Abstrakt
Resveratrol, et naturligt forekommende polyphenolisk sammensatte, er blevet rapporteret til at udøve anticancer aktivitet ved at påvirke diverse molekylære mål. I denne undersøgelse undersøgte vi virkningerne og de underliggende mekanismer af resveratrol på mavekræft. Vi fandt, at resveratrol inhiberede proliferationen af gastriske cancerceller på en dosis-afhængig måde. Ved en koncentration på 25 og 50 pM, resveratrol inhiberede cellelevedygtigheden og mindsket klonogene potentiale af gastriske cancerceller. Resveratrol behandling standset gastriske cancerceller i G1-fasen og førte til senescens i stedet for apoptose. Regulatorer af cellecyklus og senescens veje, herunder cyclin D1, cyclin-afhængig kinase (CDK4 og 6), p21 og p16, blev dysreguleret af resveratrol behandling. De hæmmende virkninger af resveratrol på mavekræft blev også bekræftet in vivo Henvisning:. Yang Q, Wang B, Zang W, Wang X Liu Z, Li W, et al. (2013) Resveratrol hæmmer væksten af gastrisk kræft ved at inducere G1 Phase Anholdelse og Ældning i et SIRT1-afhængig måde. PLoS ONE 8 (11): e70627. doi: 10,1371 /journal.pone.0070627 Redaktør: Dominique Heymann, Faculté de médecine de Nantes, Frankrig Modtaget: Marts 20, 2013; Accepteret: 19. juni 2013; Udgivet: November 21, 2013 | Copyright: © 2013 Yang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (nr 81.101.869, 81.100.103, 81.171.536 og 81.000.868), National Basic Research Program Kina (973 Program, No. 2012CB911202), og uafhængige innovation Foundation of Shandong University (2012TS108) .Den finansieringskilderne havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke konkurrerende interesser findes Introduktion mavekræft (GC) er den fjerde mest almindelige kræftform og den anden hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald i verden. Ifølge en global vurdering, blev i alt 989,600 nye GC sager diagnosticeres og mindst 738.000 patienter døde af denne sygdom i 2008, tegner sig for 10% af de samlede dødsfald af kræft [1]. Selvom forekomsten af GC har været faldende globalt, er det stadig høj i udviklingslandene, især i Kina [1], [2]. Tidligere undersøgelser har afsløret den intime forbindelse mellem kronisk gastritis forårsaget af Helicobacter pylori Forbruget af frisk frugt og grøntsager bidrager til en reduceret forekomst af kræft, herunder GC [2], [5]. Kliniske anvendelser foreslår også, at nogle bioaktive diætetiske molekyler har evnen til at inhibere multiple oncogene trin [5] - [7]. Resveratrol (Res, 3,5,4'-trihydroxystilbene) er et naturligt forekommende polyphenolisk forbindelse til stede i næsten 70 plantearter, herunder huden af røde druer, jordnødder, bær og andre [6] - [8]. Res blev først rapporteret at udøve antitumoraktiviteter i 1997 [8]. Senere rapporter har vist, at Res bibringer inhiberende virkninger på flere typer af cancere, såsom coloncancer, brystcancer og lymfom, og påvirker forskellige molekylære targets [9] - [11]. Sirtuin 1 (SIRT1), en klasse III nikotinamid adenin nukleotid (NAD +) - afhængig histon /protein deacetylase, er blevet rapporteret at være et centralt mål for Res i flere tumormodeller [9], [10]. Men nogle data viser strid resultater tyder på, at Res udøver kemoprotektive virkninger uafhængigt af SIRT1 [11]. De hæmmende virkninger af Res på GC og den underliggende mekanisme er ikke godt undersøgt. I den foreliggende undersøgelse, viste vi, at Res hæmmede spredning af GC celler in vitro Etik Statement Alle dyreforsøg blev godkendt af den etiske komité Shandong University School of Medicine (nr 001 i 2011 for Dyreetiske godkendelse) og blev gjort alle bestræbelser på at minimere lidelse. cellelinier, kultur betingelser og Res behandling Menneskelig GC cellelinjer AGS (opnået fra Cell Resource center, Shanghai Institute for Biokemi og Cellebiologi ved Chinese Academy of Sciences), BGC-823 og SGC-7901 (købt fra Kina center for Type Culture Collection, Wuhan, Kina) blev anvendt i denne undersøgelse. Cellerne blev