PLoS ONE: Resveratrol das Wachstum von Magenkrebs Hemmt durch Induzierung G1 Phase Arrest und Seneszenz in einer Sirt1 Abhängiger Manner

Abstrakt

Resveratrol, einem natürlich vorkommenden Polyphenol-Verbindung, wurde berichtet, Anti-Krebs-Aktivität ausüben, indem sie zu beeinflussen diverse molekulare Ziele. In dieser Studie untersuchten wir die Effekte und die zugrunde liegenden Mechanismen von Resveratrol auf Magenkrebs. Wir fanden, dass Resveratrol, die Proliferation von Magenkrebs-Zellen in einer dosisabhängigen Weise gehemmt. Bei der Konzentration von 25 und 50 uM hemmte Resveratrol die Lebensfähigkeit der Zellen und verminderte die klonogenen Potential von Magenkrebszellen. Resveratrol Behandlung Magenkrebszellen in der G1-Phase festgehalten und geführt anstelle von Apoptose Seneszenz. Regulatoren des Zellzyklus und Seneszenz Wege, einschließlich Cyclin D1, Cyclin-abhängige Kinase (CDK4 und 6), p21 und p16, wurden von Resveratrol Behandlung dysreguliert. Die hemmende Wirkung von Resveratrol auf Magenkrebs wurden ebenfalls überprüft in vivo
ein Nacktmäuse Xenograft-Modell. Resveratrol (40 mg /kg /d) ausgeübte hemmende Wirkung auf Magenkrebs Entwicklung und verringert signifikant die Fraktionen von Ki67-positiven Zellen in den Tumorproben aus den Nacktmäusen. Nach Resveratrol Behandlung auf die Induktion von Seneszenz und die Veränderungen in der Expression der beteiligten Regulatoren in den Zellzyklus und Seneszenz Wege ähnlich waren, was wir beobachtet in vitro
. Doch umgekehrt die Erschöpfung der Sirtuin (Sirt) 1, die oben beschriebenen Wirkungen von Resveratrol sowohl In-vitro-
und in vivo
. Unsere Daten deuten darauf hin, dass Resveratrol Magenkrebs in einem Sirt1 abhängig und bieten detaillierte Beweise für die Möglichkeit hemmt Resveratrol bei Magenkrebs Prävention und Therapie der Anwendung

Citation:. Yang Q, Wang B, Zang W, Wang X Liu Z, Li W, et al. (2013) Resveratrol hemmt das Wachstum von Magenkrebs durch Induzierung G1 Phase Verhaftung und Seneszenz in einer Sirt1 abhängig. PLoS ONE 8 (11): e70627. doi: 10.1371 /journal.pone.0070627

Editor: Dominique Heymann, Faculté de Médecine de Nantes, Frankreich

Empfangen: 20. März 2013; Akzeptiert: 19. Juni 2013 beginnen; Veröffentlicht: 21. November 2013

Copyright: © 2013 Yang et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (Nr 81101869, 81100103, 81171536 und 81000868), das Nationale Grundlagenforschung Programm von China (973 Programm, No. 2012CB911202) und Unabhängige Innovationsstiftung der Shandong University (2012TS108) .Der unterstützt Geldgebern hatte keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

konkurrierende Interessen:.. die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einleitung

Magenkrebs (GC) ist die vierthäufigste Krebserkrankung und die zweithäufigste Ursache der durch Krebs verursachten Todesfälle in der Welt. Laut einer globalen Schätzung wurden insgesamt 989.600 neue Fälle diagnostiziert GC und ein Minimum von 738.000 Patienten an dieser Krankheit im Jahr 2008 gestorben ist, für 10% der gesamten Todesfälle durch Krebs Accounting [1]. Obwohl die Inzidenz von GC hat sich weltweit rückläufig, bleibt es in den Entwicklungsländern hoch, vor allem in China [1], [2]. Frühere Studien haben die enge Beziehung zwischen einer chronischen Gastritis verursacht durch Helicobacter pylori
Infektion und die Entwicklung der GC zeigte, [3]. Darüber hinaus haben die Host-Vererbung, Umwelt, Ernährung und andere Faktoren in der Magen-onkogenen Prozess in Verbindung gebracht [1]. Da es immer noch schwierig ist, eine Frühdiagnose für GC zu machen, sind die meisten der Patienten in fortgeschrittenen Stadien diagnostiziert. Trotz der Verbesserung der konventionellen Therapien für fortgeschrittene GC, einschließlich der Chirurgie, Chemotherapie und Strahlentherapie, die Länge oder die Lebensqualität von Patienten mit fortgeschrittenem GC ist immer noch schlecht [2], [4]. Deshalb ist die Erforschung neuer präventiver Medikamente oder therapeutische Ziele von GC dringend erforderlich.

