PLoS ONE: Podocalyxin als een prognostische marker in Gastric Cancer

De abstracte

Achtergrond

Podocalyxin-like 1 (PODXL) is een cel-adhesie glycoproteïne geassocieerd met agressieve tumor fenotype en slechte prognose in verschillende vormen van kanker. Het doel van deze studie was om PODXL expressie in maagkanker te onderzoeken door gebruik van twee verschillende antilichamen.

Methods

Op tumor tissue microarrays en immunohistochemie onderzochten we PODXL expressie in tumor monsters van 337 patiënten die een operatie onderging voor adenocarcinoom van de maag in Helsinki University Hospital. We gebruikten twee verschillende antilichamen. HPA2110, dat is een polyklonaal antilichaam en een in-house monoklonaal antilichaam genaamd HES9, de associatie van PODXL expressie met clinicopathologic variabelen en overleving van patiënten te onderzoeken

Resultaten

PODXL kleuring was positief door het polyklonale antilichaam in 153 (57,5%) gevallen bij het monoklonale antilichaam 212 (76%). Polyklonaal antilichaam expressie werd geassocieerd met intestinale kankersoort (p < 0,001). Monoklonaal antilichaam kleuring was geassocieerd met leeftijd boven 66 (p = 0,001), met darmkanker (p < 0,001), en met kleine tumorgrootte (≤ 5 cm; p = 0,024). Beide antilichamen werden geassocieerd met een hoge S fase fractie (p = 0,022; p = 0,010) en hoge tumor proliferatie-index (Ki-67; p = 0,003; p = 0,001). PODXL positiviteit door het polyklonale antilichaam aangegeven verminderde maag-kankerspecifieke 5-jaars overleving van 24,0% (95% Cl 16,9-31,1), vergeleken met 43,3% (95% Cl 33,7-52,9) voor patiënten met PODXL negativiteit (p = 0,001 ). Het resultaat bleef significant in multivariate analyse. (HR = 3,17; 95% CI 1,37-7,34, p = 0,007)

Conclusie

In maagkanker, PODXL expressie door het polyklonale antilichaam HPA2110 is een onafhankelijke marker van een slechte prognose

Visum:. Laitinen A, Böckelman C, Hagström J, Kokkola A, fermer C, O Nilsson, et al. (2015) Podocalyxin als een prognostische marker bij maagkanker. PLoS ONE 10 (12): e0145079. doi: 10.1371 /journal.pone.0145079

Editor: Yves St-Pierre, INRS, CANADA

Ontvangen: 15 september 2015; Aanvaard: 29 november 2015; Gepubliceerd: 16 december 2015

Copyright: © 2015 Laitinen et al. Dit is een open toegang Artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Data Beschikbaarheid: Alle relevante gegevens zijn binnen het papier

Financiering:. Deze studie werd ondersteund door subsidies van Finska Läkaresällskapet, de Kurt och Doris Palander Foundation, het Sigrid Juselius Foundation en Medicinska understödsföreningen Liv och Hälsa. Fujirebio Diagnostics AB en Onson Consulting steun verleend in de vorm van salarissen voor auteurs CF en ON, maar had geen aanvullende rol in de onderzoeksopzet, gegevensverzameling en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript.

concurrerende belangen. de auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

in de afgelopen decennia is het aantal gevallen van maagkanker is afgenomen, vooral in westerse landen, blijkbaar te wijten aan de afnemende incidentie van Helicobacter pylori
, tot betere hygiëne, en minder druk leven. Omdat maagkanker heeft een slechte prognose, is het nog steeds wereldwijd de tweede meest voorkomende oorzaak van kanker-gerelateerde dood [1]. De 5-jaarsoverleving, ondanks curatieve chirurgie, is slechts ongeveer 10-30% [2]. De hoge sterfte is vooral te wijten aan late diagnose.

De UICC Tumor Node metastase (TNM) classificatie is veruit de meest consistente prognostische classificatiesysteem vandaag. Echter, zelfs binnen hetzelfde stadium groep tumoren, het verloop van de ziekte kan variëren. Werkwijzen voor het maken nauwkeuriger beoordeling van de neoplasie agressiviteit van waarde zijn bij de beoordeling van de prognose voor de individuele patiënten met maagkanker.

Podocalyxin-like 1 (PODXL) is een anti-hechtmiddel transmembraan glycoproteïne van de familie CD34 . Het wordt gewoonlijk uitgedrukt door de nieren podocytes [3], hematopoiëtische progenitorcellen [4], vasculaire endotheel [5], en borst epitheelcellen [6].