dyrket i F12 (AGS) eller RPMI 1640 (BGC-823 og SGC-7901) indeholdende 10% FCS, 100 enheder /ml penicillin og 2 mmol /l L-glutamin ved 37 ° C i en fugtig atmosfære indeholdende 5% CO 2. Høj renhed Res blev erhvervet fra Sigma (St. Louis, MO, USA), opløst i DMSO og tilsat til dyrkningsmediet ved den angivne koncentration. Alle eksperimenter blev udført 24 timer efter Res tilskud, medmindre andet er angivet. Kemisk modificeret lille interfererende RNA (siRNA) rettet mod SIRT1 og kontrol siRNA blev indkøbt fra GenePharma (Shanghai , Kina). Sekvensen af SIRT1 siRNA var 5'-CCAUCUCUCUGUCACAAAUTT-3 '. Celler blev inkuberet natten over og derefter transficeret med siRNA anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ifølge producentens protokol. Otteogfyrre timer efter siRNA transfektion blev cellerne behandlet med 50 pM Res i 24 timer, før yderligere undersøgelse. Proliferation blev vurderet ved hjælp af Cell Titer 96 ® vandig One Solution celleproliferationsassay (Promega, Madison, WI, USA). Kort fortalt, 2 × 10 3-celler blev podet i en 96-brønds plade og fik lov at vokse i 24 timer. Fireogtyve timer senere, 20 pi MTS (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -5- (3-carboxy-methoxyphenyl) -2- (4-sulfophenyl) -2H-tetrazolium) blev tilsat til hver godt. Efter inkubation i 3 timer ved 37 ° C blev absorbansen ved 490 nm registreres på et Varioskan Flash Multiplate Reader (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). Cellelevedygtighed blev beregnet ved følgende formel: relative cellelevedygtighed = (gennemsnitlig absorbans behandlet gruppe - gennemsnitlig absorbans blank) /(gennemsnitlig absorbans af kontrol gruppe- gennemsnitlige absorbans blank). Assays blev udført in triplo og gentaget tre gange. Celler blev podet i 6-brønds plader (300 eller 500 celler per brønd) og inkuberet i 10 dage, indtil kolonierne var stor nok til at være klart skelnes. Cellerne blev fikseret med methanol og farvet med krystalviolet, og antallet af kolonier med mere end 50 celler blev talt manuelt. Eksperimenter blev udført tre gange og gentaget tre gange. Celler blev høstet, fikseret med forafkølet 70% ethanol ved 4 ° C natten over og derefter farvet med propidiumiodid (Beyotime , Jiangsu, Kina) indeholdende RNase A ved 37 ° C i 30 minutter i mørke. Fordelingen cellecyklus blev bestemt ved anvendelse af et flowcytometer (BD Biosciences, San Jose, CA, USA), og dataene blev analyseret med Multicycle software (Phoenix Flow Systems, San Diego, CA, USA). Eksperimenter blev udført uafhængigt tre gange. Påvisning og kvantificering af apoptose blev udført af mærkning af DNA strengbrud ved hjælp af en in situ Cell Død Detection Kit, TMR rød (Roche Applied Science, Basel, Schweiz). Celler eller paraffinsnit af xenotransplantater blev mærket med TUNEL ifølge producentens anvisninger. For celler, behandling med 0,2 mM H 2O 2 til 12 timer tjente som den positive kontrol. For paraffinsnit blev positive kontroller indkøbt fra Millipore (Billerica, MA, USA). Kernerne blev modfarvet med DAPI (Beyotime) og præparatglassene eller sektioner blev afbildet ved en fluorescensmikroskopi (Olympus, Tokyo, Japan) under anvendelse cellSens Dimension software. Eksperimenter blev udført uafhængigt tre gange. Ældning blev vurderet ved anvendelse af en Ældning β-galactosidasefarvning Kit (Beyotime). Kort fortalt blev celler eller frosne snit af xenotransplantater faste og derefter inkuberet med frisk fremstillet β-galactosidase (β-Gal) farvningsopløsning ved 37 ° C natten over. Eksperimenter blev udført uafhængigt tre gange. Lentivirale vektorer indeholdende kontrol eller SIRT1 shRNA blev bygget af GenePharma og anvendes til transfektion BGC-823 celler. Effektiv knockdown af SIRT1 blev verificeret ved Western blot. For stabil transduktion, kontrol-lentivirus-inficeret eller SIRT1 shRNA-lentivirus-inficerede BGC-823 celler blev dyrket i komplet medium leveres med 2 ug /ml puromycin i fire uger og betragtes som LV-C og