PLOS ONE: Podocalyxin som en prognostisk markör i Gastric Cancer

Abstrakt

Bakgrund

Podocalyxin liknande en (PODXL) är en cell-adhesion glykoprotein i samband med aggressiv tumör fenotyp och dålig prognos i flera former av cancer. Syftet med denna studie var att undersöka PODXL uttryck i gastric cancer genom användning av två olika antikroppar.

Metoder

Efter tumörvävnads mikroarrayer och immunohistokemi utvärderade vi PODXL uttryck i tumörprover från 337 patienter som opererades för adenocarcinom i Helsingfors Universitetssjukhuset. Vi använde två olika antikroppar. HPA2110, som är en polyklonal antikropp och en in-house monoklonal antikropp kallad HES9 att undersöka sammanslutning av PODXL uttryck med clinicopathologic variabler och patientöverlevnad

Resultat

PODXL färgning var positiv med den polyklonala antikroppen i 153 (57,5%) fall och av den monoklonala antikroppen i 212 (76%). Polyklonal antikroppsexpression var associerad med tarmcancer typ (p < 0,001). Monoklonal antikroppsfärgning var associerad med ålder över 66 (p = 0,001), med tarmcancer (p < 0,001), och med liten tumörstorlek (≤ 5 cm; p = 0,024). Båda antikropparna var associerade med högt S-fas fraktionen (p = 0,022; p = 0,010), och hög tumörproliferationsindex (Ki-67; p = 0,003; p = 0,001). PODXL positivitet av den polyklonala antikroppen indikerade reducerad gastrisk cancerspecifika 5-års överlevnad på 24,0% (95% CI 16,9-31,1), jämfört med 43,3% (95% CI 33,7-52,9) för patienter med PODXL negativitet (p = 0,001 ). Resultatet förblev betydande i flerdimensionell analys. (HR = 3,17; 95% CI 1,37-7,34, p = 0,007) katalog

Slutsats

I magcancer, är PODXL uttryck av den polyklonala antikroppen HPA2110 en oberoende markör för dålig prognos

Citation:. Laitinen A, Böckelman C, Hagström J, Karleby A, fermer C, Nilsson O, et al. (2015) Podocalyxin som en prognostisk markör i magcancer. PLoS ONE 10 (12): e0145079. doi: 10.1371 /journal.pone.0145079

Redaktör: Yves St-Pierre, INRS, KANADA

Mottagna: 15 september 2015, Accepteras: 29 november 2015, Publicerad: 16 december 2015

Copyright: © 2015 Laitinen et al. Detta är en öppen tillgång artikel distribueras enligt villkoren i Creative Commons Attribution License, som tillåter obegränsad användning, distribution och reproduktion i alla medier, förutsatt den ursprungliga författaren och källan kredit

datatillgänglighet: Alla relevanta uppgifter är inom pappers-

Finansiering:. Denna studie har finansierats med bidrag från Finska Läkaresällskapet, Kurt oCH Doris Palander Foundation, Sigrid Juselius stiftelse, och Medicinska understödsföreningen Liv och Hälsa. Fujirebio Diagnostics AB och Onson Consulting givit stöd i form av löner för författare CF och ON, men inte har någon ytterligare roll i studiedesign, insamling och analys data, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet.

konkurrerande intressen:. författarna har deklarerat att inga konkurrerande intressen finns

Introduktion

under de senaste decennierna har förekomsten av magsäckscancer minskat, särskilt i västvärlden, uppenbarligen på grund av minskande förekomst av Helicobacter pylori
, bättre hygien och mindre trångt levande. Eftersom magcancer har en dålig prognos, är det fortfarande globalt den näst vanligaste orsaken till cancerrelaterad död [1]. 5-års överlevnad, trots kurativ kirurgi, är bara ca 10-30% [2]. Den höga dödligheten beror främst på sen diagnos.

UICC Tumör Node metastaser (TNM) klassificering är den i särklass mest konsekventa prognostic klassificeringssystem idag. Men även inom samma tumörer skede grupp, kan sjukdomsförloppet varierar. Skapa metoder för noggrannare bedömning av neoplasi aggressivitet skulle vara av värde vid bedömningen prognosen för enskilda patienter med magcancer.

