PLoS ONE: Resveratrolis Slopina skrandžio vėžio augimą skatinančius G1 fazės suimti ir senatvė į Sirt1 priklausomas Manner

Anotacija pervežimas

Resveratrol, natūraliai pasitaikančio polyphenolic junginys, buvo pranešta, kad daryti vėžio veiklą įtakos įvairūs molekuliniai taikiniai. Šiame tyrime mes išnagrinėjo poveikį ir pagrindinius mechanizmus resveratrolio skrandžio vėžio. Mes nustatėme, kad resveratrolis slopina skrandžio vėžio ląstelių proliferaciją priklausomai nuo dozės priklausomu būdu. Pasibaigus 25 ir 50 mikromolių koncentracijos, resveratrolis slopina ląstelių gyvybingumą ir sumažino clonogenic potencialą skrandžio vėžio ląsteles. Resveratrolis gydymas suimtas skrandžio vėžio ląstelių G1 fazės ir paskatino senėjimo vietoj apoptozės. Reguliavimo ląstelės ciklo ir senėjimo būdų, įskaitant ciklino D1, ciklino priklausoma kinazės (CDK4 ir 6), p21 ir P16, buvo dysregulated iki resveratrolis gydymą. Slopinančio poveikio resveratrolio skrandžio vėžiu, taip pat buvo tikrinami vivo
naudojant nuogas pelės svetimo modelį. Resveratrolis (40 mg /kg, /D) darė slopinamąjį veiklą skrandžio vėžio vystymosi ir žymiai sumažino KI67 teigiamų ląstelių frakcijų naviko egzempliorių iš nuogas pelių. Po resveratrolis gydymo, kad senėjimo indukcija ir į reguliavimo dalyvaujančių ląstelių ciklo ir senėjimo kelius išraiškos pokyčiai buvo panašūs į tai, ką mes nustatėme, in vitro
. Tačiau Sirtuin (SIRT) 1 išeikvojimas atstatomas anksčiau aprašytus padarinius resveratrolio ir in vitro parsisiųsti ir vivo
. Mūsų duomenys rodo, kad resveratrolis slopina skrandžio vėžiu per Sirt1 priklausomu būdu ir pateikti išsamius įrodymus siekiant taikyti resveratrolis skrandžio vėžio prevencijos ir gydymo galimybės

nurodomoji dalis:. Jonas Klausimas Wang B Zang W Wang X Liu Z, Li W, ir kt. (2013) Resveratrolis Slopina skrandžio vėžio augimą skatinančius G1 fazės suimti ir senescence į Sirt1 priklausomu būdu. PLoS ONE 8 (11): e70627. Doi: 10,1371 /journal.pone.0070627

redaktorius: Dominique Heymannas, Faculté de médecine de Nantes, Prancūzija

Įstojo: Kovo 20, 2013; Priėmė: Gegužės 19, 2013 m Paskelbta: Lapkričio 21, 2013

Visos teisės saugomos: © 2013 Yang et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Šis darbas parėmė Nacionalinės Gamtos mokslo fondo Kinijos (Nr 81.101.869, 81.100.103, 81.171.536 ir 81000868), Nacionalinė pagrindinių mokslinių tyrimų programą Kinijos (973 programos, Nr 2012CB911202), ir nepriklausomas inovacijų fondas Shandong University (2012TS108) .Sriegines finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

Skrandžio vėžys (GC) yra ketvirtoji dažniausia vėžio ir antra pagrindinė priežastis, dėl vėžio susijusio mirtingumo pasaulyje. Pagal pasaulio vertinimo, iš 989,600 naujų GC atvejais iš viso buvo diagnozuota ir iš 738,000 pacientų minimalus mirė nuo šios ligos 2008 metais, sudaro 10% visų mirčių nuo vėžio [1]. Nors GC dažnis mažėjo visame pasaulyje, jis lieka aukštos besivystančiose šalyse, ypač Kinijoje [1], [2]. Ankstesni tyrimai atskleidė, kad intymius santykius tarp lėtiniu gastritu, kurį sukelia Helicobacter pylori
infekcija ir GC plėtros [3]. Be to, priimančiosios genetinių, aplinkos, maisto ir kitų veiksnių buvo susijęs skrandžio onkogeninių procese [1]. Kaip ji vis dar sunku anksti diagnozuoti ligą GC, dauguma pacientų diagnozuojama stadijose. Nepaisant tradicinių terapijos Išplėstinė GC, įskaitant chirurgija, chemoterapija ir radioterapija, ilgio ar gyvenimo kokybę pacientams, sergantiems progresavusia GC gerinimo vis dar prasta [2], [4]. Todėl naujas prevencines narkotikų ar terapinių tikslų GC žvalgyba skubiai reikia.