LV-S, henholdsvis. Nude mus xenograftmodel Female athymiske BALB /c nøgne mus (6~8 uger) blev købt fra Peking University (Beijing, Kina) og blev opretholdt under specifikke patogenfrie forhold på Key Laboratoriet for kardiovaskulær Remodeling og Function Forskning, Qilu hospital, Shandong University. Musene blev tilfældigt opdelt i fire grupper (8 mus i hver gruppe): gruppe I og II, BGC-823 celler (1 x 10 6 celler pr injektion i 0,1 ml PBS) blev injiceret subkutant i siden region af nøgne mus; gruppe III, blev LV-C (BGC-823 celler) injiceret; og gruppe IV, LV-S (BGC-823 celler) blev injiceret. Efter implantation, den nøgne mus fra gruppe II, III og IV blev behandlet med Res (40 mg kg -1 i 0,1 ml vegetabilsk olie, administreret ved gavage en gang dagligt). Den subkutane tumorstørrelse blev målt med en passer, og tumorvolumener blev beregnet ved formlen (længde) x (bredde 2) /2. Musene blev aflivet fire uger senere. Tumorerne blev høstet og forarbejdet til Western blot og immunkemiske undersøgelser. Totalt RNA i celler blev isoleret ved hjælp TRIzol reagens (Invitrogen) og omdannet til cDNA under anvendelse af PrimeScript ™ RT reagenskit (Takara, Tokyo, Japan). RT-QPCR blev udført i gener, herunder cyclin D1, cyclin-afhængig kinase 4 (CDK4), p21 og β-actin som tidligere beskrevet [12]. Sekvenserne af amplifikationsprimerne er anført i tabel S1. MRNA ekspression af cyclin D1, CDK4 og p21 blev normaliseret for p-actin i forhold til kontrollen under anvendelse af 2 -ΔΔCt metode. Hvert forsøg blev gentaget tre gange. totalt protein fra cellerne eller tumorprøver blev ekstraheret med RIPA lyseringsbuffer (Beyotime) som beskrevet [12]. Proteinkoncentrationen blev bestemt under anvendelse af BCA Protein Assay Kit (Pierce, Rockford, IL, USA). Membranen blev probet med antistoffer mod SIRT1 (Abcam, Cambridge, MA, USA), bcl-2, Bax, caspase-3, cyclin D1, CDK4 og 6 (Cell Signaling, Danvers, MA, USA), p16 og p21 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA). Det sekundære antistof anvendte var en peberrodsperoxidase (HRP) -konjugeret anti-kanin eller muse-antistof. Proteinbåndene blev visualiseret under anvendelse af et ECL-system (Pierce). β-actin (Cell Signaling) tjente som en belastning kontrol. Immunhistokemi De tumor prøver fra de nøgne mus blev afparaffiniseret, rehydreret og antigen hentet. Snittene blev inkuberet med et antistof mod Ki67 (1:500, Abcam) natten over ved 4 ° C. HRP-konjugeret anti kanin IgG og DAB-farvning blev anvendt til at visualisere Ki67 antistof. Objektglassene blev til sidst modfarvet med hematoxylin. Objektglassene blev afbildet ved et Olympus lysmikroskop (Tokyo, Japan) under anvendelse cellSens Dimension software. De Ki67-positive celler blev talt manuelt, og procentdelen af Ki67-positive celler blev vurderet pr felter. Fem separate felter blev talt for hver sektion. Dataene blev udtrykt som middelværdi ± SD. De statistiske analyser blev udført ved hjælp af statistiske pakke for Social Sciences (SPSS, version, 16,0, Chicago, IL, USA) ved envejs ANOVA med Tukey post-hoc test. P-værdier mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Res Hæmmer levedygtighed GC celler i en SIRT1-afhængig måde Tre GC cellelinjer (AGS, BGC-823 og SGC-7901) blev undersøgt i vores eksperimenter. Dyrkning af cellerne i køretøjet (0,1% DMSO) påvirkede ikke cellernes levedygtighed (data ikke vist). Men når de behandles med forskellige koncentrationer af Res i 24 timer, celleproliferation blev dosisafhængigt inhiberet ved 25, 50, 100 og 200 um Res (figur 1A). Notatet blev spredning af AGS tydeligvis hæmmet, når de behandles med 10 pM Res, som ikke blev observeret i de to andre cellelinjer (figur 1A). I alle tre cellelinier, tilstedeværelsen af 100 um Res var tilstrækkelig til at fremkalde mere end 50% vækstinhibering (56.78% for AGS, 54.87% for BGC-823 og 52.16% for SGC-7901, henholdsvis). Derfor blev 25 og 50 um Res anvendes til efterfølgende eksperimenter. For at bestemme den funktionelle rolle