PLoS ONE: Podocalyxin als prognostischer Marker in Gastric Cancer

Abstrakt

Hintergrund

Podocalyxin-like 1 (PODXL) ist eine Zelladhäsion Glykoprotein mit aggressiven Tumor-Phänotyp und einer schlechten Prognose assoziiert in mehrere Formen von Krebs. Das Ziel dieser Studie war es PODXL Ausdruck bei Magenkrebs durch die Verwendung von zwei verschiedenen Antikörpern zu untersuchen.

Methoden

Mit dem Tumor-Gewebe-Mikroarrays und Immunhistochemie wir PODXL Expression in Tumorproben von 337 Patienten ausgewertet die operiert für Adenokarzinom des Magens in Helsinki University Hospital. Wir haben zwei verschiedene Antikörper. HPA2110, die einen polyklonalen Antikörper ist und ein hauseigenes monoklonalen Antikörper HES9, die so genannte Vereinigung von PODXL Ausdruck mit klinisch-pathologische Variablen und das Überleben des Patienten zu untersuchen

Ergebnisse |

PODXL Färbung war positiv durch den polyklonalen Antikörper in 153 (57,5%) Fälle und durch den monoklonalen Antikörper in 212 (76%). Polyklonale Antikörperexpression wurde mit Darmkrebs-Typ (p < 0,001) in Verbindung gebracht. Monoklonale Antikörper-Färbung wurde mit dem Alter über 66 (p = 0,001) zugeordnet ist, mit Darmkrebs (p < 0,001) und mit kleinen Tumorgröße (≤ 5 cm; p = 0,024). Beide Antikörper waren mit hohen S-Phasen-Fraktion (p = 0,022; p = 0,010) und eine hohe Tumorproliferationsindex (Ki-67; p = 0,003; p = 0,001). PODXL Positivität durch den polyklonalen Antikörper gezeigt reduzierte Magen-Krebs-spezifische 5-Jahres-Überlebensrate von 24,0% (95% CI 16,9 bis 31,1), im Vergleich zu 43,3% (95% CI 33,7 bis 52,9) für Patienten mit PODXL Negativität (p = 0,001 ). Das Ergebnis blieb signifikant in multivariablen Analyse. (HR = 3,17, 95% CI 1,37-7,34, p = 0,007)

Fazit

In Magenkrebs, PODXL Expression durch den polyklonalen Antikörper HPA2110 ist ein unabhängiger Marker für schlechte Prognose

Citation. Laitinen A, Bockelman C, Hagström J, Kokkola A, Fermer C, Nilsson O, et al. (2015) Podocalyxin als prognostischer Marker in Magenkrebs. PLoS ONE 10 (12): e0145079. doi: 10.1371 /journal.pone.0145079

Editor: Yves St-Pierre, INRS, KANADA

Empfangen: 15. September 2015; Akzeptiert: 29. November 2015; Veröffentlicht: 16. Dezember 2015

Copyright: © 2015 Laitinen et al. Dies ist ein offener Zugang Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons Attribution verteilt, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorgesehen sind der ursprüngliche Autor und Quelle genannt

Datenverfügbarkeit: Alle relevanten Daten sind innerhalb der Papier

Finanzierung:. Diese Studie wurde durch Zuschüsse aus Finska Läkaresällskapet, die Kurt och Doris Palander-Stiftung, die Sigrid Juselius Stiftung und Medicinska understödsföreningen Liv och Hälsa unterstützt wurde. Fujirebio Diagnostics AB und Onson Beratung zur Verfügung gestellt Unterstützung in Form von Gehältern für Autoren CF und ON, aber hatte keine zusätzliche Rolle im Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung zu veröffentlichen oder um die Herstellung des Manuskripts.

konkurrierende Interessen:. die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

in den letzten Jahrzehnten hat die Häufigkeit von Magenkrebs zurückgegangen, vor allem in den westlichen Ländern, die offensichtlich auf die rückläufiger Inzidenz von Helicobacter pylori
, um eine bessere Hygiene und weniger überfüllten Leben. Da Magenkrebs eine schlechte Prognose hat, ist es immer noch weltweit die zweithäufigste Ursache der durch Krebs verursachten Tod [1]. Die 5-Jahres-Überlebensrate, trotz kurativer Operation ist nur etwa 10-30% [2]. Die hohe Sterblichkeit ist vor allem auf späte Diagnose.