Vartojimas šviežių vaisių ir daržovių prisideda prie sumažėjusio sergamumo vėžiu, įskaitant GC [2], [5]. Klinikinėje praktikoje taip pat rodo, kad kai kurie biologiškai aktyvių dietiniai molekulės turi galimybę slopinti kelis onkogeninių veiksmus [5] - [7]. Resveratrolis (res, 3,5,4'-trihydroxystilbene) yra natūraliai polyphenolic junginys esantis beveik 70 augalų rūšių, įskaitant raudonųjų vynuogių, riešutų, uogų ir kitų odos [6] - [8]. Res pirmą kartą buvo pranešė, kad daryti antinavikinį veiklą 1997 [8]. Vėliau ataskaitos parodė, kad Res suteikia slopinamąjį poveikį kelių rūšių vėžio, pavyzdžiui, gaubtinės žarnos vėžio, krūties vėžio ir limfomos, ir paveikia įvairių molekulinius taikinius [9] - [11]. Sirtuin 1 (Sirt1), III kategorijos nikotinamido adenino nukleotidų (NAD ^{+) - priklauso histono /baltymų deacetilazės, buvo pranešta, kad pagrindinį tikslą res keliose auglio modelių [9], [10]. Tačiau kai kurie duomenys rodo, prieštaraujančius rezultatus, rodančius, kad "Res daro chemoprotekciniu poveikį nepriklausančias Sirt1 [11]. Slopinančio poveikio Res apie GC ir pagrindinės mechanizmo nėra gerai ištirtas.}

Šiame tyrime mes parodėme, kad "Res slopino GC ląstelių proliferaciją in vitro
. Res gydymo sukelto ląstelių ciklo suėmimą tuo G1 fazės ir lėmė ląstelių senėjimo. Šie res poveikis buvo grįžtamąja išnaudosime Sirt1. Slopinančio Sirt1 priklausoma veikla res apie GC ląstelių, taip pat buvo tikrinami vivo
. Kartu paėmus, mūsų rezultatai rodo, kad "Res daro Sirt1 priklausoma slopinamąjį poveikį GC ir siūlo gydomąjį vaidmenį Res GC.

Medžiagos ir metodai

Etika pareiškimas

Visi tyrimai su gyvūnais patvirtino etikos komiteto Shandong University School of Medicine (Nr 001 2011 dėl gyvūnų etikos patvirtinimo) ir buvo dedamos visos pastangos, kad kuo mažiau kentėtų.

Mobilaus ryšio linijos, kultūra sąlygos ir raiška gydymo

"žmogaus GC ląstelių linijos" AGS (gaunami iš ląstelių Resource Center, Šanchajus instituto Biochemijos ir ląstelių biologijos Kinijos mokslų akademijos), BGC-823 ir SGC-7901 (įsigyjamas iš Kinijos centro tipas kultūros kolekcijos, Wuhan, Kinijos) buvo naudojami šiame tyrime. Ląstelės buvo auginamos F12 (AGS) arba RPMI 1640 (BGC-823 ir SGC-7901), kuriame yra 10% FCS, 100 vienetų /ml penicilino ir 2 mmol /l L-glutaminas 37 ° C temperatūroje drėgnoje atmosferoje, kurių sudėtyje yra 5% CO _{2. Didelio grynumo Res pirktas iš Sigma (St. Louis, MO, JAV), ištirpintas DMSO ir pridėta į kultūros terpėje, esant rodoma koncentracija. Visi eksperimentai buvo atliekami 24 h po Res papildų, jeigu nenurodyta kitaip.}

Mažas trukdžiai RNR transfekcijq

Chemiškai modifikuoti sirnr (siRNA) skirtos Sirt1 ir kontrolės siRNR buvo perkamos iš GenePharma (Šanchajus , Kinija). Priemonės, kuriomis Sirt1 siRNA seka buvo 5'-CCAUCUCUCUGUCACAAAUTT-3 '. Ląstelės inkubuojamos per naktį ir tada perkeltų su siRNA naudojant Lipofectamine 2000 (INVITROGEN, Carlsbad, CA, JAV) pagal gamintojo protokolą. Keturiasdešimt aštuonias valandas po siRNA transfekciją, ląstelės prieš tolesnį tyrimą buvo gydomi 50 mkm Res 24 val.

Mobilaus ryšio gyvybingumo tyrimą

proliferacija buvo vertinama naudojant Cell titras 96 ® vandeninės vienas sprendimas ląstelių proliferaciją Analizės (Promega Madison, WI, JAV). Trumpai, 2 × 10 ^{3 ląstelės buvo pasėjamos į 96-šulinėlių plokštelės ir leidžiama augti 24 h. vėliau dvidešimt keturias valandas, 20 mikrol, MTS (3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3-karboksi-metoksifenil) -2- (4-sulfofenil) -2H-tetrazolio) buvo pridedama prie kiekvieno gerai. Po inkubacijos 3 h 37 ° C, esant 490 nm absorbcijos buvo užfiksuotas ant Varioskan Flash daugiaplokštėmis skaitytuvas (Thermo Scientific, Waltham, MA, JAV). Ląstelių gyvybingumas buvo apskaičiuojamas pagal šią formulę: Santykinis ląstelių gyvybingumas = (vidutinis optinis tankis, išvalytų grupės - vidutinis absorbcija tuščias) /(vidutinis absorbcijos kontrolės grupinio vidutinis absorbcija tuščias). Tyrimai buvo pakartotas tris kartus ir kartojamas tris kartus.}

kolonija Formavimo Analizės

Ląstelės buvo pasėjamos į 6-duobučių lėkštelėse (300 arba 500 ląstelių viename šulinėlyje) ir inkubuojami 10 dienų, kol kolonijos buvo pakankamai didelis, kad būtų aiškiai išskirti. Ląstelės buvo fiksuojami metanoliu ir nudažomi su violetinei ir kolonijų skaičius su daugiau nei 50 ląstelių buvo skaičiuojamas rankiniu būdu. Eksperimentai buvo pakartotas tris kartus ir kartojamas tris kartus.