Der Verzehr von frischem Obst und Gemüse zu einer verringerten Inzidenz von Krebs beiträgt, einschließlich GC [2], [5]. Klinische Anwendungen legen auch nahe, dass einige bioaktive diätetische Moleküle haben die Fähigkeit, mehrere onkogene Schritte zu hemmen [5] - [7]. Resveratrol (Res, 3,5,4'-trihydroxystilbene) ist ein natürlich in fast 70 Pflanzenarten Polyphenol-Verbindung vorhanden, so auch der Haut von roten Trauben, Erdnüssen, Beeren und andere [6] - [8]. Res wurde erstmals Anti-Tumor-Aktivitäten im Jahr 1997 [8] berichtet auszuüben. Spätere Berichte haben gezeigt, dass Res inhibitorische Wirkungen auf verschiedene Arten von Krebsarten, wie Dickdarmkrebs, Brustkrebs und Lymphomen verleiht, und betrifft diverse molekulare Ziele [9] - [11]. Sirtuin 1 (SIRT1), eine Klasse III Nicotinamid-Adenin-Nukleotid (NAD ^{+) - abhängige Histon /Protein-Deacetylase, wurde ein wesentliches Ziel von Res in mehreren Tumormodellen [9], [10] zu sein, berichtet. Allerdings zeigen einige Daten Gegenteil Ergebnisse darauf hindeutet, dass Res chemoprotektiven Effekte unabhängig von Sirt1 [11] ausübt. Die hemmende Wirkung von Res auf GC und dem zugrunde liegenden Mechanismus sind nicht gut untersucht.}

In der vorliegenden Studie haben wir gezeigt, dass Res, die Proliferation von GC-Zellen gehemmt in vitro
. Res Behandlung Zellzyklusarrest in der G1-Phase induziert und zelluläre Seneszenz geführt. Diese Effekte von Res wurden durch Erschöpfung der Sirt1 zurückgekehrt. Die hemmenden Sirt1 abhängigen Aktivitäten von Res auf GC-Zellen wurden ebenfalls überprüft in vivo
. Zusammengenommen zeigen unsere Ergebnisse, dass Res Sirt1 abhängige hemmende Wirkung auf die GC und schlägt vor, eine therapeutische Rolle für Res in GC ausübt.

Materialien und Methoden

Ethik Statement

Alle Tierstudien von der Ethikkommission der Shandong University School of Medicine (Nr 001 im Jahr 2011 für Tierethik-Zulassung) genehmigt wurden und alle Anstrengungen unternommen wurden, Leiden zu minimieren.

Zelllinien, Kulturbedingungen und Res Behandlung

AGS Menschen GC-Zelllinien (von Zelle Resource Center, Shanghai Institut für Biochemie und Zellbiologie an der chinesischen Akademie der Wissenschaften erhalten), BGC-823 und SGC-7901 (von China Center for Type Culture Collection, Wuhan erworben haben, China) wurden in dieser Studie verwendet. Die Zellen wurden in F12 (AGS) oder RPMI 1640 (BGC-823 und SGC-7901), enthaltend 10% FCS, 100 Einheiten /ml Penicillin und 2 mmol /L L-Glutamin bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO _{2. Hoher Reinheit Res wurde von Sigma (St. Louis, MO, USA), gelöst in DMSO und fügte in das Kulturmedium bei der angegebenen Konzentration bezogen. Alle Experimente wurden 24 Stunden nach der Res-Supplementierung durchgeführt, sofern nicht anders angegeben.}

Kleine RNA-Interferenz Transfection

Chemisch modifizierte small interfering RNA (siRNA) Targeting Sirt1 und Kontroll-siRNA von Genepharma erworben wurden (Shanghai , China). Die Sequenz der Sirt1 siRNA war 5'-CCAUCUCUCUGUCACAAAUTT-3 '. Zellen wurden über Nacht transfiziert und dann mit siRNA unter Verwendung von Lipofectamin 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) nach dem Protokoll des Herstellers inkubiert. Achtundvierzig Stunden nach der siRNA-Transfektion wurden die Zellen mit 50 &mgr; M Res 24 h vor einer weiteren Studie behandelt.

Zell Viability Assay

Die Proliferation wurde bewertet die Zelltiters 96 ® wässrige One-Lösung mit Cell Proliferation Assay (Promega, Madison, WI, USA). Kurz, 2 × 10 ^{3-Zellen wurden in einer 96-Well-Platte ausgesät und für 24 h wachsen gelassen. Vierundzwanzig Stunden später wurden 20 &mgr; l MTS (3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -5- (3-carboxy-methoxyphenyl) -2- (4-sulfophenyl) -2H-tetrazolium) zu jedem hinzugefügt Gut. Nach einer Inkubation von 3 h bei 37 ° C wurde die Extinktion bei 490 nm wurde auf einem Flash-Varioskan Multiplate Reader (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) aufgezeichnet. - /(Mittlere Absorption der Kontrolle gruppen- mittlere Absorption von leeren) relativ Lebensfähigkeit der Zellen = (mittlere Absorption von Leer mittlere Absorption der behandelten Gruppe): Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde durch die folgende Formel berechnet. Assays wurden dreifach wiederholt und dreimal durchgeführt.}

Koloniebildungstest

Zellen wurden in 6-Well-Platten (300 oder 500 Zellen pro Vertiefung) und für 10 Tage inkubiert, bis die Kolonien groß genug, um gut zu erkennen sind. Die Zellen wurden mit Methanol fixiert und mit Kristallviolett gefärbt, und die Anzahl der Kolonien mit mehr als 50 Zellen wurden manuell gezählt. Experimente wurden in dreifacher Ausfertigung und wiederholt dreimal durchgeführt.