Die UICC Tumor Knoten Metastase (TNM) Einstufung ist bei weitem die meisten konsistente Prognose heute Klassifikationssystem. Aber auch innerhalb der gleichen Stufe Gruppe Tumoren kann der Verlauf der Erkrankung variieren. Verfahren für eine genauere Beurteilung der Aggressivität Neoplasie Schaffung wäre wertvoll, wenn die Prognose von einzelnen Patienten mit Magenkrebs auswertet.

Podocalyxin-like 1 (PODXL) eine antiadhäsive Transmembran- Glycoprotein zum CD34-Familie gehören . Es wird in der Regel durch Niere Podozyten exprimiert [3], hämatopoetischen Vorläuferzellen [4], Gefäßendothelien [5] und Brustepithelzellen [6].

Die klinische Bedeutung PODXL in der Tumorprogression untersucht wurde, in verschiedene Karzinom Typen, zuerst als Stammzellmarker in Hodenkrebs [7]. Eine spätere Erkenntnis ist, dass tumorzellspezifischen PODXL Ausdruck mit einem aggressiveren Phänotyp und negativen Ergebnis in verschiedenen Krebsarten, beispielsweise assoziiert ist, in der Brust [6], der Prostata [8], Eierstock- [9], kolorektalen [10- 12], urothelialen Blase [13], Pankreas [14], und periampullären Krebs [15].

Das Ziel dieser Studie war es PODXL Expression in Magenkrebs zu untersuchen, um seine mögliche Rolle bei der Aggressivität und Prognose offenbaren. Wir entschieden uns, zwei PODXL Antikörper, die verschiedene Epitope zu verwenden: ein monoklonaler in-house HES9 Antikörper und einem im Handel erhältlichen polyklonalen Antikörper HPA2110. Vor kurzem haben wir gelernt, dass diese beiden Antikörper sind unabhängige Marker der schlechten Prognose bei Darmkrebs [12]. Die beiden Antikörper können zwei Gruppen von Patienten mit Darmkrebs erkennen, die beide haben eine schlechte Prognose; kombinierte Verwendung dieser Antikörper zeigte eine Patientengruppe mit noch schlechteren Prognose [16].

Materialien und Methoden

Patienten

Die Studie umfasste 337 Patienten, die in Folge der Operation für histologisch unterzogen Adenokarzinom des Magens bei der Abteilung für Chirurgie, Helsinki University Hospital, von 1983 bis 1999. die Diagnose überprüft und Bühne nach der UICC Klassifikation bereitgestellt 100 (29,7%) im Stadium IA-IB, 41 (12,2%) im Stadium II, 96 (28,5%) Stufe IIIA-IIIB und 100 (29,7%) im Stadium IV Patienten. Lymph-Knoten Metastasen in 184 (55%) aufgetreten und Fernmetastasen in 93 (28%) Fälle. Das mittlere Alter betrug 66 Jahre (Bereich 30 bis 87) und 163 (48%) Frauen und 174 (52%) Männer. Die vollständige oder partielle Gastrektomie mit erweiterten (D2-D2 +) Lymphadenektomie wurde in 34 (10%) der Patienten, Gastrektomie mit D1-Lymphadenektomie in 161 (48%), und subtotale Gastrektomie mit D1-Lymphadenektomie in 142 (42%) durchgeführt. Insgesamt 143 (43%) Patienten wurden mit kurativer Absicht operiert, während 176 (52%) palliative Operation unterzog. Keine erhielten eine neoadjuvante Behandlung, aber 32 (9%) Patienten erhielten eine postoperative adjuvante Therapie (28 Chemotherapie, Strahlentherapie 2; 2 empfangen beide). Die Überlebensdaten und Todesursache bis November 2013 kam von Patientenakten, die Population Register Centre of Finland und Statistics Finland.