ląstelės ciklo analizė

Ląstelės buvo nuimta, fiksuoto su iš anksto atšaldytą 70% etanolio, esant 4 ° C temperatūroje per naktį ir vėliau yra nudažomi su propidiumo jodido (Beyotime , Jiangsu, Kinija), kurių sudėtyje yra RNaze A esant 37 ° C temperatūroje 30 min, tamsoje. Ląstelės ciklo pasiskirstymas nustatomas naudojant tėkmės citometre (BD biomokslų, San Chosė, CA, JAV) ir duomenys buvo analizuojami Multicycle programinės įrangos (Phoenix srauto sistemos, San Diego, CA, JAV). Eksperimentai buvo atliekami nepriklausomai tris kartus.

Apoptozę Analizės

aptikimo ir kiekybinio apoptozės buvo atliktas DNR grandinės trūkio ženklinimo naudojant in situ ląstelių mirtis Detection KIT, TMR raudona (Roche Applied Science, Bazelis, Šveicarija). Ląstelės arba parafino skyriai audiniuose, buvo pažymėtas tunelis pagal gamintojo instrukcijas. Ląsteles, gydymas 0,2 mM H _{2O 2 už 12 val tarnavo kaip teigiamos kontrolės. Parafino skyriuose, teigiami kontroliniai mėginiai buvo įsigytas iš Millipore (Billerica, MA, JAV). Branduolys buvo counterstained su DAPI (Beyotime) ir skaidres ar skyriai buvo nufotografuota pagal fluorescencijos mikroskopijos ( "Olympus", Tokijas, Japonija), naudojant cellSens dimensijos programinę įrangą. Eksperimentai buvo atliekami nepriklausomai tris kartus.}

β galaktosidazei Dažymo

senescence buvo įvertintas naudojant senėjimo beta-galaktozidazė Dažymo Kit (Beyotime). Trumpai, ląstelės arba šaldyti profiliai iš audiniuose, kuriuose buvo nustatyti, ir inkubuojami su šviežiai paruošto beta-galaktozidazės (β-Gal) dažymo tirpalas, kuriame yra 37 ° C temperatūroje per naktį. Eksperimentai buvo atliekami nepriklausomai tris kartus.

Stabilūs lentiviruso trumpas segtukas RNR (shRNR) GC Ląstelės

lentiviruso vektoriai, kurių sudėtyje yra kontrolės ar Sirt1 shRNR buvo sukonstruoti GenePharma ir naudoti transfekcijai BGC-823 ląstelių. Efektyvus nokdaunas iš Sirt1 buvo patikrintas Vakarų dėmė. Dėl stabilios perdavime, kontrolės lentivirus užsikrėtę arba Sirt1 shRNR-lentivirus užsikrėtę bgc-823 ląstelės buvo auginamos pateikta su 2 mikrogramai /ml puromicino keturias savaites ir laikyti LV-C ir LV-S, atitinkamai visiškai terpėje.

nude pelės ksenografiniuose Modelis

Moteris athymic Balb /c nuogas pelėms (6~8 savaites) buvo nupirkta iš Pekino universitete (Pekinas, Kinija) ir išliko tam tikromis patogenais neužkrėstų sąlygomis tuo raktu laboratorija širdies ir kraujagyslių Remodeling ir funkcijos tyrimų Qilu ligoninėje, Shandong University. Pelėms buvo atsitiktinai suskirstyti į keturias grupes (8 pelėmis kiekvienos grupės) I grupės ir II BGC-823 ląstelių (1 × 10 ^{6 ląstelės per injekcinė 0,1 ml PBS) buvo po oda švirkščiamas į šono regionas nude peles; III grupėje buvo švirkščiamas LV-C (bgc-823 ląstelių); ir IV grupės, LT-S "(BGC-823 ląstelių) buvo švirkščiamas. Po implantavimo, nuogas pelių iš II grupės, III ir IV buvo gydomi Res (40 mg kg -1 0,1 ml augalinio aliejaus, administruoja zondą, vieną kartą per parą). Po oda, naviko dydis buvo matuojamas slankmačiu ir naviko apimtys buvo apskaičiuojamas pagal formulę (ilgis) × (plotis 2) /2. Pelės buvo paaukotos keturias savaites vėliau. Augliai buvo surinktos ir tvarkomi Vakarų dėmė ir imunocheminių studijas.}

Realaus laiko-kiekybine PGR (RT-QPCR)