Zellzyklusanalyse

Die Zellen wurden geerntet, fixiert mit vorgekühlter 70% Ethanol bei 4 ° C über Nacht und dann mit Propidiumiodid (Beyotime gefärbten , Jiangsu, China), die RNase A bei 37 ° C für 30 min im Dunkeln. Die Zellzyklusverteilung wurde unter Verwendung eines Durchflusszytometers (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) bestimmt und die Daten wurden mit Multicycle Software (Phoenix Flow Systems, San Diego, CA, USA) analysiert. Die Experimente wurden unabhängig dreimal durchgeführt.

Apoptosis Assay

Der Nachweis und die Quantifizierung von Apoptose wurden durch Markierung von DNA-Strangbrüchen führten eine In Situ mit Cell Death Detection Kit, TMR rot (Roche Applied Science, Basel, Schweiz). Zellen oder Paraffinschnitte wurden mit Xenotransplantaten TUNEL markiertem gemäß den Anweisungen des Herstellers. Für Zellen, die Behandlung mit 0,2 mM H _{2 O 2 12 h diente als Positivkontrolle. Für Paraffinschnitte wurden positive Kontrollen von Millipore (Billerica, MA, USA) erworben. Die Zellkerne wurden mit DAPI (Beyotime) und die Objektträger oder Abschnitte gegengefärbt wurden durch ein Fluoreszenzmikroskop (Olympus, Tokio, Japan) unter Verwendung cellSens Dimension Software abgebildet. Die Experimente wurden unabhängig dreimal durchgeführt.}

β-Galactosidase-Färbung

Seneszenz beurteilt wurde ein Seneszenz β-Galactosidase Färbekit (Beyotime) verwendet wird. Kurz gesagt, wurden Zellen oder Gefrierschnitten von Xenotransplantaten fixiert und dann mit frisch hergestelltem β-Galactosidase (β-Gal) Färbelösung bei 37 ° C über Nacht inkubiert. Die Experimente wurden unabhängig dreimal durchgeführt.

Stabile Lentivirale kurze Hairpin-RNA (shRNA) GC-Zellen

Lentivirale Vektoren Kontrolle oder Sirt1 shRNA enthalten, durch Genepharma wurden konstruiert und verwendet BGC-823-Zellen zu transfizieren. Effiziente Knockdown von Sirt1 wurde durch Western-Blot verifiziert. Für eine stabile Transduktion, Kontrolle-Lentivirus-infizierten oder Sirt1 shRNA-Lentivirus-infizierten BGC-823 Zellen vier Wochen lang und gilt als LV-C und LV-S, die jeweils in Komplettmedium geliefert mit 2 ug /ml Puromycin waren.

Nude Mice Xenograftmodell

Weibliche athymische Balb /c Nacktmäuse (6~8 Wochen) wurden von der Universität Peking (Beijing, China) erworben und wurden unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen im Key beibehalten Labor für Herz-Kreislauf Remodeling und Funktionsforschung, Qilu Krankenhaus, Shandong University. Die Mäuse wurden zufällig in vier Gruppen eingeteilt (8 Mäuse pro Gruppe): Gruppe I und II, BGC-823-Zellen (1 × 10 ^{6 Zellen pro Injektion in 0,1 ml PBS) wurden subkutan in den Flankenbereich des injizierten Nacktmäuse; Gruppe III, LV-C (BGC-823-Zellen) injiziert; und Gruppe IV, LV-S (BGC-823-Zellen) injiziert. Nach der Implantation wurden die Nacktmäuse aus den Gruppen II, III und IV mit Res behandelt (40 mg kg -1 in 0,1 ml Pflanzenöl, per Schlundsonde verabreicht, einmal täglich). Die subkutane Tumorgröße wurde mit einer Schieblehre gemessen und die Tumorvolumina wurden durch die Formel (Länge) × (Breite 2) /2 berechnet. Die Mäuse wurden 4 Wochen später getötet. Die Tumoren wurden für Western-Blot und immunochemischen Untersuchungen geerntet und verarbeitet werden.}

Real Time-quantitative PCR (RT-qPCR)

Die Gesamt-RNA in den Zellen wurde unter Verwendung von Trizolreagenz (Invitrogen) isoliert und umgewandelt in cDNA unter Verwendung des PrimeScript ™ RT-Reagenz-Kit (Takara, Tokyo, Japan). RT-qPCR wurde für Gene durchgeführt, einschließlich Cyclin D1, Cyclin-abhängigen Kinase 4 (CDK4), p21 und β-Actin, wie zuvor beschrieben [12]. Die Sequenzen der Amplifikationsprimer sind in Tabelle S1 aufgeführt. Die mRNA-Expression von Cyclin D1, CDK4 und p21 wurde normalisiert auf &bgr; -Actin relativ zur Kontrolle der Verwendung von 2 ^{-ΔΔCt Methode. Jedes Experiment wurde dreifach wiederholt.}