Podocalyxin liknande en (PODXL) är en anti-vidhäftande transmembranglykoproteinet tillhör CD34 familjen . Det är normalt uttrycks av njur podocyter [3], hemopoetiska progenitorceller [4], vaskulär endotel [5], och bröst epitelceller [6].

Den kliniska betydelsen av PODXL i cancer progression har undersökts i olika karcinom typer, först som en stamcellmarkör i testikelcancer [7]. En senare upptäckt är att tumörcellspecifik PODXL expression är associerad med en mer aggressiv fenotyp och ogynnsamt utfall i flera cancertyper, t ex i bröst [6], prostata [8], ovarian [9], kolorektal [10- 12], uroteliala blåsa [13], bukspottskörteln [14], och periampullär cancer [15].

Syftet med denna studie var att undersöka PODXL uttryck i magcancer att avslöja sin eventuella roll i aggressivitet och prognos. Vi bestämde oss för att använda två PODXL antikroppar som känner igen olika epitoper: en monoklonal internt HES9 antikropp och en kommersiellt tillgänglig polyklonal HPA2110 antikroppar. Nyligen lärde vi oss att dessa två antikroppar är oberoende markörer för dålig prognos vid kolorektalcancer [12]. De två antikropparna kan känna igen två grupper av patienter med kolorektalcancer, som båda har en dålig prognos; kombinerad användning av dessa antikroppar visade en patientgrupp med ännu sämre prognos [16].

Material och metoder

Patienter

Studien omfattade 337 konsekutiva patienter som genomgick operation för histologiskt kontrolleras magcancer vid institutionen för kirurgi, Helsingfors Universitetssjukhuset, från 1983 till 1999. Diagnos och iscensättning enligt UICC klassificeringen förutsatt 100 (29,7%) stadium IA-IB, 41 (12,2%) steg II, 96 (28,5%) steg IIIA-IIIB, och 100 (29,7%) stadium IV patienter. Lymfkörtelmetastaser inträffade i 184 (55%) och fjärrmetastaser i 93 (28%) fall. Medianåldern var 66 år (intervall 30-87), och 163 (48%) var kvinnor och 174 (52%) män. Helt eller delvis gastrektomi med förlängd (D2-D2 +) lymfkörtlar utfördes i 34 (10%) patienter, total gastrektomi med D1-lymfkörtlar i 161 (48%), och delsumma gastrektomi med D1-lymfkörtlar i 142 (42%). Totalt var 143 (43%) patienter som opererats med kurativ intention, medan 176 (52%) genomgick palliativ kirurgi. Ingenting mottaget neoadjuvant behandling, men 32 (9%) patienter erhöll postoperativa adjuvant behandling (28 kemoterapi, två radioterapi; 2 mottog båda). Överlevnadsdata och dödsorsak tills November 2013 kom från patientjournaler, Befolkningsregistercentralen i Finland, och Statistikcentralen.

Studien godkändes av den kirurgiska etiska kommittén vid Helsingfors universitetssjukhus (Dnr HUS 226 /E6 /06, förlängning TMK02 §66 2013/04/17) och Tillstånds- och tillsynsverket för social- och hälsovården gav tillåtelse att använda vävnadsprover utan individuellt samtycke i denna retrospektiva studie (Valvira Dnr 10041 /06.01.03.01 /2012).

vävnads~~POS=TRUNC prover~~POS=HEADCOMP

formalinfixerade och paraffininbäddade kirurgiska vävnadsprover kom från arkiv Department of Pathology. Patient vävnader avidentifieras och analyseras anonymt. Histopatologiskt representativa områden av tumörprover definierades och markeras på haematoxylin- och eosin-färgade objektglas. Tre kärnor från varje tumör blocket Prover togs med 0,6 mm hålslag och inbäddad i ett nytt paraffin blocket med en halvautomatisk vävnad microarrayer (Tissue Arrayer 1 Beecher Instruments Inc., Silver Spring, MD, USA). Av de sex vävnads array block som bereds innehöll varje 24-192 tumörprover. Delar av 4 pm varje skars och bearbetades för immunhistokemi.