Viso RNR ląstelėse buvo izoliuotas naudojant TRIzol reagento (Invitrogen) ir konvertuojamos į kDNR naudojant PrimeScript ™ RT reagento komplektas (Takara, Tokijas, Japonija). AT-QPCR buvo atlikta genų, įskaitant ciklino D1, ciklino priklausoma kinazės 4 (CDK4), p21 ir beta-aktino kaip aprašyta anksčiau [12]. Iš amplifikacijos pradmenų sekos yra išvardytos S1 lentelėje. MRNR išraiška ciklino D1, CDK4 ir p21 buvo standartizuoti beta-aktino, lyginant su kontroliniu naudojant 2 ^{-ΔΔCt metodą. Kiekvienas eksperimentas buvo pakartotas tris kartus.}

Vakarų dėmė

Viso baltymų iš ląstelių ar naviko egzempliorių buvo ekstrahuojamas Ripa lizuoja buferis (Beyotime), kaip aprašyta [12]. Baltymų koncentracija buvo nustatoma naudojant BCA Baltymai Analizės rinkinį (Pierce, Rockford, IL, JAV). Membrana buvo tyrinėjo su antikūnų Sirt1 (Abcam, Cambridge, MA, JAV), BCL-2, Bax, kaspazės-3, ciklino D1, CDK4 ir 6 (Cell signalizacijos, Danvers, MA, JAV), P16 ir P21 (Santa cruz biotechnologijos, Santa Krusas, Kalifornija, JAV). Naudojamas antrinis antikūnų buvo krienų peroksidazės (HRP) konjuguoto anti-triušį ar pelės antikūnų. Baltymų juostos buvo ryškinamos naudojant ECL sistemą (Pierce). β-aktino (Mobilusis signalizacijos) tarnavo kaip pakrovimo kontrolę.

imunohistocheminis

naviko pavyzdžiai nuogas pelių buvo deparaffinized, rehidrataciją ir antigeno paimti. Skyriai buvo inkubuojamos su antikūnu prieš KI67 (1:500, Abcam) per naktį 4 ° C temperatūroje. HRP konjuguoto anti triušio IgG ir TBP dažymo dirbo vizualizuoti KI67 antikūnų. Skaidrės pagaliau buvo counterstained hematoksilinu. Skaidrės buvo nufotografuota Olympus šviesos mikroskopu (Tokijas, Japonija), naudojant cellSens dimensijos programinę įrangą. Į KI67 teigiami ląstelės buvo skaičiuojami rankiniu būdu ir KI67 teigiamų ląstelių proc buvo vertinami už srityse. Penki atskiri laukai buvo skaičiuojami kiekvienai sekcijai.

statistikos Analizuoja

duomenys buvo pateikiami kaip vidurkis ± SD. Statistinės analizės buvo atliekamos naudojant statistikos paketą, skirtą socialinių mokslų (SPSS, versija 16.0, Čikaga, IL, JAV) ANOVA su Tukey anketa post-hoc testą. P-reikšmės mažiau nei 0,05 buvo laikomas statistiškai reikšmingas.

Rezultatai

Res Slopina GC ląstelių gyvybingumą Sirt1 priklausomu būdu

Trys GC ląstelių linijas (MAA, BGC-823 ir Tarybos generalinis sekretoriatas-7901) buvo nagrinėjami mūsų eksperimentams. Kultivavimą transporto priemonių (0,1% DMSO) neturėjo įtakos ląstelių gyvybingumui ląsteles (duomenys neparodyti). Tačiau, kai gydomi skirtingų koncentracijų Res 24 h, ląstelių proliferacija buvo priklausomai nuo dozės slopina esant 25, 50, 100 ir 200 mikronų Res (1A pav). Pažymėtina, platinimo AGS buvo akivaizdžiai slopinamas, kai gydomi 10 mkm Res, kuri nebuvo pastebėta kitų dviejų ląstelių linijas (1A pav.) Visose trijose ląstelių linijų, 100 mkm Res buvimas buvo nepakankamas, kad sukeltų daugiau nei 50% augimo slopinimą (56.78% už AGS, 54.87% už BGC-823 ir 52.16% už SGC-7901, atitinkamai). Todėl, 25 ir 50 pM Res buvo naudojami vėlesnių eksperimentų. Norėdami nustatyti funkcinę vaidmenį Sirt1 RES gydymo, mes nuvertė Sirt1 išraišką naudojant specialią siRNA. Efektyvus slopinimas Sirt1 išraiška buvo patikrintas Vakarų dėmė (1b pav.) Šio MTS tyrimo rezultatai parodė, kad Sirt1-nusodrintojo ląsteles, Res neslopina ląstelių proliferaciją (1c pav.) Šie duomenys rodo, kad "Res gali slopinti GC ląstelių ir kad slopinančio poveikio platinimu gali būti išgelbėti Sirt1 išeikvojimo.

Res Mažina Clonogenic potencialą GC ląstelių į Sirt1 priklausomu būdu

naviko ląstelių, kolonija formavimas buvo nustatyta, kad būti daugiau jautrus parametras nei gyvybingumo įvertinti panaudojimas gamybai vaisto, poveikį. Taigi, pastangos buvo tada įsipareigojo nustatyti res poveikį clonogenic potencialo GC ląsteles. Res, bent 25 mikromolių koncentraciją, leido gerokai sumažinti židinių skaičių, taip pat dydžių GC ląsteles. Po gydymo 50 mkm Res, The clonogenic potencialas sumažėjęs ir toliau. Tačiau nokdaunas iš Sirt1 prieš Res gydymo padidino židinių numerį lygiaverčiai transporto priemonės grupei (2 pav.)