De klinische significantie van PODXL in kankervooruitgang is onderzocht in verschillende soorten carcinoom, eerst als een stamcel marker in zaadbalkanker [7]. Een later bevinding is dat tumorcel-specifieke PODXL expressie is geassocieerd met een meer agressieve fenotype en negatieve uitkomst tussen verschillende soorten kanker, bijvoorbeeld in borstkanker [6], prostate [8], ovariale [9], colorectale [10- 12], urotheel blaas [13], alvleesklier [14] en periampullaire kanker [15].

Het doel van deze studie was om te onderzoeken PODXL expressie bij maagkanker zijn mogelijke rol in agressiviteit en prognose onthullen. We besloten twee PODXL antilichamen die verschillende epitopen gebruikt: een monoklonaal interne HES9 antilichaam en een commercieel verkrijgbaar polyklonaal antilichaam HPA2110. Onlangs hebben we geleerd dat beide antilichamen onafhankelijke markers van slechte prognose bij colorectale kanker [12]. De twee antilichamen kunnen twee groepen van colorectale kanker patiënten, beiden hebben een slechte prognose te herkennen; gecombineerde gebruik van deze antilichamen bleek een groep patiënten met een nog slechtere prognose [16].

Materialen en methoden

Patiënten

De studie omvatte 337 opeenvolgende patiënten die een operatie ondergingen voor histologisch geverifieerd adenocarcinoom van de maag bij de afdeling Heelkunde, Helsinki University Hospital, van 1983 tot 1999. Diagnose en enscenering volgens de UICC klassenindeling van 100 (29,7%) stadium IA-IB, 41 (12,2%) fase II, 96 (28,5%) stadium IIIA-IIIB, en 100 (29,7%) stadium IV patiënten. Lymfe-node metastasen opgetreden in 184 (55%) en metastasen op afstand in 93 (28%) gevallen. De mediane leeftijd was 66 jaar (range 30-87), en 163 (48%) waren vrouwen en 174 (52%) mannen. Gehele of gedeeltelijke gastrectomie met uitgebreide (D2-D2 +) lymphadenectomy werd uitgevoerd in 34 (10%) van de patiënten, de totale gastrectomie met D1-lymphadenectomy in 161 (48%), en subtotale gastrectomie met D1-lymphadenectomy in 142 (42%). In totaal werden 143 (43%) van de patiënten geopereerd in opzet curatieve, terwijl 176 (52%) ondergingen palliatieve chirurgie. Geen ontvangen neoadjuvante behandeling, maar 32 (9%) patiënten postoperatieve adjuvante behandeling (28 chemotherapie, radiotherapie 2; 2 ontvangen beide). Survival gegevens en de oorzaak van de dood tot november 2013 kwam uit patiëntendossiers, het bevolkingsregister Centre of Finland, en Statistiek Finland.

Het onderzoek werd goedgekeurd door de Surgical ethische commissie van Helsinki University Hospital (Dnro HUS 226 /E6 /06, uitbreiding TMK02 § 66 2013/04/17) en de nationale toezichthoudende autoriteit van Welzijn en Volksgezondheid gaf toestemming om de weefselmonsters zonder individuele toestemming te gebruiken in deze retrospectieve studie (Valvira Dnro 10041 /06.01.03.01 /2012).

tissue monsters

formaline gefixeerde en chirurgische monsters in paraffine ingebedde weefsel afkomstig uit het archief van de afdeling Pathologie. De patiënt weefsels werden de-geïdentificeerd en anoniem geanalyseerd. Histopathologisch representatieve gebieden van de tumor monsters werden gedefinieerd en aangegeven op haematoxylin- en eosine gekleurde dia's. Drie kernen uit elke tumor blok werden bemonsterd met een 0,6-mm punchers en ingebed in een nieuw paraffine blok door een semi-automatische weefsel microarrayprinter (Tissue Arrayer 1, Beecher Instruments Inc., Silver Spring, MD, USA). Van de zes weefsel-array-blokken opgesteld, elk geborgen 24-192 tumor samples. Secties van 4 um werden elk gesneden en verwerkt voor immunohistochemie.

Antilichamen

We vergeleken twee PODXL antilichamen tegen verschillende epitopen. Het polyklonale antilichaam (HPA2110 Atlas Antibodies, Stockholm, Zweden) werd opgewekt tegen een peptide met de aminozuur residuen 278-415 van PODXL en het monoklonale antilichaam interne HES9 [12] herkent de aminozuurresten 189-192 van PODXL . Beide epitopen optreden in het extracellulaire deel van het molecuul PODXL. De epitoop sequentie van de HPA2110 overeenkomt drie eiwitcoderende PODXL splice varianten 100% (PODXL 001, 005 en 201, het menselijke eiwit Atlas). De vierde splice variant overeenkomt met 87% (PODXL 202). De epitoop sequenties van de HES9 100% overeenkomt met splice-varianten. De antilichamen zijn beschreven [12,17,18].

