpi in grado di riconoscere due gruppi di pazienti affetti da cancro del colon-retto, entrambi i quali hanno una prognosi sfavorevole; uso combinato di questi anticorpi ha rivelato un gruppo di pazienti con prognosi ancora peggiore [16].

Materiali e Metodi

I pazienti

Lo studio comprendeva 337 pazienti consecutivi sottoposti a chirurgia per istologicamente verificato adenocarcinoma gastrico presso il Dipartimento di Chirurgia, Helsinki University Hospital, dal 1983 al 1999. Diagnosi e messa in scena secondo la classificazione UICC fornito 100 (29,7%) stadio IA-IB, 41 (12,2%) di stadio II, 96 (28,5%) stadio IIIA-IIIB, e 100 stage (29,7%) IV pazienti. metastasi linfonodali avvenuti in 184 (55%) e metastasi a distanza in 93 casi (28%). L'età media era di 66 anni (range 30-87), e 163 (48%) erano donne e 174 (52%) degli uomini. gastrectomia totale o parziale con estesa (D2-D2 +) linfoadenectomia è stata eseguita in 34 (10%) pazienti, gastrectomia totale con D1-linfoadenectomia in 161 (48%), e gastrectomia subtotale con D1-linfoadenectomia in 142 (42%). In totale, 143 (43%) pazienti sono stati operati con intento curativo, mentre 176 (52%) sono stati sottoposti chirurgia palliativa. Nessuno ha ricevuto un trattamento neoadiuvante, ma 32 (9%) pazienti hanno ricevuto un trattamento adiuvante post-operatoria (28 chemioterapia, la radioterapia 2; 2 hanno ricevuto entrambi). I dati di sopravvivenza e la causa della morte, fino novembre 2013 provenivano da cartelle cliniche dei pazienti, il Centro di registro della popolazione della Finlandia, e Statistics Finland.

Lo studio è stato approvato dal Comitato Etico chirurgica di Helsinki University Hospital (Dnro HUS 226 /E6 /06, l'estensione TMK02 § 66 2013/04/17) e l'autorità nazionale di controllo del Welfare e Salute ha dato il permesso di utilizzare i campioni di tessuto senza il consenso dell'individuo in questo studio retrospettivo (Valvira Dnro 10041 /06.01.03.01 /2012).

i campioni di tessuto

campioni di tessuto chirurgici inclusi in paraffina fissati in formalina proviene dagli archivi del Dipartimento di Patologia. I tessuti del paziente sono stati de-identificati e analizzati in forma anonima. Istopatologico aree rappresentative di campioni tumorali sono stati definiti e marcati su vetrini haematoxylin- eosina macchiato. Tre nuclei di ogni blocco di tumore sono stati campionati con punzoni 0,6 mm e incorporati in un nuovo blocco di paraffina da un microarrayer tessuto semi-automatico (Tissue Arrayer 1, Beecher Instruments Inc., Silver Spring, MD, USA). Dei sei blocchi di tessuto-array preparate, ciascuna conteneva 24-192 campioni di tumore. Le sezioni di 4 micron ciascuna sono stati tagliati e trattati per immunoistochimica.

Anticorpi

Abbiamo messo a confronto due anticorpi PODXL contro diversi epitopi. L'anticorpo policlonale (HPA2110, Atlas Anticorpi, Stoccolma, Svezia) è stata sollevata contro un peptide con i residui di aminoacidi 278-415 di PODXL, e monoclonale in-house anticorpi HES9 [12] riconosce i residui di aminoacidi 189-192 di PODXL . Entrambi epitopi verificano nella parte extracellulare della molecola PODXL. La sequenza epitopo della HPA2110 corrisponde a tre proteine ​​di codifica PODXL varianti di splicing con il 100% (PODXL 001, 005, e 201, la proteina umana Atlas). La quarta variante di splicing corrisponde con il 87% (PODXL 202). Le sequenze epitopo della HES9 partite al 100% con tutte le varianti di splicing. Gli anticorpi sono descritte in dettaglio [12,17,18].