Die Studie wurde von der Chirurgischen Ethikkommission der Helsinki University Hospital (Dnro HUS 226 /E6 genehmigt wurde 06 /, Erweiterung TMK02 §66 2013.04.17) und der nationalen Aufsichtsbehörde für Wohlfahrt und Gesundheit die Erlaubnis gab, die Gewebeproben ohne individuelle Zustimmung in dieser retrospektiven Studie (Valvira Dnro 10041 /06.01.03.01 /2012) zu verwenden.

Gewebeproben

Formalin-fixierte und in Paraffin eingebettete chirurgische Gewebeproben stammen aus den Archiven der Abteilung für Pathologie. Die Patientengewebe wurden deidentifiziert und analysiert anonym. Histopathologisch repräsentative Teilbereiche der Tumorproben wurden definiert und markiert auf haematoxylin- und Eosin-gefärbten Schnitten. Drei Kerne von jedem Tumor Block wurden Proben mit 0,6-mm-Puncher und eingebettet in einem neuen Paraffinblock mit einem halbautomatischen Gewebe Microarrayers (Tissue Arrayer 1, Beecher Instruments Inc., Silver Spring, MD, USA). Von den sechs Gewebe-Array-Blöcke vorbereitet enthielt jede 24-192 Tumorproben. Abschnitte von 4 um jeweils wurden geschnitten und für die Immunhistochemie verarbeitet.

Antikörper

Wir verglichen zwei PODXL Antikörper gegen verschiedene Epitope. Der polyklonale Antikörper (HPA2110, Atlas Antibodies, Stockholm, Schweden) wurde mit den Aminosäureresten gegen ein Peptid gerichtet 278-415 von PODXL, und der monoklonale Antikörper in-house HES9 [12] erkennt die Aminosäurereste 189-192 von PODXL . Beide Epitope treten in dem extrazellulären Teil des Moleküls PODXL. Die Epitop-Sequenz des HPA2110 entspricht drei Protein-kodierenden PODXL Splice-Varianten mit 100% (PODXL 001, 005 und 201, The Human Protein Atlas). Die vierte Splice-Variante entspricht mit 87% (PODXL 202). Das Epitop-Sequenzen des HES9 entspricht 100% bei allen Spleißvarianten. Die Antikörper werden im Detail beschrieben [12,17,18].

Immunohistochemistry

Die Schnitte wurden auf Objektträger fixiert und bei 37 ° C für 12 bis 24 Stunden getrocknet wurden dann entparaffiniert in Xylol und durch allmählich abnehmenden Konzentrationen von Ethanol zu destilliertem Wasser rehydratisiert. Für Antigen Retrieval wurden die Schnitte in einer Vorbehandlungsmodul (Lab Vision Corp., Fremont, CA, USA) in Tris-HCl-Puffer (pH 8,5) für 20 Minuten bei 98 ° C behandelt. Die Schnitte wurden in einem Autostainer 480 (Lab Vision) von der Dako REAL EnVision Detection System, Peroxidase /DAB +, Kaninchen /Maus (Dako, Glostrup, Dänemark) gefärbt. Die Objektträger wurden für 5 Minuten mit 0,3% Dako REAL Peroxidasehaltige Blocking Solution behandelt endogene Peroxidasen zu blockieren. oder monoklonale Antikörper (Verdünnung 1: 500 = 5 &mgr; g /ml) bei Raumtemperatur: Anschließend wurden die Objektträger 1 Stunde lang mit einem polyklonalen (250 = 2,5 &mgr; g /ml Verdünnung 1) inkubiert. Als positive Kontrolle für jede Färbung Serie haben wir Proben von Nierengewebe.

Scoring von Immunreaktivität

HPA2110 und HES9 immunopositivity in allen verfügbaren Tumorkerne benotet wurde. Zytoplasmatischen PODXL und HES9 immunopositivity wurde als 0 bis 3 basierend auf Intensität der Krebszelle Immunreaktivität erzielt, und die höchste Punktzahl der drei Kerne für die weitere Analyse serviert. Negative Immunreaktivität als 0 erzielt wurde, diffus schwache zytoplasmatische Positivität als 1, mäßig positiv oder fokal stark positive Intensität als 2 und homogen starke Intensität als 3. Alle Proben erzielt wurden unabhängig voneinander von zwei Forschern (AL und JH) geblendet klinischen Status und Ergebnis Daten. Proben mit diskordanten Scores wurden neu bewertet, und der Konsens-Score für die weitere Analyse serviert. Wir konnten HPA2110 Färbung in 266 und HES9 Färbung in 279 Proben.