Western Blot

Insgesamt Protein aus den Zellen oder den Tumorproben wurde extrahiert mit RIPA Lysepuffer (Beyotime), wie beschrieben [12]. Die Proteinkonzentration wurde unter Verwendung des BCA Protein Assay Kit (Pierce, Rockford, IL, USA) bestimmt. Die Membran wurde mit Antikörpern gegen Sirt1 (Abcam, Cambridge, MA, USA) untersucht, bcl-2, bax, Caspase-3, Cyclin D1, CDK4 und 6 (Cell Signaling, Danvers, MA, USA), p16 und p21 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA). Der sekundäre Antikörper wurde ein Meerrettich-Peroxidase (HRP) -konjugiertem Anti-Kaninchen oder Maus-Antikörper ist. Die Proteinbanden wurden unter Verwendung eines ECL-System (Pierce) visualisiert. β-Aktin (Cell Signaling) diente als Ladekontrolle.

Immunhistochemie

Die Tumorproben aus den Nacktmäusen wurden entparaffiniert, rehydriert und Antigen abgerufen. Die Schnitte wurden mit einem Antikörper gegen Ki67 (1:500, Abcam) über Nacht bei 4 ° C inkubiert. HRP-konjugierte Anti-Kaninchen-IgG und DAB-Färbung wurden die Ki67-Antikörper zur Visualisierung eingesetzt. Die Objektträger wurden schließlich mit Hämatoxylin gegengefärbt. Die Objektträger wurden mit einem Olympus Lichtmikroskop (Tokyo, Japan) unter Verwendung cellSens Dimension Software abgebildet. Die Ki67-positiven Zellen wurden pro Felder bewertet manuell und der Prozentsatz der Ki67-positiven Zellen gezählt. Fünf separate Felder wurden für jeden Abschnitt gezählt.

Statistische Analysen

Die Daten als Mittelwert ± SD ausgedrückt wurden. Die statistischen Analysen wurden mit Statistical Package für Sozialwissenschaften durchgeführt (SPSS, Version 16.0, Chicago, IL, USA) durch Einweg-ANOVA mit Tukey-post-hoc-Test. P-Werte von weniger als 0,05 wurden als statistisch signifikant betrachtet.

Ergebnisse |

Res Hemmt die Viability von GC-Zellen in einer Sirt1 abhängig

Drei GC-Zelllinien (AGS, BGC-823 und SGC-7901) wurden in unseren Experimenten untersucht. Kultivierung der Zellen in Vehikel (0,1% DMSO) hat (Daten nicht gezeigt) nicht die Lebensfähigkeit der Zellen beeinflussen. wenn sie behandelt jedoch mit unterschiedlichen Konzentrationen an Res für 24 h, Zellproliferation wurde dosisabhängig gehemmt bei 25, 50, 100 und 200 uM Res (1A). Bemerkenswert war die Proliferation von AGS offensichtlich, wenn sie mit 10 &mgr; M behandelt Res inhibiert, die nicht in den anderen beiden Zelllinien (1A) beobachtet wurde. In allen drei Zelllinien, war die Anwesenheit von 100 uM Res ausreichend mehr als 50% Wachstumshemmung zu induzieren (56,78% für AGS, 54,87% für BGC-823 und 52,16% für die SGC-7901, respectively). Daher, 25 und 50 uM Res wurden für die nachfolgenden Versuche verwendet. Um die funktionelle Rolle der Sirt1 in Res Behandlung zu bestimmen, klopfte wir unten Sirt1 Ausdruck, der eine spezifische siRNA verwendet wird. Die effiziente Hemmung der Sirt1-Expression wurde durch Western-Blot (1B) verifiziert. Die Ergebnisse des MTS-Assay zeigte, dass in Sirt1 abgereicherten Zellen, Res nicht die Zellproliferation hemmte (Abbildung 1C). Diese Daten zeigen, dass Res Lage ist, die Proliferation von GC-Zellen und dass die hemmende Wirkung zu hemmen, kann durch Sirt1 Verarmungs gerettet werden.

Res Vermindert das Klonogene Potential von GC-Zellen in einer Sirt1 abhängig

Für Tumorzellen-Koloniebildung wurde ein empfindlicher Parameter als Lebensfähigkeit erwiesen, die Wirkung eines Arzneimittels zu beurteilen. So Bemühungen wurden dann die Wirkung von Res auf dem klonogenen Potential von GC-Zellen zu bestimmen, durchgeführt. Res, bei der Konzentration von 25 &mgr; M führte zu einer signifikanten Reduktion in Foki Nummern sowie Größen in GC-Zellen. Nach der Behandlung mit 50 uM Res, vermindert das clonogene Potential weiter. Jedoch Zuschlags von Sirt1 vor Res Behandlung die Anzahl der Foci auf ein Niveau vergleichbar mit dem Fahrzeuggruppe (Abbildung 2) erhöht.