af SIRT1 i Res behandling, vi bankede ned SIRT1 udtryk ved hjælp af en specifik siRNA. Den effektive inhibering af SIRT1 ekspression blev verificeret ved Western blot (figur 1B). Resultaterne af MTS assay viste, at i SIRT1-udtømte celler, havde Res ikke inhiberer celleproliferation (fig 1C). Disse data indikerer, at Res kan inhibere proliferation af GC celler, og at den inhiberende virkning kan reddes af SIRT1 depletion. i tumorceller, er kolonidannelse vist sig at være en mere følsom parameter end levedygtigheden for at vurdere virkningen af et lægemiddel. Således blev indsatsen derefter foretaget for at bestemme virkningen af Res på klonogene potentiale GC celler. Res, ved koncentration på 25 uM, førte til en betydelig reduktion i foci numre samt størrelser i GC celler. Efter behandling med 50 pM Res, den klonogene potentiale mindskes yderligere. Men knockdown af SIRT1 før Res behandling øget antallet af foci til et niveau svarende til køretøjets gruppe (figur 2). for at undersøge hæmmende virkning af Res på GC celler, vi udførte cellecyklus analyse. Vi observerede, 25 og 50 um Res øget andelen af celler i G1-fasen i begge BGC-823 og SGC-7901 celler (figur 3A og 3B). Induktionen af G1 fasen anholdelse af Res var også dosisafhængig. Res ved en koncentration på 50 uM viste en stærkere virkning end det gjorde ved 25 uM. Stigningen i antallet af celler i G1-fasen var ledsaget af et fald i cellepopulationer hovedsageligt i S faser. Nedbrydningen af SIRT1 før Res behandling mindsket G1 fase induktion af Res (figur 3A og 3B). For at underbygge ovenstående resultater, undersøgte vi ekspressionen af cellecyklus regulatorer af G1 fasen, herunder cyklin D1, CDK4, CDK6, p21 og p16 i BGC-823 celler. Som vist i figur 3C, i Res-behandlede BGC-823-celler, protein niveauer af aktivatorer af G1 /S-overgang (cyclin D1, CDK4 og CDK6) faldt, medens proteinniveauer af inhibitorer af CDK'er (CDKIs) (p21 og p16) steg. I modsætning hertil blev disse ændringer ikke findes i SIRT1-udtømte BGC-823 celler, når de blev behandlet med 50 pM Res. Tilsvarende resultater blev opnået fra RT-QPCR af cyclin D1, CDK4 og p21 (figur 3D). Manglen på sub-G1 celler viste, at Res behandling ikke udløste apoptose i GC-celler (figur 3A) , hvilket var i overensstemmelse med resultaterne af TUNEL mærkningseksperimenter fra BGC-823 celler (figur S1a). Protein- niveauerne af apoptose-relaterede molekyler, såsom bcl-2, Bax og caspase-3, fra hver gruppe var sammenlignelige (Figur S1B). Tilsammen vores resultater viser, at Res inducerer G1 fase anholdelse i GC celler i en SIRT1-afhængig måde og ikke inducere apoptose. i vores hænder, Res resulterer i vækst anholdelse i stedet øget apoptose. Derfor har vi gjort en yderligere indsats for at udforske, om Res kunne fremkalde ældning i GC celler. p-gal-farvning, en specifik markør for mammale aldrende celler, blev anvendt. Efter Res behandling, fandt vi øget fraktioner af cellerne blev farvet med β-Gal. Imidlertid forbehandling med SIRT1 siRNA blokeret Res-induceret cellulær aldring (figur 4). Lignende resultater blev opnået fra både BGC-823 og SGC-7901 celler, hvilket antyder, at Res forsørgerpligt på SIRT1 at inducere cellulær senescens i GC-celler. Næste, supplerende undersøgelser blev udført for at bestemme virkningerne af Res på BGC-823-xenografter vækst i nøgne mus. For in vivo diskussion Res, en naturlig polyphenol, er ved at blive evalueret som en lovende anticancer. agent. Selv om det har vist sig at bibringe antiproliferative virkninger mod flere cancertyper både i cellekultur og xenograftmodeller [9] - [11], dens chemoprevention virkninger på GC og den underliggende mekanisme er ikke blevet godt undersøgt. I denne undersøgelse viste vi, at Res hæmmede udbredelsen af GC cellelinier (AGS, BGC-823 og SGC-7901). Den anti-vækst aktivitet blev observeret efter at cellerne blev behandlet med 25 um Res i 24 timer, og den inhiberende virkning var dosisafhængig. Ved en koncentration på 50 uM Res