Antikroppar

Vi jämförde två PODXL antikroppar mot olika epitoper. Den polyklonala antikroppen (HPA2110, Atlas Antibodies, Stockholm, Sverige) togs fram mot en peptid med aminosyraresterna 278-415 av PODXL, och den monoklonala in-house-antikropp HES9 [12] känner igen aminosyraresterna 189-192 av PODXL . Båda epitoper förekommer i den extracellulära delen av PODXL molekylen. Epitopen sekvensen av HPA2110 matchar tre proteinkodande PODXL splitsvarianter med 100% (PODXL 001, 005, och 201, The Human Protein Atlas). Den fjärde splitsningsvariant matcher med 87% (PODXL 202). Epitopen sekvenser av HES9 matchar 100% med alla splitsvarianter. Antikropparna beskrivs i detalj [12,17,18].

Immunohistokemi

Sektioner fixerades på objektglas och torkades under 12 till 24 timmar vid 37 ° C, därefter avparaffinerades i xylen och uppblött genom gradvis minskande koncentrationer av etanol till destillerat vatten. För antigenåtervinning, var sektionerna behandlas i en förbehandlingsmodul (Lab Vision Corp., Fremont, CA, USA) i Tris-HCl-buffert (pH 8,5) under 20 minuter vid 98 ° C. Sektioner färgades i en Autostainer 480 (Lab Vision) av Dako REAL EnVision Detection System, Peroxidase /DAB +, kanin /mus (Dako, Glostrup, Danmark). Objektglasen behandlades under 5 minuter med 0,3% Dako REAL Peroxidase-blockeringslösning för att blockera endogena peroxidaser. Därefter tillsattes glasen inkuberades under 1 timme med en polyklonal (spädning 1: 250 = 2,5 | j, g /ml) eller monoklonal antikropp (spädning 1: 500 = 5 | ig /ml) vid rumstemperatur. Som en positiv kontroll för varje färgningsserie använde vi prover från njurvävnad.

Poängsättning av immunoreaktivitet

HPA2110 och HES9 immunopositivity graderades i alla tillgängliga tumör kärnor. Cytoplasmisk PODXL och HES9 immunopositivity bedömdes som 0-3 baserat på intensiteten av cancercell immunreaktivitet, och den högsta poängen av de tre kärnorna tjänade för vidare analys. Negativ immunreaktivitet bedömdes som 0, diffus svag cytoplasmisk positivitet som en måttligt positiv eller fokalt starkt positiv intensitet som två, och homogent stark intensitet som 3. Alla prover bedömdes oberoende av två forskare (AL och JH) förblindade till klinisk status och utfall data. Prover med disharmoniska poäng var omvärderas, och konsensus poäng eras för vidare analys. Vi kunde bearbeta och göra HPA2110 färgning i 266 och HES9 färgning i 279 prover.

Statistisk analys

Samband mellan HPA2110 och HES9 positivitet och clinicopathologic variabler bedömdes av chitvåtest eller Fishers exakta test. Samband mellan de två podocalyxin antikropparna bedömdes av Spearman korrelationstest. Sjukdomsspecifik överlevnad beräknades från dagen för kirurgi till döden från magcancer.

Överlevnadskurvor konstruerades i enlighet med Kaplan-Meier-metoden och jämfördes med logrank testet. För univariable och variabelöverlevnadsanalys, hade Cox proportionella riskmodell följande kovariater in: ålder, kön, scen, kvalitet, Laurens klassificering, tumörstorlek, tumörplacering, PODXL uttryck bestäms av HPA2110 färgning och HES9 färgning, DNA ploiditet, S- fas fraktion, Ki-67 uttryck, och p53-expression. Scen, kvalitet, Laurens klassificering, tumörstorlek, DNA ploiditet, S-fas fraktion och uttryck av PODXL, HES9, Ki-67, och p53 infördes som kategoriska variablerna. DNA ploidi och S-fas fraktion hade bedömts tidigare av flödescytometri, och p53, och Ki-67 vävnadsuttryck genom immunhistokemi [19,20]. Ett p-värde på < 0,05 ansågs statistiskt signifikant. Alla statistiska analyser gjordes med IBM SPSS Statistics version 20.0 för Mac (IBM Corporation, Armonk, NY, USA).