Res Induziert die Ansammlung von GC Zellen in der G1-Phase in einer Sirt1 abhängig

Um die hemmende Wirkung von Res auf GC-Zellen zu untersuchen, führten wir Zyklusanalyse Zelle. Wir beobachteten, dass 25 und 50 uM Res den Anteil an Zellen in der G1-Phase in sowohl BGC-823 und SGC-7901-Zellen (3A und 3B) erhöht. Die Induktion der G1-Phase Verhaftung durch Res war auch dosisabhängig. Res bei einer Konzentration von 50 uM zeigte eine stärkere Wirkung als bei 25 &mgr; M war. Die Erhöhung der Anzahl der Zellen in der G1-Phase wurde durch eine Abnahme in den Zellpopulationen, in erster Linie in den S-Phasen begleitet. Der Abbau von Sirt1 vor Res Behandlung verringerte die G1-Phase Induktion von Res (3A und 3B). Um die obigen Ergebnisse bestätigen, untersuchten wir die Expression der Zellzyklusregulatoren der G1-Phase, einschließlich Cyclin D1, CDK4, CDK6, p21 und p16 in BGC-823-Zellen. Wie in 3C gezeigt, in BGC-823 Zellen Res behandelten verringerte sich die Proteinspiegel von Aktivatoren des G1 /S-Übergang (Cyclin D1, CDK4 und CDK6), während die Proteinspiegel von Inhibitoren der CDKs (CDKIs) (p21 und p16) erhöht. Im Gegensatz dazu waren diese Veränderungen nicht in Sirt1 abgereicherte BGC-823-Zellen gefunden, wenn sie mit 50 &mgr; M Res behandelt wurden. Ähnliche Ergebnisse wurden aus der RT-qPCR von Cyclin D1, CDK4 und p21 (Figur 3D) erhalten.

Das Fehlen von sub-G1-Zellen zeigten, dass die Behandlung nicht Res Apoptose in den Zellen auslösen GC war (3A) , die mit den Ergebnissen der TUNEL Markierungsexperimente von BGC-823-Zellen (S1A) konsistent war. Die Protein-Spiegel der Apoptose-verwandten Molekülen, wie bcl-2, bax und Caspase-3, die aus jeder Gruppe waren vergleichbar (Abbildung S1B). Zusammengenommen zeigen unsere Ergebnisse, dass Res G1 Phase Arrest in GC-Zellen in einer Sirt1 abhängigen Weise induziert und nicht induziert Apoptose.

Res Induziert Seneszenz von GC Zellen in einer Sirt1 abhängig

in unseren Händen, führt Res in Wachstumsarrest statt erhöhte Apoptose. Daher haben wir weitere Anstrengungen zu untersuchen, ob Res Seneszenz in GC-Zellen induzieren könnten. &bgr; -Gal-Färbung, ein spezifischer Marker für Säugetier alternde Zellen, verwendet wurde. Nach Res Behandlung, fanden wir eine erhöhte Fraktionen von Zellen, die mit β-Gal gefärbt wurden. Jedoch blockierte die Vorbehandlung mit Sirt1 siRNA Res induzierte zelluläre Seneszenz (Abbildung 4). Ähnliche Ergebnisse aus beiden BGC-823 und SGC-7901-Zellen erhalten wurden, die das Res Abhängigen auf Sirt1 schlägt zelluläre Seneszenz in GC-Zellen zu induzieren.