inhiberingen ratio for disse tre cellelinier var 41%, 34% og 32%, hhv. Når koncentrationen af Res forøges yderligere blev de inhibitoriske virkninger styrkes. Både 100 og 200 um Res inhiberede vækst med mere end 50% i forhold til køretøjet gruppen. Hertil kommer, at højere dosis af Res er for stor til at opnå in vivo Res kan bremse proliferation af cancerceller gennem diverse mekanismer, blandt hvilke, cellecyklusregulering er vigtigt [9], [15], [19]. Vores in vitro Apoptose er en anden almindelig effekt, der normalt observeres i Res-behandlede cancerceller [9], [11], [15], [16]. Eksperimentel dokumentation viser, at apoptose kan medieres af flere forskellige veje og talrige regulatoriske molekyler. Blandt disse regulatorer, de proteiner, der omfatter bcl-2-familien er vigtige. Der er både anti-apoptotiske proteiner (bcl-2, bcl-xl) og pro-apoptotiske proteiner (Bax, dårlig, Bak og Bd-xs) i denne familie. En forøgelse af pro-apoptotisk bax /anti-apoptotiske bcl-2-forhold forøger permeabiliteten af den mitokondriske membran, forårsager frigivelse af cytochrom c fra mitokondrier til cytosol og til gengæld resulterer i aktiveringen af caspase-9 og den nedstrøms målrette caspase-3 [31]. Trods denne iboende apoptosecyklus, de pro-apoptotiske ligander, såsom FasL, ved binding til deres receptorer, forårsager aktiveringen af caspase-8 og nedstrøms effektorer, såsom caspase-3. Aktiveringen af effektorceller caspaser inducerer spaltningen af mange cellulære substrater og direkte forårsager apoptose [31] - [33]. Selvom mange tidligere rapporter viste, at apoptose var ansvarlig for Res-induceret væksthæmning, vi ikke observere indlysende apoptose i Res-behandlede GC celler. Denne mangel på apoptose kan skyldes koncentrationen og varigheden af Res behandling tilpasset i vores eksperiment, fordi undersøgelser fra forskellige grupper viser, at Res udøver dosage- og Varighedsafhængige virkninger [34], [35]. Hertil kommer, som virkningerne af Res er også celle-specifikke [36] - [38], GC celler, der anvendes i vores undersøgelse kan være resistente over for Res-induceret apoptose Res har flere mål.; blandt hvilke, klasse III-NAD + - afhængige deacetylase SIRT1 er den hyppigst undersøgt. Selv om en biokemisk undersøgelse viste, at Res ikke var en direkte aktivator af SIRT1 [39], er Res stadig været betragtet som en klassisk agonist af SIRT1. Talrige undersøgelser viser, at Res udøver forskellige virkninger i forskellige modeller i en SIRT1-afhængig måde [40], [41]. I vores eksperiment, SIRT1-udtømning vendt væksthæmning af Res både in vitro Tilsammen vores resultater tyder på, at Res hæmmer både spredning af GC celler in vitro
ved hjælp af en nøgne mus xenograftmodel. Resveratrol (40 mg /kg /d) udøves inhiberende aktiviteter på gastrisk cancerudvikling og signifikant reducerede fraktioner af Ki67-positive celler i tumorprøver fra nøgne mus. Efter resveratrol behandling, induktion af ældning og ændringerne i ekspressionen af de involverede i cellecyklus og ældning veje regulatorer svarede til, hvad vi observerede in vitro
. Men udtømningen af sirtuin (SIRT) 1 vendt de ovenfor beskrevne virkninger af resveratrol både in vitro
in vivo
. Vores data tyder på, at resveratrol hæmmer gastrisk kræft i en SIRT1-afhængig måde og give detaljerede beviser for muligheden for at anvende resveratrol i gastrisk forebyggelse og terapi kræft
infektion og udvikling af GC [3]. Desuden har værten genetiske, miljø-, diætetiske og andre faktorer været impliceret i det gastriske onkogene proces [1]. Da det stadig er vanskeligt at foretage en tidlig diagnose for GC, er de fleste af de patienter, diagnosticeret på fremskredne stadier. Trods forbedringen af konventionelle terapier for avanceret GC, herunder kirurgi, kemoterapi og strålebehandling, længden eller livskvalitet hos patienter med fremskreden GC er stadig dårlig [2], [4]. Derfor er et presserende behov for udforskning af nye forebyggende lægemidler eller terapeutiske mål for GC.