Immunohistochemie

De coupes werden gefixeerd op objectglaasjes en gedroogd gedurende 12 tot 24 uur bij 37 ° C, vervolgens werden van paraffine ontdaan in xyleen en gerehydrateerd door middel van geleidelijk afnemende concentraties ethanol gedestilleerd water. Voor antigen retrieval, werden gedeelten voorbehandeling Module (Lab Vision Corp., Fremont, CA, USA) in Tris-HCl buffer (pH 8,5) behandeld gedurende 20 minuten bij 98 ° C. Secties werden gekleurd in een Autostainer 480 (Lab Vision) door de Dako REAL EnVision Detection System, Peroxidase /DAB +, Konijn /muis (Dako, Glostrup, Denemarken). De objectglaasjes werden gedurende 5 minuten met 0,3% Dako REAL Peroxidase-Blocking Solution endogeen peroxidase te blokkeren. Vervolgens werden de objectglaasjes geïncubeerd gedurende 1 uur met een polyklonaal (verdunning 1: 250 = 2,5 ug /ml) of monoklonaal antilichaam (verdunning 1: 500 = 5 ug /ml) bij kamertemperatuur. Als een positieve controle voor elke kleuring serie gebruikten we monsters van nierweefsel.

Scoring van immunologische

HPA2110 en HES9 immunopositivity werd ingedeeld in alle beschikbare tumor cores. Cytoplasmatische PODXL en HES9 immunopositivity werd gescoord als 0-3 op basis van de intensiteit van de kankercel immunoreactiviteit, en de hoogste score van de drie kernen diende voor verdere analyse. Negatieve immunoreactiviteit werd gescoord als 0, diffuse zwakke cytoplasmatische positiviteit als 1, gematigd positief of focaal sterk positief intensiteit als 2, en homogeen sterke intensiteit 3. Alle monsters werden onafhankelijk van elkaar gescoord door twee onderzoekers (AL en JH) blind voor de klinische toestand en het resultaat gegevens. Exemplaren met dissonante scores werden opnieuw geëvalueerd, en de consensus score diende voor verdere analyse. We waren in staat om te verwerken en te scoren HPA2110 kleuring in 266 en HES9 kleuring in 279 monsters.

Statistische analyse

Verenigingen tussen HPA2110 en HES9 positiviteit en clinicopathologic variabelen werden beoordeeld door de chikwadraattoets of Fisher's exact test. Correlaties tussen de twee podocalyxin antilichamen werden beoordeeld door de Spearman correlatie-test. Ziektespecifieke overleving werd berekend vanaf de operatie gedood door maagkanker.

Overlevingscurven werd volgens de Kaplan-Meier-methode vervaardigd en vergeleken met de logrank proef. Voor univariabele en multivariabele survival analyse, het Cox proportionele hazard model had de volgende covariaten opgenomen: leeftijd, geslacht, stadium, rang, Laurens indeling, tumorgrootte, tumor locatie, PODXL expressie bepaald door HPA2110 kleuring en HES9 vlekken, DNA ploïdie, S- fase fractie, Ki-67 expressie en p53 expressie. Stage, rang, Laurens indeling, grootte van de tumor, DNA ploïdie, de S-fase-fractie, en de expressie van PODXL, HES9, Ki-67 en p53 werden ingevoerd als categorische covariaten. DNA ploïdie en S fase fractie was eerder beoordeeld door flowcytometrie en p53 en Ki-67 weefselexpressie door immunohistochemie [19,20]. Een p-waarde van < 0,05 werd beschouwd als statistisch significant. Alle statistische analyses werden gedaan met IBM SPSS Statistics versie 20.0 van Mac (IBM Corporation, Armonk, NY, USA).