Resultat

Immunohistokemi

cytoplasmatisk HPA2110 reaktivitet, utvärderas 266 fall, var negativ i 113 (42,5%), svagt positiv i 120 (45,1%), måttligt positivt 29 (10,9%), och starkt positiv i 4 (1,5%) fall. Av de 279 fall framgångsrikt färgade för cytoplasmisk expression av HES9, 67 (24,0%) var negativa, 137 (49,1%) svagt positivt, 54 (19,4%) måttligt positiva, och 21 (7,5%) starkt positiv. I den slutliga analysen, svagt starkt positiv HPA2110 och HES9 immunreaktivitet (poäng 1-3) ansågs vara positivt uttryck. Representativa bilder av immunostainings är i fig 1. Både HPA2110 och HES9 färgas jämnt i hela cytoplasman, med kärn- eller cellmembran immunopositivity märkbar. Den cytoplasmatiska uttryck podocalyxin av de två olika antikroppar HPA2110 och HES9 korrelerade (r _{s = 0,455, p < 0001, Spearmans rangkorrelationstest).}

Association of HPA2110 och HES-9 med kliniskt patologiska variabler och biomarkörer

sammanslutningar av HPA2110 och HES9 med kliniskt patologiska variabler och molekylära biomarkörer var följande: positiva (poäng 1-3) HPA2110 färgning i samband med tarmcancer typ (p < 0,001), positiv HES9 färgning i samband med ålder över 66 (p = 0,001), med tarmcancer (p < 0,001), och med små (≤ 5 cm) tumörstorlek (p = 0,024). Både HPA2110 och HES9 var associerade med högt S-fas fraktionen (SPF, p = 0,022; p = 0,010) och hög proliferationsindex av tumören (Ki-67, p = 0,003; p = 0,001) (Tabell 1 och 2).

överlevnad analyserar

Positiva HPA2110 uttryck indikerade en magcancer specifik 5-års överlevnad på 24% (95% CI 16,9-31,1), jämfört med patienter med negativ HPA2110 färgning med 5-års överlevnaden av 43% (95% CI 33,7-52,9) (p = 0,001 log-rank test) (figur 2 och tabell 3). Den magcancer specifika 5-års överlevnad av patienter med HES9-positiv tumör färgning var 30% (95% CI 23,1-36,1), och för dem med negativ färgning, 40% (95% CI 27,7-52,1; p = 0,130 log -rank test) (figur 2).

i subgruppsanalys, HPA2110 var en betydande markör för dålig prognos i grupper av yngre patienter (ålder i 66 år) (p = 0,006), och för manligt kön (p = 0,002), diffus typ cancer (p = 0,001), och steg I patienter (p = 0,048) (Fig 3 och tabell 3). I studerade andra undergrupper, gjorde HPA2110 inte tjäna som en prognostisk markör

HPA2110 uttryck förblev betydande i flerdimensionell analys. (HR = 3,17; 95% CI 1,37-7,34; p = 0,007; tabell 4). Andra oberoende prognostiska faktorer i flerdimensionell analys var scenen, kvalitet, och DNA-ploiditet.

Diskussion

Vi visar här att cancerspecifik 5-års överlevnad var signifikant bättre för cancerpatienter gastric har en PODXL -negativ tumör. Faktiskt, bland etapp 1 patienter med PODXL-negativa tumörer, endast en patient dog av cancer. I flerdimensionell analys, positiv PODXL uttryck fungerade som en oberoende markör för dålig prognos. Positiv PODXL uttryck både genom den polyklonala antikroppen HPA2110 och den monoklonala antikroppen HES9 var associerat med hög solskyddsfaktor genom flödescytometri och Ki-67 färgning, båda är markörer för hög spridning av cancerceller och därmed sämre prognos.

Positiv uttryck av PODXL av båda antikropparna var associerad med tarmcancer typ, men en PODXL-negativ tumör visat sig vara en prognostisk markör i tarmcancer. Omvänt, cancerspecifik 5-årsöverlevnaden i subgruppen diffus typ cancer var betydligt sämre för patienter med PODXL-positiv tumör. Generellt har diffus typ cancer förknippats med sämre prognos än har tarm typ [21].

Så vitt vi vet är vi de första att rapportera ett prognostiskt värde för PODXL i magcancer. Detta har varit uppenbart för flera andra cancertyper, som bröst [6], prostata [8], ovarian [9], kolorektal [10-12], uroteliala blåsa [13], bukspottskörteln [14], och periampullär cancer [15] . En studie på tjocktarmscancer visar överensstämmelse mellan primära tumörer och motsvarande lymfkörtelmetastaser i enskilda patienter och PODXL uttryck förblir också opåverkade av neoadjuvant strålbehandling. Dessa resultat stöder den kliniska användbarheten av PODXL som en markör för dålig prognos [22]. Här har vi inte studera PODXL uttryck i lymfkörtelmetastaser i magcancer, och ingen av patienterna i denna grupp fick preoperativ kemoterapi, även om det är för närvarande ganska rutin. Dessa effekter av preoperativ kemoterapi på PODXL uttryck i magcancer behöver ytterligare utvärdering.