L'immunoistochimica

Le sezioni sono state fissate su vetrini ed essiccate per 12 a 24 ore a 37 ° C, poi sono stati deparaffinizzati in xilene e reidratato attraverso gradualmente decrescenti concentrazioni di etanolo per acqua distillata. Per il recupero dell'antigene, le sezioni sono state trattate in un modulo di pre-trattamento (Lab Vision Corp., Fremont, CA, USA) in Tris-HCl (pH 8.5) per 20 minuti a 98 ° C. Le sezioni sono state colorate in un Autostainer 480 (Lab Vision) da parte del sistema di rilevamento Dako REALE EnVision, perossidasi /DAB +, Coniglio /Mouse (Dako, Glostrup, Danimarca). I vetrini sono stati trattati per 5 minuti con 0,3% Dako REALE perossidasi-Blocking Solution per bloccare perossidasi endogene. Successivamente, i vetrini sono stati incubati per 1 ora con un anticorpo policlonale (diluizione 1: 250 = 2,5 mcg /ml) o l'anticorpo monoclonale (diluizione 1: 500 = 5 mg /ml) a temperatura ambiente. Come controllo positivo per ogni serie colorazione abbiamo utilizzato campioni di tessuto renale.

punteggio di immunoreattività

HPA2110 e HES9 immunopositività è stata classificata in tutti i core disponibili tumorali. PODXL citoplasmatica e HES9 immunopositività è stato segnato da 0 a 3 anni in base all'intensità di immunoreattività delle cellule tumorali, e il punteggio più alto dei tre nuclei serviti per ulteriori analisi. immunoreattività negativo è stato segnato come 0, diffondere debole positività citoplasmatica come 1, moderatamente positivo o intensità focally fortemente positivo 2, e omogeneo forte intensità 3. Tutti i campioni sono stati segnati in modo indipendente da due ricercatori (AL) e JH in cieco per lo stato clinico ed esito dati. I campioni con punteggio discordanti sono stati rivalutati, e il punteggio di consenso serviti per ulteriori analisi. Siamo stati in grado di elaborare e segnare HPA2110 colorazione in 266 e HES9 colorazione in 279 campioni.

L'analisi statistica

Le associazioni tra HPA2110 e HES9 positività e variabili clinico-patologici sono stati valutati con il test chi-quadrato o test esatto di Fisher. Le correlazioni tra i due anticorpi podocalixina sono stati valutati dal test di correlazione di Spearman. la sopravvivenza specifica malattia è stato calcolato a partire dalla data di intervento chirurgico per morte per cancro gastrico.

Le curve di sopravvivenza sono stati costruiti secondo il metodo di Kaplan-Meier e confrontate con il test logrank. Per l'analisi della sopravvivenza univariata e multivariata, il modello di rischio proporzionale di Cox aveva le seguenti covariate inseriti: età, sesso, stadio, grado, Laurens classificazione, dimensioni del tumore, localizzazione del tumore, espressione PODXL determinato da HPA2110 colorazione e colorazione HES9, ploidia del DNA, S- frazione di fase, Ki-67 espressione, e l'espressione di p53. Stadio, grado, classificazione Laurens, dimensioni del tumore, ploidia DNA, frazione fase S, e l'espressione di PODXL, HES9, Ki-67 e p53 sono stati inseriti come covariate categoriche. ploidia del DNA e della frazione S-fase erano stati valutati in precedenza mediante citometria di flusso, e p53, e l'espressione del tessuto Ki-67 mediante immunoistochimica [19,20]. Un valore p < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo. Tutte le analisi statistiche sono state effettuate con IBM SPSS Statistics versione 20.0 per Mac (IBM Corporation, Armonk, NY, USA).

Risultati

L'immunoistochimica

citoplasmatica HPA2110 reattività, valutati in 266 casi, è stato negativo in 113 (42,5%), debolmente positivo in 120 (45,1%), moderatamente positivo in 29 (10,9%), e fortemente positivo in 4 casi (1,5%). Dei 279 casi macchiati con successo per l'espressione citoplasmatica da HES9, 67 (24,0%) sono risultati negativi, 137 (49,1%) debolmente positivi, 54 (19,4%) moderatamente positiva, e 21 (7,5%) fortemente positiva. In ultima analisi, debole per forza HPA2110 positivo e HES9 immunoreattività (punteggi 1-3) è stato considerato come espressione positiva. Immagini rappresentative della immunostainings sono in Fig 1. Sia HPA2110 e HES9 macchiati in modo uniforme in tutto il citoplasma, con immunopositività membranosa nucleare né cellule evidente. L'espressione citoplasmatica delle podocalixina dai due diversi anticorpi HPA2110 e HES9 correlata (r _{s = 0.455, p < 0,001, test di correlazione di Spearman).}