Res hemmt das Tumorwachstum in vivo in einem Sirt1 abhängig

Als nächstes wurden weitere Studien durchgeführt, um die Auswirkungen von Res auf BGC-823 Xenotransplantate Wachstum in Nacktmäusen zu bestimmen. Für die in vivo
Studie stabil transduzierten lentiviralen-shRNA BGC-823-Zellen verwendet wurden. Von den vier Sirt1 shRNA-Lentiviren, LV-1 und LV-4 ausgeübt offensichtlich Silencing Auswirkungen auf Sirt1 Ausdruck (Abbildung S2). Nach vier Wochen Screening wurde auf die verringerte Niveaus in den stabilen lentiviralen shRNA-BGC-823-Zellen (S2) die Expression von Sirt1 gehalten. Stabile LV-1 lentiviralen-shRNA BGC-823-Zellen wurden in den nachfolgenden Xenotransplantate Studien wegen der stärkeren hemmende Wirkung auf Sirt1 Expression im Vergleich zu den LV-4. Alle Tiere bis zum Ende der Experimente überlebten und keine offensichtliche Unterschied in ihrem Körpergewicht (Daten nicht gezeigt) gefunden. Vier Wochen nach der Implantation, Messungen der Tumorvolumina zeigten, dass Res Behandlung signifikant das Wachstum von BGC-823 Xenotransplantate reduziert (Res vs control: 0,5728 ± 0,2276 cm ^{3 vs 1,4288 ± 0,1741 cm 3, P < 0,001) . Stabile Übertragung der Steuer shRNA-Lentivirus nicht signifikant das Tumorvolumen (Res vs Res + Ci: 0,5728 ± 0,2276 cm 3 vs 0,68 ± 0,0672 cm 3, P = 0,603) beeinflussen. Doch in den Sirt1 verarmten Xenotransplantate wurden die hemmende Wirkung von Res auf das Tumorwachstum gerettet (Res + Si vs Res + Ci: 1,2313 ± 0,1777 cm 3 vs 0,68 ± 0,0672 cm 3, P < 0,001, Res + Si vs Kontrolle: 1,2313 ± 0,1777 cm 3 vs 1,4288 ± 0,1741 cm 3, P = 0,123) (5A). In den Res-behandelten Xenotransplantate, der Proliferationsmarker, Ki67, signifikant verringert (5B) (% der Ki67-positiven Zellen, Res vs Kontrolle: 3 ± 1,8 vs 44,67 ± 3,79, P < 0,001). Seneszenz wurde in Xenotransplantaten von Res-behandelten Mäusen, die durch β-Gal-Färbung (5B) beobachtet. Es wurde jedoch keine offensichtliche Apoptose durch Res in den Xenotransplantaten (Abbildung S1D) induziert und keine Änderungen wurden in den Regulatoren der Apoptose, wie bcl-2, bax und Caspase-3 (Abbildung S1C) beobachtet. Diese Ergebnisse wurden im Einklang mit den In-vitro-Experimente
. Darüber hinaus, um die Veränderungen in der Expression der Regulatoren des Zellzyklus, einschließlich Cyclin D1, CDK4, CDK6, p21 und p16 ähnlich waren, was wir beobachtet in vitro
(5C). Alle beobachteten Veränderungen in Ki67, β-Gal und den Zellzyklusregulatoren wurden umgekehrt von Sirt1 Depletion (5B und C) (% der Ki67-positiven Zellen, Res + Si vs Res + Ci: 46,32 ± 6,03 vs 2,65 ± 1,53, P < 0,001, Res + Si vs Kontrolle: 46,32 ± 6,03 vs 44,67 ± 3,79, p = 0,946)}

Diskussion

Res, ein natürliches Polyphenol, wird derzeit als vielversprechende Anti-Krebs ausgewertet. Agent. Obwohl es antiproliferative Wirkungen gegen mehrere Krebsarten sowohl in der Zellkultur und Xenograft-Modellen [9] zu verleihen, ist nachgewiesen worden, - [11], auf GC seine Chemoprävention Effekte und der zugrundeliegende Mechanismus nicht gut untersucht worden. In dieser Studie haben wir gezeigt, dass Res, die Proliferation von GC-Zelllinien (AGS, BGC-823 und SGC-7901) gehemmt. Die anti-Wachstumsaktivität beobachtet wurde, nachdem die Zellen mit 25 uM Res für 24 h behandelt wurden, und die inhibitorische Wirkung war dosisabhängig. Bei einer Konzentration von 50 uM Res, die Hemmungsverhältnisse für diese drei Zelllinien waren 41%, 34% und 32% betragen. Wenn die Konzentration der Res weiter erhöht wurden die inhibitorischen Effekte verstärkt. Beide 100 und 200 &mgr; M Res hemmte das Wachstum um mehr als 50% gegenüber dem Fahrzeuggruppe. Darüber hinaus ist die höhere Dosis von Res zu groß in vivo
zu erreichen und macht daher keinen Sinn, in einer klinischen Umgebung [13], [14]. Daher wurden die beiden unteren wirksamen Konzentrationen von 25 und 50 uM Res in den folgenden Studien verwendet. Die Wachstumshemmungsaktivität von Res erscheint zellspezifisch zu sein, da die IC50 unterscheidet sich je nach Zelltyp und variiert von 27 uM bis 180 uM [9], [10], [15], [16]. Einige dieser Studien haben auch gezeigt, dass Res die inhibitorischen Wirkungen in einer zeitabhängigen Weise ausübt, [15], [16]. Die Konzentration und die Dauer der Behandlung Res in unserer Studie verwendet wurden, waren im Einklang mit der Mehrzahl der Berichte von anderen Gruppen [8], [9], [16]. Für die in vivo
Studie haben wir die Verabreichungsmethode verwendet wird, ist eine Sonde, da dies die Methode ist, die häufig bei Mäusen als Alternative zu intraperitoneale Injektion verwendet wird, [15], [17]. Darüber hinaus haben Studien in Mäusen zeigte, dass Res effizient nach oraler Gabe gut resorbiert und kann im ganzen Körper [17], [18] zu finden. Bei der Verwendung in vivo
verringerte Res signifikant die Proliferation von Zellen, wie durch Ki67 Ausdruck aus, die mit den Ergebnissen unserer In-vitro-Experimente
konsistent ist.