. Res behandling induceret cellecyklusstandsning ved G1 fasen og førte til cellulær ældning. Disse virkninger af Res blev vendt ved udtømning af SIRT1. De hæmmende SIRT1-afhængige aktiviteter Res på GC celler blev også bekræftet in vivo
. Tilsammen vores resultater viser, at Res udøver SIRT1-afhængige hæmmende virkning på GC og foreslår en terapeutisk rolle for Res i GC.
Materialer og metoder
Lille Interference RNA transfektion
Cell Levedygtighed Assay
kolonidannelse Assay Salg
Cell Cycle Analysis
Apoptose Assay
β-galactosidasefarvning
Stabile Lentivirale-kort hårnål RNA (shRNA) GC Celler
Real Time-kvantitativ PCR (RT-QPCR)
Western Blot
Statistiske Analyser
Resultater
Res Formindsker Klonogen potentiale af GC-celler i en SIRT1-afhængig måde
Res inducerer den Ophobning af GC celler i G1 fase i en SIRT1-afhængig måde
Res inducerer Ældning af GC Celler i en SIRT1-afhængig måde
Res Hæmmer tumorvækst in vivo i en SIRT1-afhængig måde
undersøgelse blev stabile transduceret lentiviral-shRNA BGC-823 celler anvendes. Af de fire SIRT1 shRNA-lentivira, LV-1 og LV-4 udøvede indlysende lyddæmpende effekt på SIRT1 ekspression (figur S2). Efter fire ugers screening blev ekspressionen af SIRT1 fastholdes på de nedsatte niveauer i de stabile lentiviral-shRNA BGC-823 celler (Figur S2). Stabile LV-1 lentiviral-shRNA BGC-823 celler blev anvendt i efterfølgende xenografter studier på grund af de stærkere hæmmende effekt på SIRT1 udtryk i forhold til LV-4. Alle dyrene overlevede til slutningen af vore forsøg, og ingen åbenlyse forskel blev fundet i deres kropsvægt (data ikke vist). Fire uger efter implantation, målinger af tumor bind viste, at Res behandling væsentligt reduceret væksten af BGC-823-xenografter (Res vs kontrol: 0.5728 ± 0,2276 cm 3 vs 1.4288 ± 0,1741 cm 3, P < 0,001) . Stabil transduktion af kontrollen shRNA-lentivirus påvirkede ikke signifikant tumor volumen (Res vs Res + Ci: 0.5728 ± 0,2276 cm 3 vs 0,68 ± 0,0672 cm 3, P = 0,603). Men i de SIRT1-forarmet xenotransplantater, de hæmmende virkninger af Res på tumorvækst blev reddet (Res + Si vs Res + Ci: 1.2313 ± 0,1777 cm 3 vs 0,68 ± 0,0672 cm 3, P < 0,001, Res + Si vs kontrol: 1.2313 ± 0,1777 cm 3 vs 1,4288 ± 0,1741 cm 3, P = 0,123) (figur 5A). I de Res-behandlede xenotransplantater, spredning markering, Ki67, faldt betydeligt (figur 5B) (% af Ki67-positive celler, Res vs kontrol: 3 ± 1,8 vs 44.67 ± 3.79, P < 0,001). Senescens blev observeret i xenotransplantater fra Res-behandlede mus er angivet med β-Gal-farvning (figur 5B). Der blev imidlertid ikke indlysende apoptose induceret af Res i xenotransplantaterne (Figur S1D) og blev ikke observeret nogen ændringer i de regulatorer af apoptose, såsom bcl-2, bax og caspase-3 (figur S1c). Disse resultater var i overensstemmelse med de in vitro
eksperimenter. Desuden ændringerne i ekspressionen af regulatorer af cellecyklus, herunder cyklin D1, CDK4, CDK6, p21 og p16 svarede til, hvad vi observerede in vitro
(figur 5C). Alle de observerede i Ki67, β-Gal og cellecyklus-regulatorer ændringer blev vendt ved SIRT1 udtømning (figur 5B og C) (% af Ki67-positive celler, Res + Si vs Res + Ci: 46,32 ± 6,03 vs 2,65 ± 1,53, P < 0,001, Res + Si vs kontrol: 46,32 ± 6,03 vs 44,67 ± 3,79, P = 0,946)
og derfor ikke giver mening i en klinisk [13], [14]. Derfor blev de to nedre effektive koncentrationer af 25 og 50 um Res anvendt i de efterfølgende undersøgelser. Vækstinhiberingen aktivitet Res synes at være cellespecifik, som IC50 forskellig alt efter celletype og varierer fra 27 pM til 180 pM [9], [10], [15], [16]. Nogle af disse undersøgelser har også vist, at Res udøver de hæmmende effekter i en tidsafhængig måde [15], [16]. Koncentrationen og varigheden af Res behandling anvendt i vores undersøgelse var i overensstemmelse med de fleste rapporter fra andre grupper [8], [9], [16]. For in vivo