Res Skatina GC ląstelių kaupimosi G1 fazės A Sirt1 priklausomu būdu

Jei išnagrinėti slopinančio poveikio res apie GC ląsteles, mes atliekame ląstelių ciklo analizę. Mes pastebėjo, kad 25 ir 50 mikronų Res padidino ląstelių proporciją G1 fazės tiek BGC-823 ir Tarybos generalinis sekretoriatas-7901 ląstelių (duomenys 3A ir 3B). Iš G1 fazės suėmimo pagal Res indukcija taip pat priklausė nuo dozės. Res mažiausiai 50 mikromolių koncentraciją parodė didesnį poveikį nei tai padarė 25 mikromolių. Iš ląstelių į G1 fazę skaičiaus padidėjimas lydėjo į ląstelių populiacijų daugiausia S fazių sumažėjimas. Iš Sirt1 išeikvojimas iki Res gydymo sumažėjo G1 fazės indukciją RES (Skaičiai 3A ir 3B). Norėdami patvirtinti pirmiau minėtus rezultatus, mes išnagrinėjo ląstelinio ciklo reguliavimo G1 fazės, įskaitant ciklino D1, CDK4, CDK6, p21 ir P16 į BGC-823 ląstelių išraiška. Kaip parodyta Fig.3C, RES gydytų bgc-823 ląstelių, baltymų lygius aktyvatorių G1 /S perėjimo (cikloniniai D1 CDK4 ir CDK6) sumažėjo, o baltymų lygis inhibitoriais CDKs (CDKIs) (P21 ir P16) padidėjo. Priešingai, šie pokyčiai nebuvo rasta Sirt1-nusodrintojo BGC-823 ląstelių, kai jie buvo gydomi 50 mkm Res. Panašūs rezultatai buvo gauti iš RT-QPCR iš ciklino D1, CDK4 ir p21 (3D pav.)

sub-G1 ląstelių stoka rodo, kad "Res gydymas nebuvo sukelti apoptozę GC ląstelių (3A pav) , kuris buvo suderintas su rezultatais Tünel ženklinimo eksperimentų BGC-823 ląstelių (S1A pav). Sudėtyje esantis baltymų lygiai apoptozės susijusių molekulių, pavyzdžiui, BCL-2, bax ir kaspazės-3, iš kiekvienos grupės buvo panašus (S1B pav). Kartu paėmus, mūsų rezultatai rodo, kad "Res skatina G1 fazės arešto GC ląstelių į Sirt1 priklausomu būdu ir nesukelia apoptozę.

Res Skatina senescence GC ląsteles Sirt1 priklausomu būdu

mūsų rankose, raiška sukelia augimo sustojimas, o ne padidėjo apoptozės. Todėl mes ir toliau dėjo pastangas ištirti, ar "Res galintys sukelti sočią senatvę GC ląsteles. beta-Gal dažymo, specifinis žymuo žinduolių senstančių ląstelių, buvo naudojami. Po Res gydymo, mes nustatėme, neišaugs frakcijos ląstelių buvo tamsintas su beta-gal. Tačiau išankstinis apdorojimas su Sirt1 siRNA užblokuotas Res-sukeltą ląstelių sočią senatvę (4 paveikslas). Panašūs rezultatai buvo gauti ir iš BGC-823 ir Tarybos generalinis sekretoriatas-7901 ląstelių, o tai rodo, kad Res išlaikytiniai ant Sirt1 sukelti ląstelių sočią senatvę GC ląsteles.