Die statistische Analyse

Assoziationen zwischen HPA2110 und HES9 Positivität und klinisch-pathologische Variablen zu verarbeiten und ein Tor von der Chi-Quadrat-Test bewertet wurden oder Fisher-Test. Die Korrelationen zwischen den beiden Podocalyxin Antikörper wurden durch den Spearman Korrelationstest beurteilt. Die krankheitsspezifische Überleben wurde vom Tag der Operation bis zum Tod von Magenkrebs berechnet.

Die Überlebenskurven wurden nach der Methode nach Kaplan-Meier konstruiert und mit dem Log-Rank-Test verglichen. Für univariable und multivariablen Analyse Überleben hatte die Cox Proportional Hazard Modell folgende Kovariaten eingegeben: Alter, Geschlecht, Stadium, Grad, Laurens Klassifikation, Tumorgröße, Tumorlokalisation, bestimmt PODXL Expression durch HPA2110 Färbung und HES9 Färbung, DNA-Ploidie, S- Phasenfraktion, Ki-67-Expression und p53-Expression. Bühne, grade, Laurens Klassifikation, Tumorgröße, DNA-Ploidie, S-Phasen-Fraktion, und die Expression von PODXL, HES9, Ki-67 und p53 wurden als kategoriale Kovariaten eingetragen. DNA-Ploidie und S-Phasen-Fraktion hatte zuvor durch die Strömung wurde Zytometrie bewertet und p53 und Ki-67 Gewebeexpression durch Immunhistochemie [19,20]. Ein p-Wert von < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Alle statistischen Analysen wurden mit IBM SPSS Statistics Version 20.0 für Mac (IBM Corporation, Armonk, NY, USA) durchgeführt.

Ergebnisse |

Immunhistochemie

Zytoplasmatischen HPA2110 Reaktivität, bewertet in 266 Fälle wurde in 113 (42,5%) negativ, schwach positiv in 120 (45,1%), mäßig positiv in 29 (10,9%) und stark positiv in 4 (1,5%) Fälle. Von den 279 Fällen für Cytoplasmaexpression von HES9 erfolgreich gefärbt, 67 (24,0%) waren negativ, 137 (49,1%) schwach positiv, 54 (19,4%) leicht positiv, und 21 (7,5%) stark positiv. In der abschließenden Analyse, schwach bis stark positiv HPA2110 und HES9 Immunreaktivität (Noten 1-3) wurde als positiv angesehen Ausdruck. Repräsentative Bilder von Immunfärbungen sind in Abb 1. Sowohl HPA2110 und HES9 gefärbt gleichmäßig über das Zytoplasma, mit Kern noch Zelle membranöse immunopositivity bemerkbar. Die zytoplasmatische Expression von Podocalyxin durch die beiden verschiedenen Antikörper HPA2110 und HES9 korreliert (r _{s = 0,455, p < 0.001, Spearman-Rangkorrelationstest).}

Association of HPA2110 und HES-9 mit klinisch-pathologischen Variablen und Biomarker

Die Verbände der HPA2110 und HES9 mit klinisch-pathologischen Variablen und molekulare Biomarker waren wie folgt: positiv (Noten 1-3) HPA2110 Färbung mit Darmkrebs-Typ (p < 0,001) assoziiert war, positive HES9 Färbung wurde im Zusammenhang mit Alter über 66 (p = 0,001), mit Darmkrebs (p < 0,001) und mit kleiner (≤ 5 cm) Tumorgrße (p = 0,024). Sowohl HPA2110 und HES9 wurden mit hohen S-Phasenanteil assoziiert (SPF, p = 0,022; p = 0,010) und hohe Proliferationsindex des Tumors (Ki-67, p = 0,003; p = 0,001) (Tabellen 1 und 2).