Resultaten

Immunohistochemie

Cytoplasmatische HPA2110 reactiviteit, geëvalueerd 266 gevallen, was negatief in 113 (42,5%), zwak positief in 120 (45,1%), gematigd positief in 29 (10,9%) en sterk positief in 4 (1,5%) gevallen. Van de 279 gevallen met succes gekleurd voor cytoplasmatische expressie door HES9, 67 (24,0%) waren negatief, 137 (49,1%) zwak positief, 54 (19,4%) gematigd positief, en 21 (7,5%) sterk positief. In de uiteindelijke analyse, zwak tot sterk positief HPA2110 en HES9 immunoreactiviteit (scores 1-3) werd beschouwd als een positieve uitdrukking. Representatieve beelden van immunokleuringen zijn in figuur 1. Beide HPA2110 en HES9 gekleurd gelijkmatig door het cytoplasma, nucleaire noch cel membraneuze immunopositivity merkbaar. De cytoplasmatische expressie van podocalyxin door de twee verschillende antilichamen HPA2110 en HES9 gecorreleerd (r _{s = 0,455, p < 0001, Spearman rangcorrelatietoets).}

Vereniging van HPA2110 en HES-9 met klinisch-pathologische variabelen en biomarkers

De associaties van HPA2110 en HES9 met klinische en pathologische variabelen en moleculaire biomarkers als volgt: positief (score 1-3) HPA2110 kleuring was geassocieerd met intestinale kankersoort (p < 0,001), positieve HES9 kleuring was geassocieerd met leeftijd boven de 66 (p = 0,001), met darmkanker (p < 0,001), en met kleine (≤ 5 cm) grootte van de tumor (p = 0,024). Zowel HPA2110 en HES9 werden geassocieerd met een hoge S fase fractie (SPF, p = 0,022; p = 0,010) en hoge proliferatie-index van de tumor (Ki-67, p = 0,003; p = 0,001) (tabel 1 en 2).

Survival analyseert

Positieve HPA2110 uitdrukking gaf een maagkanker-specifieke 5-jaars overleving van 24% (95% BI 16,9-31,1), in vergelijking met patiënten met een negatieve HPA2110 kleuring met 5-jaar overleving van 43% (95% CI 33,7-52,9) (p = 0,001 log-rank test) (afbeelding 2 en tabel 3). De gastrische kanker-specifieke 5-jaars overleving van patiënten met HES9-positieve tumor kleuring was 30% (95% Cl 23,1-36,1), en voor die met negatieve kleuring, 40% (95% CI 27,7-52,1; p = 0,130 log -rank test) (figuur 2).

in subgroepanalyse HPA2110 een significante marker slechte prognose in groepen van jongere patiënten (leeftijd onder 66 jaar) (p = 0,006) en mannelijk geslacht (p = 0,002), diffuse type kanker (p = 0,001), en stadium I patiënten (p = 0,048) (figuur 3 en Tabel 3). In de subgroepen bestudeerd, heeft HPA2110 niet als prognostische marker

De HPA2110 expressie bleef significant in multivariate analyse. (HR = 3,17; 95% CI 1,37-7,34; p = 0,007; Tabel 4). Andere onafhankelijke prognostische factoren bij multivariate analyse waren stadium, rang, en DNA ploïdie.

Discussie

We zien hier dat kanker-specifieke 5-jaars overleving was significant beter voor maagkanker patiënten met een PODXL -negatieve tumor. Eigenlijk onder fase 1 patiënten met PODXL-negatieve tumoren, slechts één patiënt overleed aan kanker. In multivariate analyse, positieve PODXL uitdrukking diende als een onafhankelijke marker van een slechte prognose. Positieve PODXL expressie zowel het polyklonale antilichaam HPA2110 en het monoklonale antilichaam HES9 werd geassocieerd met hoge SPF door flowcytometrie en Ki-67 kleuring, beide markers van hoge proliferatie van kankercellen en dus slechtere prognose.

positieve expressie van PODXL door beide antilichamen werd geassocieerd met intestinale soort kanker, maar een PODXL-negatieve tumor bleek een prognostische marker in darmkanker te zijn. Omgekeerd kankerspecifieke 5-jaars overleving in de subgroep van diffuse kankersoort significant slechter voor patiënten met een PODXL-positieve tumor. Over het algemeen heeft diffuse soort kanker in verband gebracht met een slechtere prognose dan heeft de intestinale soort [21].

Aan het beste van onze kennis, zijn wij de eerste die een voorspellende waarde voor PODXL melden bij maagkanker. Dit is duidelijk al een aantal andere soorten kanker, zoals borstkanker [6], prostaat [8], eierstok- [9], colorectale [10-12], urotheelcellen blaas [13], de alvleesklier [14], en periampullaire kanker [15] . Een studie naar darmkanker tonen concordantie tussen primaire tumoren en bijbehorende lymfekliermetastasen bij individuele patiënten, en PODXL meningsuiting blijft ook beïnvloed door neoadjuvante radiotherapie. Deze bevindingen ondersteunen de klinische bruikbaarheid van PODXL als een merker voor slechte prognose [22]. Hier hebben we geen studie PODXL expressie in lymfeknoop metastasen bij maagkanker, en geen van de patiënten in dit cohort ontvangen preoperatieve chemotherapie, hoewel het nog vrij routine. Deze effecten van preoperatieve chemotherapie op PODXL expressie bij maagkanker moet verdere evaluatie.