Associazione di HPA2110 e HES-9 con le variabili clinico-patologiche e biomarcatori

Le associazioni di HPA2110 e HES9 con variabili clinico-patologiche e biomarcatori molecolari sono le seguenti: positivo (punteggi 1-3) HPA2110 colorazione è stata associata con il tipo di cancro intestinale (p < 0,001), colorazione HES9 positivo è stato associato con età superiore a 66 (p = 0,001), con il cancro intestinale (p < 0,001), e con piccole dimensioni del tumore (≤ 5 cm) (p = 0,024). Sia HPA2110 e HES9 sono stati associati con alta frazione fase S (SPF, p = 0,022; p = 0,010) e alto indice di proliferazione del tumore (Ki-67, p = 0,003; p = 0,001) (Tabelle 1 e 2).

sopravvivenza analizza

espressione HPA2110 positivo indicato una sopravvivenza a 5 anni gastrica specifico per il cancro del 24% (95% CI 16,9-31,1), rispetto ai pazienti con colorazione HPA2110 negativo con 5 anni sopravvivenza del 43% (95% CI 33,7-52,9) (p = 0,001 log-rank test) (Figura 2 e Tabella 3). La sopravvivenza a 5 anni gastrica cancro-specifica di pazienti con tumore colorazione HES9-positivi è stata del 30% (95% CI 23,1-36,1), e per quelli con colorazione negativa, il 40% (95% CI 27,7-52,1; p = 0,130 log Test -rank) (Figura 2).

nel sottogruppo, HPA2110 era un indicatore significativo di prognosi sfavorevole in gruppi di pazienti più giovani (età sotto 66 anni) (p = 0.006), e per il sesso maschile (p = 0,002), il cancro diffuso tipo (p = 0,001), e fase I pazienti (p = 0,048) (Fig 3 e tabella 3). Negli altri sottogruppi studiati, HPA2110 non serviva come marcatore prognostico

L'espressione HPA2110 rimasta significativa nell'analisi multivariata. (HR = 3.17; 95% CI 1,37-7,34; p = 0,007; Tabella 4). Altri fattori prognostici indipendenti di analisi multivariata erano allo stadio, grado, e ploidia DNA.

Discussione

Mostriamo qui che la sopravvivenza a 5 anni cancro-specifica è stata significativamente migliore per i pazienti affetti da cancro gastrico hanno una PODXL tumore -negativa. In realtà, tra fase 1 pazienti con tumori PODXL-negativi, solo un paziente è morto di cancro. All'analisi multivariata, l'espressione PODXL positivo servito come un marcatore indipendente prognosi infausta. espressione positiva PODXL sia dalla HPA2110 anticorpo policlonale e l'anticorpo monoclonale HES9 era associata con alta SPF mediante citometria di flusso e Ki-67 colorazione, essendo entrambi marcatori di alta proliferazione delle cellule tumorali e quindi della prognosi peggiore.

Positive espressione di PODXL da entrambi gli anticorpi è stata associata con intestinale tipo di cancro, ma un tumore PODXL-negativo ha dimostrato di non essere un marcatore prognostico nel cancro intestinale. Al contrario, cancro-specifica sopravvivenza a 5 anni nel sottogruppo di cancro tipo diffuso era significativamente peggiore per i pazienti con un tumore PODXL-positivo. In generale, il cancro tipo diffuso è stato associato ad una prognosi peggiore rispetto ha il tipo intestinale [21].

Per quanto a nostra conoscenza, siamo i primi a segnalare un valore prognostico per PODXL nel cancro gastrico. Questo è stato evidente per molti altri tipi di cancro, come il seno [6], della prostata [8], ovarico [9], del colon-retto [10-12], vescica uroteliale [13], del pancreas [14], e il cancro periampollare [15] . Uno studio sul colon-retto spettacolo cancro concordanza tra i tumori primari e le corrispondenti metastasi linfonodali nei singoli pazienti, e l'espressione PODXL rimane inalterato da radioterapia neoadiuvante. Questi risultati supportano l'utilità clinica di PODXL come marcatore di prognosi negativa [22]. Qui non abbiamo studiare l'espressione PODXL in metastasi linfonodali nel carcinoma gastrico, e nessuno dei pazienti in questa coorte ha ricevuto chemioterapia preoperatoria, anche se è attualmente piuttosto di routine. Questi effetti della chemioterapia preoperatoria sull'espressione PODXL nel carcinoma gastrico necessita di ulteriori valutazioni.