Überleben analysiert

Positive HPA2110 Ausdruck einen Magenkrebs-spezifische 5-Jahres-Überleben von 24% (95% CI 16,9-31,1) angegeben, im Vergleich zu Patienten mit negativem HPA2110 Färbung mit 5-Jahres Überleben von 43% (95% CI 33,7-52,9) (p = 0,001 log-rank test) (Bild 2 und Tabelle 3). Die Magen-Krebs-spezifische 5-Jahres-Überleben von Patienten mit HES9-positiven Tumor-Färbung betrug 30% (95% CI 23,1-36,1), und für diejenigen mit negativer Färbung, 40% (95% CI 27,7-52,1; p = 0,130 log -rank Test) (Bild 2).

in Subgruppenanalyse war HPA2110 eine deutliche Markierung der schlechten Prognose in Gruppen von jüngeren Patienten (Alter unter 66 Jahre) (p = 0,006) und für das männliche Geschlecht (p = 0,002), diffus-Typ Krebs (p = 0,001), und Patienten im Stadium I (p = 0,048) (Abb 3 und Tabelle 3). In den anderen Untergruppen untersucht, hat HPA2110 nicht als prognostischer Marker dienen

Der HPA2110 Ausdruck blieb signifikant in multivariablen Analyse. (HR = 3,17, 95% CI 1,37-7,34; p = 0,007; Tabelle 4). Andere unabhängige prognostische Faktoren in multivariablen Analyse waren Stadium, Grad und DNA-Ploidie.

Diskussion

Wir zeigen hier, dass Krebs-spezifische 5-Jahres-Überlebensrate für Patienten mit Magenkrebs signifikant besser war, eine PODXL mit -negative Tumor. Eigentlich unter Stufe 1 Patienten mit PODXL-negativen Tumoren, nur ein Patient an Krebs gestorben. In multivariablen Analyse diente positive PODXL Ausdruck als unabhängiger Marker für die schlechte Prognose. Positive PODXL Expression sowohl durch den polyklonalen Antikörper HPA2110 und dem monoklonalen Antikörper HES9 wurde mit hohem SPF mittels Durchflusszytometrie und Ki-67-Färbung, die beide Marker hoher Proliferation von Krebszellen assoziiert und damit schlechtere Prognose.

Positive Expression von PODXL durch beide Antikörper wurde mit Darmkrebs Typ zugeordnet, aber ein PODXL negativen Tumors nachgewiesen keine prognostischer Marker in Darmkrebs sein. Im Gegensatz dazu Krebs-spezifische 5-Jahres-Überleben in der Subgruppe der diffusen Typ Krebs war signifikant schlechter bei Patienten mit einer PODXL-positiven Tumor. Im Allgemeinen hat diffuse Art Krebs mit einer schlechteren Prognose assoziiert als die Darmtyp hat [21].

Nach bestem Wissen und Gewissen, sind wir der erste einen prognostischen Wert für PODXL bei Magenkrebs zu melden. Dies hat für verschiedene andere Krebsarten offensichtlich gewesen, wie Brust [6], der Prostata [8], Eierstock- [9], kolorektalen [10-12], urothelialen Blase [13], Pankreas [14], und periampullären Krebs [15] . Eine Studie über Darmkrebs zeigen Konkordanz zwischen Primärtumoren und entsprechenden Lymphknotenmetastasen bei einzelnen Patienten und PODXL Ausdruck Unberührt bleibt auch durch die neoadjuvante Strahlentherapie. Diese Ergebnisse unterstützen den klinischen Nutzen von PODXL als Marker für die schlechte Prognose [22]. Hier haben wir nicht PODXL Ausdruck in Lymphknoten-Metastasen bei Magenkrebs, und keiner der Patienten in dieser Kohorte erhielten eine präoperative Chemotherapie studieren, obwohl es derzeit eher Routine. Diese Effekte der präoperativen Chemotherapie auf PODXL Expression in Magenkrebs muss die weitere Auswertung.

Wir haben zwei Antikörper, die PODXL, einen im Handel erhältlichen polyklonalen Antikörper HPA2110 und ein hauseigenes monoklonalen Antikörper HES9 [16]. Immunoexpression durch den monoklonalen Antikörper HES9 war stärker als durch den polyklonalen Antikörper. Beide Antikörper gefärbt gleichmäßig im Cytoplasma und Kerne weder gebeizt noch Zellmembran. Die Vielfalt in der Färbungsintensität und Verteilung war geringer, wenn die polyklonalen Antikörper verwendet wird, so dass das Scoring schwieriger. Grundsätzlich PODXL ist ein Transmembranmolekül, und deshalb war es überraschend nicht auf Zellmembranen in Magenkrebszellen entweder durch Antikörper zu finden. Die Bedeutung der zytoplasmatischen, nicht membraneous, Ausdruck von PODXL, seine Rolle und Funktion müssen die weitere Auswertung.