Res kann verlangsamen die Vermehrung von Krebszellen durch verschiedene Mechanismen ab, unter denen der Zellzyklusregulation ist ein wichtiges [9], [15], [19]. Unsere In-vitro-
Daten zeigten, dass die Behandlung der GC-Zellen mit Res G1 Phase Arrest induziert. Die G1-Phase ist die erste der vier Phasen des Zellzyklus, der in eukaryotischen Zellteilung stattfindet. G1 ist eine besonders wichtige Phase des Zellzyklus, weil es der Punkt ist, an dem eine Zelle zu einer Runde der Teilungs begeht. Progression durch G1-Phase erfordert die Bildung und Wirkung von Cyclin D-CDK4 oder -CDK6 Komplexe. Diese Komplexe phosphorylieren dann Retinoblastom, was zur Freisetzung der E2F Transkriptionsfaktoren führt und die stromabwärtige Gentranskription in S Phasenprogression beteiligt. Die Aktivitäten der Cyclin-D-CDK-Komplexe werden durch Upstream-Inhibitoren reguliert, einschließlich der Mitglieder der INK (p15, p16 und p18) und CIP-Familien (p21, p27 und p57) [20], [21]. Entlang der gleichen Linie, mit der G1-Phase Verhaftung begleitet, beobachteten wir die Herabregulation von Cyclin D1, CDK4 und CDK6 und die Hochregulation von p21 und p16 in Res behandelten GC-Zellen. Unsere in vivo
Ergebnisse der Expressionsniveaus dieser Zellzyklusregulatoren in den Tumorproben sind konsistent mit den in vitro
Ergebnisse. Unsere Ergebnisse sind auch mit denen früherer Studien überein [15], obwohl einige andere haben berichtet, dass die S-Phase Verhaftung durch Res induziert wird [9], [19]. Persistenz von Wachstumsarrest kann zur Apoptose oder Seneszenz in Zellen führen. Da beide p21 und p16 Signalwege in Seneszenz Progression teilnehmen, indem verschiedene Arten von Stress vermittelt [22], [23], führten wir β-Gal-Färbung. Res Behandlung erhöht signifikant die Häufigkeit von seneszenten GC-Zellen in einer dosisabhängigen Weise. Die zelluläre Seneszenz-Programm stellt eine wichtige Barriere gegen Krebs Initiierung und Entwicklung [24], [25]. Obwohl frühere Studien zeigen, daß durch die Dämpfung der oxidative Stress und die Verbesserung des Stoffwechsels, übt Res Anti-Aging-Wirkung sowohl in vitro Karten und in vivo
[26] - [28], die entgegengesetzten Wirkungen wurden in Krebs gezeigt. Res wurde gefunden, Seneszenz-ähnlichen Wachstumshemmung in verschiedenen Arten von Krebs [29], [30] zu induzieren. Die Doppelrolle von Res in zelluläre Seneszenz, Verzögerer in normalen Geweben Alterung und Seneszenz in Tumoren zu beschleunigen, macht es zu einem idealen Kandidaten für die Krebsprävention und Behandlung.

Apoptosis eine weitere gemeinsame Wirkung ist in der Regel in Res-behandelten Patienten beobachtet wird Krebszellen [9], [11], [15], [16]. Experimentelle Daten zeigen, dass die Apoptose kann durch mehrere verschiedene Wege und zahlreiche regulatorische Moleküle vermittelt werden. Unter diesen Regler, sind die Proteine ​​der Bcl-2-Familie umfasst wichtig. Es gibt sowohl anti-apoptotischen Proteinen (bcl-2, bcl-xl) und pro-apoptotische Proteine ​​(Bax, schlecht, bak und bcl-xs) in dieser Familie. Eine Erhöhung der pro-apoptotische Bax /anti-apoptotischen Bcl-2-Verhältnis erhöht die Permeabilität der Mitochondrienmembran, verursacht die Freisetzung von Cytochrom c aus Mitochondrien Cytosol und wiederum resultiert in der Aktivierung von Caspase-9 und der stromabwärts Ziel Caspase-3 [31]. Trotz dieser intrinsischen apoptotischen Weg, die pro-apoptotische Liganden, wie FasL, durch Bindung an ihre Rezeptoren, bewirken die Aktivierung von Caspase-8 und Downstream-Effektoren, wie Caspase-3. Die Aktivierung von Caspasen Effektor induziert die Spaltung von vielen zellulären Substraten und direkt verursacht Apoptose [31] - [33]. Obwohl zahlreiche frühere Berichte zeigten, dass die Apoptose für Res-induzierte Wachstumshemmung verantwortlich war, haben wir nicht auf der Hand Apoptose in Res behandelten GC-Zellen zu beobachten. Dieses Fehlen von Apoptose kann in unserem Experiment angepasst an die Konzentration und Dauer der Behandlung Res fällig, weil Studien aus verschiedenen Gruppen zeigen, dass Res Dosierungs- und Dauer abhängige Effekte ausübt [34], [35]. Darüber hinaus, wie die Auswirkungen der Res auch zellspezifische [36] - [38] verwendeten GC-Zellen in unserer Studie können Res induzierte Apoptose resistent