Res Slopina naviko augimą in vivo per Sirt1 priklausomu būdu

Be to, buvo atlikti papildomi tyrimai, siekiant nustatyti res poveikį BGC-823 ksenoimplantai augimo nuogas pelių. Dėl in vivo, pervežimas tyrime buvo naudojami stabilūs transdukuoti lentiviruso-shRNR BGC-823 ląstelių. Iš keturių Sirt1 shRNR-lentiviruses, LT-1 ir LT-4 darė akivaizdžių triukšmo slopinimo poveikį Sirt1 išraiškos (S2 pav.) Po keturių savaičių tikrinimu, Sirt1 išraiška buvo išlaikomas lygis sumažėjo stabilioje lentiviruso-shRNR BGC-823 ląstelių (S2 pav). Stabilus, LV-1 lentiviruso-shRNR BGC-823 ląstelės buvo naudojama vėlesniuose ksenoimplantai tyrimų dėl stipresnių slopinamąjį poveikį Sirt1 išraiška lyginant su LV-4. Visų gyvūnų išliko iki Savo eksperimentų pabaigoje ir ne akivaizdus skirtumas buvo nustatyta jų kūno svorio (duomenys neparodyta). Keturias savaites po implantavimo, matavimai auglio apimtis nurodyta, kad "Res gydymas žymiai sumažino BGC-823 audiniuose, augimą (res vs kontrolės: 0.5728 ± 0,2276 cm ^{3 vs 1.4288 ± 0,1741 cm 3, p < 0,001) , Stabilus perdavime kontrolinės shRNR-lentiviruso neturėjo reikšmingos įtakos naviko apimtį (res vs Res + PI: 0.5728 ± 0,2276 cm 3 vs 0,68 ± 0,0672 cm 3, p = 0,603). Tačiau, Sirt1-nusodrintojo audiniuose,, Slopinamasis poveikis res naviko augimui buvo išgelbėti (res + Si vs Res + PI: 1.2313 ± 0,1777 cm 3 vs 0,68 ± 0,0672 cm 3, p < 0,001, res + Si vs valdymas: 1.2313 ± 0,1777 cm 3 vs 1,4288 ± 0,1741 cm 3, p = 0,123) (5a pav.) Be res gydytų audiniuose,, platinimas žymeklis, KI67, ženkliai sumažėjo (5b pav) (% nuo KI67 teigiamas ląsteles, Res vs valdymas: 3 ± 1,8 vs 44,67 ± 3,79, p < 0,001). Senescence buvo pastebėtas audiniuose, iš AEI-gydytų pelių β-gal dažymo (5b pav) nurodė. Tačiau nėra aiškaus apoptozė buvo sukeltas Res į audiniuose, (S1D paveikslas), o jokių pokyčių nepastebėta apoptozės reguliavimo, pavyzdžiui, BCL-2, Bax ir kaspazė-3 (S1C pav). Šie rezultatai atitiko in vitro
eksperimentams. Be to, į ląstelių ciklo reguliavimo išraiškos pokyčiai, įskaitant ciklino D1, CDK4, CDK6, p21 ir P16 buvo panašus į tai, ką mes nustatėme, in vitro
(5C pav.) Visi pokyčiai pastebėti KI67, beta-gal ir ląstelės ciklo reguliavimo buvo atsisakyta Sirt1 išeikvojimo (skaičiais 5B ir C) (% nuo KI67 teigiamas ląsteles, Res + Si vs Res + PI: 46,32 ± 6,03 vs 2,65 ± 1,53, "p < 0,001" Res + Si vs kontrolės: 46,32 ± 6,03 vs 44,67 ± 3,79, p = 0,946)}

Diskusijos

"Res, natūrali polifenolių, šiuo metu vertinama kaip perspektyvi nuo vėžio. agentas. Nors tai buvo įrodyta, kad perteikti antiproliferaciniu poveikį prieš keletą rūšių vėžio ir ląstelių kultūroje ir ksenografiniuose modelių [9] - [11], jos chemoprevention poveikis GC ir pagrindinės mechanizmo nebuvo gerai mokėsi. Šiame tyrime mes parodė, kad "Res slopino GC ląstelių linijas (AGS, BGC-823 ir Tarybos generalinis sekretoriatas-7901) proliferaciją. Anti-augimas aktyvumas pastebėtas po to, kai ląstelės buvo gydomi storis yra 25 mm Res 24 h, ir slopinantis poveikis priklausė nuo dozės. Esant 50 mkm Res koncentraciją, inhibavimo santykis šių trijų ląstelių linijų buvo 41%, 34% ir 32%, atitinkamai. Kai res koncentracija dar labiau padidėjo, Slopinamasis poveikis buvo sustiprintas. Abu 100 ir 200 mikronų Res slopinamas augimą daugiau nei 50%, palyginti su transporto priemonės grupės. Be to, didesnė dozė Res yra per didelis, kad būtų vivo, parsisiųsti ir todėl nėra prasmės į klinikinėje aplinkoje [13], [14]. Todėl, du mažesnė veiksmingoji koncentracija 25 ir 50 pM Res buvo naudojami Vėlesniuose tyrimuose. pasirodys augimo slopinimo aktyvumas Res būti ląstelei būdinga, kaip IC50 reikšmė skiriasi priklausomai nuo ląstelių tipo ir svyruoja nuo 27 m iki 180 m [9], [10], [15], [16]. Kai kurie iš šių tyrimų rezultatai taip pat parodė, kad "Res sukuriamas slopinamąjį poveikį laiko priklausomu būdu [15], [16]. Koncentracijos ir trukmė Res gydymo priemonės, naudojamos mūsų tyrime buvo suderintas su pranešimais iš kitų grupiu dauguma [8], [9], [16]. Dėl vivo pervežimas tyrimo, administracija metodas mes naudojome yra zondą, nes tai yra metodas, kuris dažniausiai naudojamas pelių kaip alternatyva injekciją į pilvą [15], [17]. Be to, tyrimai su pelėmis parodė, kad Res yra absorbuojamas efektyviai po to, kai per burną ir gali būti randama visame organizme [17], [18]. Kai naudojamas vivo
, raiška žymiai ląstelių proliferaciją sumažėjo būdingas KI67 išraiška, kuri yra suderinta su rezultatais iš mūsų vitro
eksperimentams.