undersøgelse, administrationen metode vi brugte er sondeernæring, fordi det er den metode, der er almindeligt anvendt i mus som et alternativ til intraperitoneal injektion [15], [17]. Desuden har studier i mus viste, at Res absorberes effektivt efter oral administration og kan findes i hele kroppen [17], [18]. Når det bruges in vivo
, Res faldt betydeligt spredning af celler som er karakteriseret ved Ki67 udtryk, der er i overensstemmelse med resultaterne fra vores in vitro
eksperimenter.
data viste, at behandlingen af GC celler med Res inducerer G1 fase anholdelse. G1-fasen er den første af de fire faser af cellecyklus, der finder sted i eukaryot celledeling. G1 er et særligt vigtigt cellecyklus fase, fordi det er det punkt, hvor en celle forpligter sig til en runde af division. Progression gennem G1 fasen kræver dannelsen og handling af cyklin D-CDK4 eller -CDK6 komplekser. Disse komplekser derefter phosphorylere retinoblastom, hvilket fører til frigivelse af E2F transkriptionsfaktorer og nedstrøms gentranskription involveret i S-fase progression. Aktiviteterne af cyclin D-CDK-komplekser er reguleret af opstrøms-hæmmere, herunder medlemmer af INK (p15, p16 og p18) og CIP familier (p21, P27 og P57) [20], [21]. Langs den samme linje, ledsaget med G1 fasen anholdelse, observerede vi nedregulering af cyklin D1, CDK4 og CDK6 og opregulering af p21 og p16 i Res-behandlede GC celler. Vores in vivo
resultater af ekspressionsniveauerne af disse cellecyklus regulatorer i tumor prøver er i overensstemmelse med in vitro
resultater. Vores resultater er også i overensstemmelse med de tidligere undersøgelser [15], selv om nogle andre har rapporteret, at S-fasen anholdelse fremkaldes af Res [9], [19]. Persistens af vækststandsning kan føre til apoptose eller senescens i celler. Fordi både p21 og p16 signalveje deltage i senescens progression medieret af forskellige typer af stress [22], [23], udførte vi β-Gal-farvning. Res behandling signifikant øget hyppighed af ældede GC-celler på en dosis-afhængig måde. Den cellulære ældning program udgør en væsentlig barriere mod kræft initiering og udvikling [24], [25]. Selvom tidligere undersøgelser viser, at gennem dæmpningen af oxidativ stress og forbedring af stofskiftet, Res udøver anti-aging effekter både in vitro
in vivo
[26] - [28], de modsatte virkninger er blevet vist i cancer. Res har vist sig at inducere senescens-lignende vækstinhibering i flere typer af cancere [29], [30]. Den dobbelte rolle Res i cellulær ældning, forsinker ældning i normale væv og fremskynde degeneration i tumorer, gør det til en ideel kandidat til forebyggelse og behandling af kræft.
in vivo
. G1 fasen anholdelse og ældning induceret af Res behandling blev reddet af SIRT1-udtynding. Disse resultater indikerer, at inhiberingen virkninger Res på GC er afhængige af SIRT1. Ifølge de tidligere undersøgelser, kan SIRT1 regulere genekspression via to forskellige mekanismer. Første, direkte, SIRT1 direkte medierer deacetylering af et protein og derefter øger sin ubiquitinering og efterfølgende ubiquitin proteasom nedbrydning [42]. For det andet, indirekte SIRT1 udøver deacetylase aktivitet påvirke bekræftelse kromatin eller undertrykke aktiviteter transkriptionsfaktorer og derefter regulerer transskriptionen af gener [43] - [45]. Da molekylerne (cyclin D1, CDK4, CDK6, p21 og p16) detekteret i vores eksperimenter er ikke blevet rapporteret som de direkte mål for SIRT1, vi spekuleret på, at SIRT1 kunne regulere ekspressionen af disse gener hovedsageligt gennem indirekte mekanisme. Resultaterne af RT-QPCR understøtter også denne hypotese.