Abbiamo usato due anticorpi che riconoscono PODXL, un anticorpo policlonale HPA2110 disponibile in commercio e un anticorpo monoclonale in-house HES9 [16]. Immunoexpression dal HES9 anticorpo monoclonale era più forte dal anticorpo policlonale. Entrambi gli anticorpi colorati in modo uniforme in tutto il citoplasma, e nessuno dei due nuclei, né membrana cellulare macchiati. La varietà di intensità e di distribuzione colorazione era slighter quando si utilizza l'anticorpo policlonale, rendendo il punteggio più difficile. Fondamentalmente PODXL è una molecola transmembrana, e quindi è stato sorprendente non trovare su membrane delle cellule in cellule di cancro gastrico da uno degli anticorpi. Il significato di citoplasmatica, non membranoso, espressione di PODXL, il suo ruolo e la funzione, hanno bisogno di ulteriore valutazione.

Questi anticorpi diversi che abbiamo usato riconoscere parti disuguali della molecola PODXL, probabilmente spiegare perché la loro espressione in alcune delle esemplari differivano ed i risultati non erano identici. Kaprio et al. [16], usato questi stessi anticorpi nel cancro del colon-retto, e ha trovato una differenza interessante tra i pattern di colorazione. L'anticorpo positività policlonale era membranoso [9,10], ma, l'anticorpo monoclonale positività era evidente soprattutto nel citoplasma. Nel cancro del colon-retto, forte positività sia con il monoclonale e l'anticorpo policlonale rivelato un sottogruppo di pazienti con sopravvivenza anche di peggio. Non abbiamo trovato questo tipo di correlazione in campioni di cancro gastrico. Nel complesso, positività tra i pazienti affetti da cancro gastrico era inferiore nei pazienti con tumore del colon. Nel cancro del colon-retto circa il 94% dei casi sono stati positivi per PODXL con questi due anticorpi, mentre in gastrica positività cancro apparso nel 76% dei casi con l'anticorpo monoclonale e nel 58% con l'anticorpo policlonale. La frequenza di PODXL positività nel carcinoma gastrico era vicino a quello visto nel cancro al seno e alle ovaie (40% e 67%) [6,9].

PODXL è una glicoproteina transmembrana. E 'stato dimostrato che le mucine, che sono anche glicoproteine, giocano un ruolo nella transizione epitelio mesenchimale (EMT) [23,24]. Il ruolo di PODXL nel cancro è sconosciuta, ma può essere ipotizzato che anche PODXL può avere un ruolo di EMT. EMT potrebbe spiegare il motivo per cui i pazienti con elevata espressione PODXL hanno più poveri la sopravvivenza.

Il punto di forza di questo studio è una grande coorte di pazienti con cancro gastrico e un lungo follow-up con il tempo di follow-up clinico affidabile e dati di sopravvivenza. Mediante la tecnica TMA, solo piccole aree del tumore vengono valutati rispetto alle sezioni intero tessuto. Nel cancro del colon-retto, Larsson et al. [22] trovato che l'uso di sezioni intere permesso l'identificazione di un numero maggiore di tumori come PODXL-positivi che ha fatto analisi TMA. Poiché l'espressione PODXL è eterogeneo, uso della tecnica TMA può portare a una sottostima dei casi positivi. Punteggio di entrambi monoclonale-anticorpo e l'espressione policlonale-anticorpo è stato per alcuni esemplari difficili; casi con solo alcune cellule tumorali e quelli in cui il valore delle cellule tumorali era identificabile stati quindi esclusi dall'analisi. Questo, in parte, spiega l'alto numero di casi esclusi. D'altra parte, la tecnica TMA consente analisi di grandi coorti di pazienti con un metodo di colorazione omogenea.

In conclusione, PODXL immunostaining serve come un marcatore indipendente prognosi infausta nel cancro gastrico. Questo è, a nostra conoscenza, la prima relazione sul valore prognostico di espressione PODXL nel cancro gastrico. Studi futuri dovrebbero confermare questa associazione e risolvere i meccanismi con cui PODXL colpisce lo sviluppo e il comportamento di cancro gastrico.

Riconoscimenti

grazie Päivi Peltokangas e Elina Aspiala per la loro eccellente assistenza tecnica.

• Tipi di cancer
• PLoS ONE: DBGC: un database di umano cancro gastrico