"Res gali sulėtinti vėžio ląstelių proliferaciją per įvairių mechanizmų, tarp kurių, ląstelės ciklo reguliavimas yra svarbus [9], [15], [19]. Mūsų in vitro
duomenys parodė, kad GC ląstelių gydymas Res skatina G1 fazės suimti. G1 fazės yra pirmoji iš keturių etapų ląstelės ciklo, kuris vyksta eukariotinių ląstelių dalijimąsi. G1 yra ypač svarbus ląstelės ciklo fazė, nes tai yra vieta, kurioje ląstelių įsipareigoja iki padalijimo turo. Progresavimo per G1 fazės reikalauja formavimo ir veiksmą ciklino D-CDK4 ar -CDK6 kompleksų. Šie kompleksai tada fosforilinti Retinoblastoma, kuri veda prie E2F transkripcijos veiksnių išleidimo ir vartotojų genų transkripcijos dalyvauja S fazės progresavimą. Iš CIKLONAS "D-CDK kompleksų veiklą reglamentuoja tiekėjų inhibitoriais, įskaitant narių rašalo (P15, P16 ir P18) ir CIP šeimoms (P21, P27 ir P57) [20], [21]. Kartu toje pačioje eilutėje, kartu su G1 fazės arešto, mes stebėjo ciklino D1, CDK4 ir CDK6 downregulation ir p21 ir P16 ląstelę RES gydytų GC ląsteles. Mūsų , in vivo
rezultatai posakio lygių šių ląstelių ciklo reguliavimo auglio egzempliorių yra suderinamas su in vitro
rezultatus. Mūsų rezultatai taip pat sutampa su ankstesnių tyrimų [15], nors kai kurie kiti, pranešė, kad S fazė arešto sukeltas Res [9], [19]. Patvarumas augimo sustojimas gali sukelti apoptozę arba senėjimo ląstelėse. Kadangi abu p21 ir p16 signalizacijos keliai dalyvauti senėjimo progresavimą tarpininkaujant įvairių tipų streso [22], [23], mes atliekame beta Gal dažymo. Res gydymas žymiai padidėjo senstančių GC ląstelių dažnį priklausomai nuo dozės priklausomu būdu. Korinis senatvė programa yra svarbus barjerą vėžio pradžios ir vystymosi [24], [25]. Nors ankstesni tyrimai rodo, kad per oksidacinio streso slopinimas ir metabolizmas Melioracija, Res daro anti-senėjimo poveikį tiek in vitro parsisiųsti ir vivo
[26] - [28], priešingos poveikis buvo parodyta vėžio. Res buvo nustatyta, kad sukelti senescence-panašaus augimo augimui slopinti kelių rūšių vėžio [29], [30]. Dvigubos vaidmuo Res ląstelių senėjimo, lėtinantis senėjimo sveikuose audiniuose ir paspartinti sočią senatvę navikuose, todėl tai ideali kandidatą vėžio prevencijai ir gydymui.

apoptozę kitą bendrą poveikį, kuris paprastai pastebėtas Res gydytų vėžinės ląstelės [9], [11], [15], [16]. Eksperimentiniai duomenys rodo, kad apoptozė gali būti sąlygotas kelių skirtingų būdų ir daug reguliavimo molekulių. Tarp šių reguliavimo, baltymai, sudarantys BCL-2 šeimos, yra svarbūs. Yra ir Anti-Apoptozinės baltymai (BCL-2, BCL-XL) ir proapoptotinių baltymai (Bax, blogai, BAK ir BCL-xs) šioje šeimoje. Atlikta su ja susijusių proapoptozinis Bax /anti-apoptozės BCL-2 santykio padidėjimą padidina mitochondrijų membranos pralaidumą, sukelia citochromo c iš mitochondrijų išleidimo į citozolyje ir, savo ruožtu, rezultatai in the kaspazės-9 ir tolesnis aktyvavimo nukreipti kaspaze 3 [31]. Nepaisant šio vidinio apoptozės keliu, proapoptotinį ligandų, pavyzdžiui, FasL, suriša jų receptorių, sukelti kaspazės-8 ir paskesnių vykdomuosius, pavyzdžiui, kaspazės-3 aktyvinimą. Iš efektorines kaspazių aktyvacijos skatina daugelio mobiliojo ryšio substratų skilimo ir tiesiogiai sukelia apoptozę [31] - [33]. Nors daug ankstesni ataskaitose nurodyta, kad apoptozė buvo atsakingas už "Res sukeltos augimo slopinimą, mes nesilaikė akivaizdus apoptozę Res gydytų GC ląsteles. Tai apoptozės nebuvimas gali būti dėl to, koncentracijos ir trukmę Res gydymą, pritaikytą mūsų eksperimento, nes tyrimai iš įvairių grupių rodo, kad "Res daro dosage- ir trukmė priklauso nuo poveikio [34], [35]. Be to, kaip res poveikis taip pat ląstelėms būdingas [36] - [38], GC ląstelės, naudojamos mūsų tyrime gali būti atsparūs Res sukeltos apoptozės