Vi använde två antikroppar som känner igen PODXL, en kommersiellt tillgänglig polyklonal antikropp HPA2110 och en in-house monoklonal antikropp HES9 [16]. Immunoexpression av den monoklonala antikroppen HES9 var starkare än med den polyklonala antikroppen. Båda antikropparna färgas jämnt över hela cytoplasman och varken färgade kärnor eller cellmembranet. Sorten i färgningsintensitet och distribution var lindrigare när du använder den polyklonala antikroppen, vilket gör poäng svårare. I grund och botten PODXL är en trans molekyl, och därför var det överraskande att inte hitta den på cellmembran i gastric cancerceller genom att antingen antikropp. Innebörden av cytoplasma, icke-MEMBRAN-, uttryck av PODXL, dess roll och funktion, behöver ytterligare utvärdering.

Dessa olika antikroppar vi använde erkänna ojämlika delar av PODXL molekylen, troligen förklarar varför deras uttryck i några av de exemplar skilde och resultaten var inte identiska. Kaprio et al. [16], använde dessa samma antikroppar i kolorektal cancer, och hittat en intressant skillnad mellan färgningsmönster. Den polyklonala antikroppen positivitet var membranös [9,10], men var den monoklonala antikroppen positivitet uppenbart huvudsakligen i cytoplasman. I kolorektal cancer, stark positivitet med både monoklonala och polyklonala antikroppen visade en undergrupp av patienter med ännu sämre överlevnad. Vi hittade inte denna typ av korrelation i magcancer prover. Sammantaget positivitet bland gastric cancerpatienter var lägre än hos patienter tjocktarmscancer. Vid kolorektalcancer var ungefär 94% av fallen positiva för PODXL med dessa två antikroppar, medan i magcancer positivitet dök upp i 76% av fallen med den monoklonala antikroppen och i 58% med den polyklonala antikroppen. Frekvensen av PODXL positivitet i magcancer var nära den som sågs i bröst- och äggstockscancer (40% och 67%) [6,9].

PODXL är ett transmembrant glykoprotein. Det har visat sig att muciner, som också är glykoproteiner, spela en roll i epitelial till mesenkymala övergång (EMT) [23,24]. Rollen för PODXL i cancer är okänd, men det kan spekuleras i att också PODXL kan ha en roll i EMT. EMT kan förklara varför patienter med högt PODXL uttryck har sämre överlevnad.

Styrkan i denna studie är en stor patientgruppen med magcancer och en lång uppföljning med tillförlitlig klinisk uppföljning tid och överlevnadsdata. Av TMA tekniken är endast små områden av tumören utvärderas jämfört med hel-vävnadssnitt. I kolorektal cancer, Larsson et al. [22] fann att användning av hela sektioner möjliggjorde identifiering av ett större antal tumörer som PODXL-positiva än gjorde TMA-analys. Eftersom PODXL uttryck är heterogen, kan användningen av TMA-tekniken innebära en underskattning av positiva fall. Poängsättning av både monoklonala-antikroppen och polyklonal-antikroppsexpression var för vissa exemplar svåra; fall med endast ett fåtal cancerceller och de i vilka värdet av cancercellerna var oidentifierbar varför den uteslöts från analys. Detta delvis förklarar den höga antalet uteslutna fall. Å andra sidan, gör det möjligt för TMA teknik analys av stora patientgrupper med en homogen färgningsmetod.

Sammanfattningsvis tjänar PODXL immunofärgning som en oberoende markör för dålig prognos i magcancer. Detta är, så vitt vi vet, den första rapporten om prognostiska värdet av PODXL uttryck i magcancer. Framtida studier bör bekräfta denna förening och lösa de mekanismer genom vilka PODXL påverkar utvecklingen och beteendet hos magcancer.

Tack till

Vi tackar Päivi Peltokangas och Elina Aspiala för deras utmärkta tekniskt stöd.

• Typer av magcancer
• PLOS ONE: DBGC: En databas med Human Gastric Cancer