Diese verschiedenen Antikörpern wir ungleiche Teile des PODXL Molekül erkennen verwendet wird, wahrscheinlich zu erklären, warum ihre Expression in einigen der Proben unterschieden sich und die Ergebnisse waren nicht identisch. Kaprio et al. [16], verwendet, um diese gleichen Antikörper bei Darmkrebs und fand einen interessanten Unterschied zwischen den Färbungsmuster. Die polyklonalen Antikörper-Positivität war membranöse [9,10], aber der monoklonale Antikörper-Positivität war offensichtlich hauptsächlich im Zytoplasma. In Darmkrebs, starke Positivität sowohl mit dem monoklonalen und polyklonalen Antikörper ergab eine Untergruppe von Patienten mit noch schlimmer Überleben. Wir haben nicht diese Art von Korrelation bei Magenkrebs Proben finden. Insgesamt Positivität unter Magenkrebs-Patienten niedriger war als in Darmkrebspatienten. In Kolorektalkrebs etwa 94% der Fälle waren positiv für PODXL mit diesen zwei Antikörpern, wohingegen in Positivität Magenkrebs in 76% der Fälle trat mit dem monoklonalen Antikörper und in 58% mit dem polyklonalen Antikörpers. Die Häufigkeit der PODXL Positivität bei Magenkrebs war in der Nähe, dass bei Brust- und Eierstockkrebs (40% und 67%) gesehen [6,9].

PODXL ist ein Trans Glykoprotein. Es hat sich gezeigt, dass Mucine, die auch Glykoproteine ​​sind, eine Rolle bei der epithelialen zu mesenchymale Transition (EMT) spielen [23,24]. Die Rolle der PODXL in Krebs ist unbekannt, aber es kann vermutet werden, dass auch eine Rolle in PODXL EMT haben kann. EMT kann erklären, warum Patienten mit hohem PODXL Ausdruck schlechteren Überleben haben.

Die Stärke dieser Studie ist eine große Patientenkohorte mit Magenkrebs und einer langen Follow-up mit zuverlässigen klinischen Follow-up-Zeit und das Überleben Daten. Durch die TMA-Technik werden nur kleine Bereiche des Tumors untersucht im Vergleich zu Ganzgewebeschnitten. In Darmkrebs, Larsson et al. [22] gefunden, dass die Verwendung von ganzen Abschnitten Identifizierung einer großen Anzahl von Tumoren, wie PODXL-positive erlaubt als TMA-Analyse hat. Da PODXL Ausdruck heterogen ist, die Verwendung des TMA-Technik kann zu einer Unterschätzung der positiven Fälle führen. Scoring sowohl monoklonale-Antikörper und polyklonalen Antikörper-Expression war für einige Proben schwierig; Fälle mit nur wenigen Krebszellen und solche, in denen der Wert der Krebszellen somit nicht identifizierbare war wurden von der Analyse ausgeschlossen. Diese zum Teil erklärt die hohe Zahl der Fälle ausgeschlossen. Auf der anderen Seite ermöglicht die TMA-Technik-Analyse von großen Patientenkohorten mit einer homogenen Färbemethode.

Abschließend PODXL Immunfärbung als unabhängiger Marker für die schlechte Prognose dient bei Magenkrebs. Dies ist unseres Wissens der erste Bericht über die prognostische Wert der PODXL Expression in Magenkrebs. Zukünftige Studien sollten diesen Zusammenhang bestätigen und lösen Sie die Mechanismen, mit denen PODXL die Entwicklung und das Verhalten von Magenkrebs betroffen sind.

Acknowledgments

Wir danken Päivi Peltokangas und Elina Aspiala für ihre hervorragende technische Unterstützung.

• Arten von Magen cancer
• PLoS ONE: DBGC: Eine Datenbank der menschlichen Magenkrebs