We gebruikten twee antilichamen die PODXL, een commercieel verkrijgbaar polyklonaal antilichaam HPA2110 en een eigen monoklonaal antilichaam HES9 [16]. Immunoexpression door het monoklonale antilichaam HES9 was sterker dan het polyklonale antilichaam. Beide antilichamen gelijkmatig gekleurd hele cytoplasma en geen kernen of gekleurde celmembraan. De verscheidenheid in kleuring intensiteit en de verspreiding was geringer bij het gebruik van het polyklonale antilichaam, waardoor het scoren moeilijker. PODXL feite een transmembraan molecuul, en daarom werd verrassend niet vinden op celmembranen bij maagkanker cellen door ofwel antilichaam. De betekenis van cytoplasmatische, niet-vliezige expressie van PODXL, de rol en functie verder te worden geëvalueerd.

De verschillende antilichamen herkennen we gebruikten ongelijke delen van de PODXL molecuul, waarschijnlijk verklaren waarom hun expressie in sommige specimens verschilden en resultaten waren niet identiek. Kaprio et al. [16], gebruikt dezelfde antilichamen in colorectale kanker, en een interessante verschil tussen de kleurpatronen. Het polyklonale antilichaam positiviteit was membraneuze [9,10], maar het monoklonale antilichaam positiviteit bleek voornamelijk in het cytoplasma. In colorectale kanker, sterke positiviteit met zowel monoklonale en polyklonale antilichaam onthulde een subgroep van patiënten met nog slechtere overleving. We hebben niet dit soort correlatie in maagkanker monsters te vinden. Over het algemeen, positiviteit bij maagkanker patiënten was lager dan in de dikke darm kanker patiënten. In colorectale kanker waren ongeveer 94% van de gevallen positief voor PODXL met deze twee antilichamen, terwijl in maagkanker positiviteit verscheen in 76% gevallen het monoklonale antilichaam en in 58% van het polyklonale antilichaam. De frequentie van PODXL positiviteit bij maagkanker was dicht bij dat gezien in de borst- en eierstokkanker (40% en 67%) [6,9].

PODXL is een transmembraan glycoproteïne. Het is aangetoond dat mucinen, die ook glycoproteïnen een rol spelen bij epitheliale naar mesenchymale transitie (EMT) [23,24]. De rol van PODXL bij kanker is niet bekend maar het kan worden gespeculeerd dat ook PODXL een rol in EMT hebben. EMT kunnen verklaren waarom patiënten met een hoog PODXL expressie hebben slechtere overleving.

De kracht van deze studie is een grote patiëntenpopulatie met maagkanker en een lange follow-up met betrouwbare klinische follow-up tijd en overleving gegevens. De TMA techniek worden slechts kleine delen van de tumor geëvalueerd in vergelijking met hele weefselcoupes. In colorectale kanker, Larsson et al. [22] vonden dat het gebruik van grote delen maakte identificatie van een groter aantal tumoren PODXL-positieve dan wel TMA analyse. Omdat PODXL meningsuiting is heterogeen, kunnen gebruik maken van de TMA techniek leiden tot een onderschatting van de positieve gevallen. Scoring van zowel monoklonale antilichamen en polyklonale antilichamen expressie was enige moeilijke specimens; gevallen met slechts enkele kankercellen en die waarin de waarde van de kankercellen was identificeerbaar zijn dus van de analyse uitgesloten. Dit, voor een deel, verklaart het grote aantal gevallen uitgesloten. Anderzijds, de TMA techniek maakt analyse van grote patiëntcohorten met een homogene kleuring werkwijze.

Concluderend PODXL immunokleuring fungeert als een onafhankelijke marker van slechte prognose bij maagkanker. Dit is, voor zover wij weten, het eerste verslag over de prognostische waarde van PODXL expressie bij maagkanker. Toekomstige studies moeten deze vereniging te bevestigen en het oplossen van de mechanismen die PODXL van invloed op de ontwikkeling en het gedrag van maagkanker.

Dankwoord

Wij danken Päivi Peltokangas en Elina Aspiala voor hun uitstekende technische ondersteuning.

• Soorten maagkanker
• PLoS ONE: DBGC: een database van Human maagkanker