"Res turi kelis tikslus."; tarp kurių, III klasė NAD ^{+ - priklauso deacetilazės Sirt1 yra dažniausiai mokėsi. Nors biocheminis tyrimas parodė, kad "Res nebuvo tiesioginė aktyvatorius Sirt1 [39]," Res dar buvo laikomas klasikinis agonistas Sirt1. Daugybė tyrimų rodo, kad "Res daro įvairius efektus įvairiose modelius, Sirt1 priklausomu būdu [40], [41]. Mūsų eksperimento Sirt1-išeikvojimas pasikeitė augimo slopinimą res tiek in vitro, parsisiųsti ir vivo
. G1 fazės areštas ir senatvė sukeltas Res gydymo buvo išgelbėti Sirt1 sumažėjęs. Šie rezultatai rodo, kad slopinimo poveikis res apie GC yra priklausomi nuo Sirt1. Pagal ankstesnių tyrimų, Sirt1 gali reguliuoti genų ekspresiją iš dviejų skirtingų mechanizmų. Pirma, tiesiogiai Sirt1 tiesiogiai tarpininkauja baltymo deacetilinant ir tada stiprina jos ubiquitination ir po Ubikvitino proteosomos degradacija [42]. Antra, netiesiogiai Sirt1 daro deacetilazės veiklą įtakojantys chromatino patvirtinimą arba represuoti transkripcijos faktorių veiklą ir tada reguliuoja genų transkripciją [43] - [45]. Kaip molekulių (cikloniniai D1, CDK4, CDK6, P21 ir P16) aptiktų mūsų eksperimentų nebuvo pranešta, kaip tiesioginių tikslų Sirt1, mes spėliojo, kad Sirt1 gali reguliuoti šių genų ekspresiją daugiausia per netiesiogiai mechanizmą. RT-QPCR rezultatai taip pat palaiko šią hipotezę.}

Kartu paėmus, mūsų rezultatai rodo, kad "Res slopina tiek GC ląstelių proliferacija in vitro
ir audiniuose, augimas in vivo
. Res gydymas sukelia G1 fazės arešto GC ląsteles ir sukelia senėjimo vietoj apoptozės. Sirt1-išeikvojimas gelbsti aukščiau aprašytas poveikis res tiek in vitro, parsisiųsti ir in vivo
. Mūsų darbas rodo, kad "Res slopina GC per Sirt1 priklausomu būdu ir pateikiama išsami įrodymų taikant Res GC prevencijos ir terapijos galimybės.

Pagalbinė informacija
S1 paveiksle.
Res daro ne dėl apoptozės BGC-823 ląstelių poveikį. (A), Apoptozę nurodė TUNEL ženklinimo (raudona) ir BGC-823 ląstelių buvo counterstained su DAPI (mėlyna). Gydymas H 2O 2 tarnavo kaip teigiamos kontrolės. Originalus Didinimas: × 200. mastelį "baruose, 50 mkm. (B) reguliatoriai apoptozę BGC-823 ląstelių, įskaitant BCL-2, Bax ir kaspazė-3 buvo analizuojami Vakarų dėmė. (C) reguliatoriai apoptozę į audiniuose, įskaitant BCL-2, Bax ir kaspazė-3 buvo analizuojami Vakarų dėmė. Aptikti suskaldyti kaspazė-3, BGC-823 ląstelių gydomi H 2O 2 tarnavo kaip teigiamos kontrolės (parodyta dešinėje skydelyje). (D), apoptozę audiniuose, buvo aptikta TUNEL ženklinimo (raudona) ir specializuoti skyriai buvo counterstained su DAPI (mėlyna). Profiliai iš moterų graužikų pieno liaukų gauti 3~5 po atjunkymo žiurkių jauniklių (Millipore) tarnavo kaip teigiamos kontrolės. Originalus Didinimas: × 200. mastelį "baruose, 50 mkm. "R" reiškia resveratrolis, "ū" atstovauja kontrolę siRNR ir "Si" atstovauja Sirt1 siRNA
Doi:. 10,1371 /journal.pone.0070627.s001
(TIF)
S2 pav.
triuškinantis iš Sirt1 iki shRNR-lentiviruso. (A), BGC-823 ląstelės buvo pernešta su kontrolės ar Sirt1 specifiniais shRNR-lentiviruses. Transfekcija efektyvumas buvo įvertintas su fluorescencijos mikroskopu. Esant infekcijos darinys (MOI) iš 50, daugiau nei 90% ląstelių buvo transfekuota su shRNR-lentiviruso. Po keturių savaičių atrankos su puromicino, visi iš gyvų ląstelių buvo transdukuojamos. Didinimas: × 100, Baras 200 mikronų. (B) ląstelės buvo nuimta praėjus 4 dienoms po užsikrėtimo ir 28 dienų po puromicino atrankos. Triukšmo slopinimo efektyvumas Sirt1 buvo patikrintas Vakarų dėmė
Doi:. 10,1371 /journal.pone.0070627.s002
(TIF)
S1 lentelėje.
gruntai RT-QPCR eksperimentų, atliktų šios studijos
Doi:. 10,1371 /journal.pone.0070627.s003
(DOC)

• PLoS ONE: RhoE Skatina metastazių skrandžio vėžiu per mechanizmo Priklauso nuo Glaudesnis Išsireiškimas CXCR4
• PLoS ONE: mikofenolio rūgščiai slopina Migracija ir invazija Skrandžio vėžio ląsteles per kelis Molecular kelius