Res hat mehrere Ziele. der Klasse III NAD ^{unter denen, + - abhängige Deacetylase Sirt1 ist die am häufigsten untersucht. Obwohl eine biochemische Studie zeigte, dass Res kein direkter Aktivator von Sirt1 [39] war, hat Res noch als klassischer Agonist Sirt1 angesehen worden. Zahlreiche Studien zeigen, dass Res diverse Effekte in verschiedenen Modellen in einer Sirt1 abhängig [40], [41] ausübt. In unserem Experiment die Wachstumshemmung von Res Sirt1-Depletion umgekehrt sowohl In-vitro-
und in vivo
. Die G1-Phase Verhaftung und Seneszenz induziert durch Res Behandlung wurden durch Sirt1-Depletion gerettet. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Hemmung Effekte von Res auf GC sind abhängig von Sirt1. Gemäß den früheren Studien kann Sirt1 Genexpression durch zwei verschiedene Mechanismen regulieren. Zunächst direkt vermittelt Sirt1 direkt die Deacetylierung eines Proteins und dann erhöht seine Ubiquitinierung und anschließende Ubiquitin-Proteasom-Abbau [42]. Zweitens indirekt übt Sirt1 Deacetylaseaktivität die Chromatinstruktur Bestätigung zu beeinflussen oder die Aktivitäten von Transkriptionsfaktoren, Unterdrückung und regelt dann die Transkription von Genen [43] - [45]. Da die Moleküle (Cyclin D1, CDK4, CDK6, p21 und p16) in unseren Experimenten nachgewiesen haben nicht als direkte Ziele von Sirt1 berichtet wurde, spekulierten wir, dass Sirt1 könnte die Expression dieser Gene in erster Linie durch den indirekten Mechanismus zu regulieren. Die Ergebnisse der RT-qPCR auch diese Hypothese zu unterstützen.}

Insgesamt deuten unsere Ergebnisse, dass Res hemmt sowohl die Proliferation von GC-Zellen In-vitro-
und das Wachstum von Xenotransplantaten in vivo
. Res Behandlung induziert G1 Phase Arrest in GC-Zellen und führt anstelle von Apoptose zu Seneszenz. Sirt1-Depletion rettet die oben beschriebenen Effekte von Res sowohl In-vitro-
und in vivo
. Unsere Arbeit zeigt, dass Res GC in einer Sirt1 abhängig hemmt und liefert detaillierte Beweise für die Möglichkeit der Res in GC Prävention und Therapie anwenden.

Hintergrundinformationen
Abbildung S1.
Res übt keine Auswirkungen auf die Apoptose von BGC-823-Zellen. (A) Apoptosis wurde durch TUNEL Kennzeichnung (rot) angezeigt und BGC-823-Zellen wurden mit DAPI (blau) gegengefärbt. Die Behandlung mit H 2 O 2 diente als Positivkontrolle. Original-Vergrößerung: × 200. Maßstabsbalken, 50 &mgr; m. (B) Die Regler der Apoptose in BGC-823-Zellen, einschließlich bcl-2, Bax und Caspase-3 wurden durch Western-Blot analysiert. (C) Die Regler der Apoptose in den Xenotransplantaten, einschließlich bcl-2, Bax und Caspase-3 wurden durch Western-Blot analysiert. Für den Nachweis von gespaltenen Caspase-3, BGC-823 Zellen mit H behandelt 2 O 2 diente als Positivkontrolle (auf der rechten Seite gezeigt). (D) Apoptosis in Xenotransplantaten wurde durch TUNEL Kennzeichnung (rot) erkannt und die Schnitte wurden mit DAPI (blau) gegengefärbt. Abschnitte von weiblichen Nagetieren Brustdrüse erhalten 3~5 nach der Rattenjungen (Millipore) Entwöhnung diente als positive Kontrolle. Original-Vergrößerung: × 200. Maßstabsbalken, 50 &mgr; m. "R" steht für Resveratrol, "Ci 'steht für die Kontroll-siRNA und' Si 'die Sirt1 siRNA
doi:. 10.1371 /journal.pone.0070627.s001
(TIF)
Abbildung S2.
Sturz von Sirt1 von shRNA-Lentiviren. (A) BGC-823-Zellen wurden mit Kontrolle oder Sirt1 spezifischen shRNA-Lentiviren transfiziert. Die Transfektionseffizienz wurde mit einem Fluoreszenzmikroskop untersucht. Bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 50, mehr als 90% der Zellen wurden mit shRNA-Lentivirus transfiziert. Nach vier Wochen mit Puromycin-Screening wurden alle der lebenden Zellen transduziert. Vergrößerung: × 100, Bar für 200 &mgr; m. (B) Die Zellen wurden 4 Tage nach der Infektion geerntet und 28 Tage nach der Puromycin-Screening. Die Silencing Effizienz von Sirt1 wurde durch Western-Blot verifiziert
doi:. 10.1371 /journal.pone.0070627.s002
(TIF)
Tabelle S1.
Primer für die RT-qPCR-Experimente in dieser Studie durchgeführt
doi:. 10.1371 /journal.pone.0070627.s003
(DOC)

• PLoS ONE: Rhoe Fördert Metastasierung in Magenkrebs durch einen Mechanismus ab, über die verstärkte Expression von CXCR4
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