og væksten i implanteret in vivo
. Res behandling inducerer G1 fase anholdelse i GC celler og fører til aldring i stedet for apoptose. SIRT1-udtømning redder de ovenfor beskrevne virkninger af Res både in vitro
og in vivo
. Vores arbejde viser, at Res hæmmer GC i en SIRT1-afhængig måde og giver detaljerede beviser for muligheden for at anvende Res i forebyggelse og terapi GC.
Støtte Information
Figur S1.
Res udøver ingen virkning på apoptose af BGC-823 celler. (A) Apoptose blev indikeret ved TUNEL-mærkning (rød) og BGC-823 celler blev modfarvet med DAPI (blå). Behandling med H 2O 2 tjente som den positive kontrol. Original forstørrelse: × 200. Scale barer, 50 um. (B) regulatorer af apoptose i BGC-823 celler, herunder bcl-2, Bax og caspase-3 blev analyseret ved western blot. (C) regulatorer af apoptose i xenotransplantater, herunder bcl-2, Bax og caspase-3 blev analyseret ved western blot. Til påvisning af kløvet caspase-3, BGC-823 celler behandlet med H 2O tjente 2 som den positive kontrol (vist i panelet til højre). (D) Apoptose i xenotransplantater blev detekteret ved TUNEL-mærkning (rød) og blev snittene modfarvet med DAPI (blå). Sektioner fra kvindelige gnaver brystkirtel opnået 3~5 efter fravænning af rotteunger (Millipore) tjente som den positive kontrol. Original forstørrelse: × 200. Scale barer, 50 um. "R" repræsenterer resveratrol, "Ci 'repræsenterer kontrol siRNA, og" Si "repræsenterer SIRT1 siRNA
doi:. 10,1371 /journal.pone.0070627.s001
(TIF)
Figur S2.
Knockdown af SIRT1 af shRNA-lentivirus. (A) BGC-823 celler blev transficeret med kontrol eller SIRT1-specifikke shRNA-lentivira. Transfektionseffektiviteten blev bedømt med et fluorescensmikroskop. Ved en infektionsmultiplicitet (MOI) på 50, blev mere end 90% af cellerne transficeret med shRNA-lentivirus. Efter fire ugers screening med puromycin, blev alle de levende celler transduceret. Forstørrelse: x 100, bar for 200 um. (B) Cellerne blev høstet 4 dage efter infektion og 28 dage efter puromycin screening. Den silencing effektivitet SIRT1 blev bekræftet ved Western blot
doi:. 10,1371 /journal.pone.0070627.s002
(TIF)
tabel S1.
Primere for RT-qPCR forsøg udført i denne undersøgelse
doi:. 10,1371 /journal.pone.0070627.s003
(DOC)
Økologiske æbler har probiotiske egenskaber
Mikroplast identificeret i menneskeligt affald for første gang
Kaffe hjælper med at udvikle sunde tarmmikrober og hjælper afføring
Ny forskning identificerer en forbindelse mellem tarmmikrobiomet og slagtilfælde
Personer med IBS -symptomer vil sandsynligvis have lave niveauer af D -vitamin,
Tilstedeværelse af visse tarmbakterier hos mødre kan beskytte babyer mod fødevareallergi
SARS-CoV-2-infektion forlænger viral shedding og lymfocyttab hos patienter med kræft
Patienter med kræft har en mere udfordrende tid med infektioner under behandling-hvilket placerer dem som en høj risiko for alvorlig COVID-19 sygdom og død. Imidlertid, hvordan det alvorlige akutte re
Dysbiose i tarmmikrobiota kan forårsage alvorlig sekundær infektion hos COVID-19-patienter
En interessant undersøgelse ledet af forskere i USA har for nylig afsløret, at det mikrobielle samfund i tarmen er direkte påvirket af alvorligt akut respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2),
Hvad er et ERCP?
Hvis vi har mistanke om et potentielt problem med galdeblæren, galde system, bugspytkirtel, eller lever, vi kan bestille en endoskopisk retrograd cholangiopancreatography (ERCP). En ERCP undersøger, h