PLoS ONE: il resveratrolo inibisce la crescita di cancro gastrico inducendo G1 fase di arresto e senescenza in un Manner

Estratto

Il resveratrolo Sirt1-dipendente, un composto polifenolico naturale, è stato segnalato per esercitare una attività antitumorale influendo diversi bersagli molecolari. In questo studio, abbiamo esaminato gli effetti ed i meccanismi alla base di resveratrolo sul cancro gastrico. Abbiamo scoperto che il resveratrolo inibisce la proliferazione delle cellule di cancro gastrico in modo dose-dipendente. Alla concentrazione di 25 e 50 micron, il resveratrolo ha inibito la vitalità cellulare e diminuita del potenziale clonogenico delle cellule di cancro gastrico. trattamento resveratrolo arrestato cellule di cancro gastrico in fase G1 e ha portato alla senescenza invece di apoptosi. Regolatori del ciclo cellulare e percorsi senescenza, tra ciclina D1, chinasi ciclina-dipendente (CDK4 e 6), p21 e p16, sono stati disregolato dal trattamento resveratrolo. Gli effetti inibitori del resveratrolo sul cancro gastrico sono stati anche verificati in vivo
utilizzando un modello di topo xenotrapianto nudo. Resveratrolo (40 mg /kg /d) esercitata attività inibitoria sullo sviluppo del cancro gastrico e significativamente ridotto le frazioni di cellule Ki67-positive nei campioni tumorali da topi nudi. Dopo il trattamento resveratrolo, l'induzione di senescenza e cambiamenti nell'espressione dei regolatori coinvolti nei percorsi ciclo cellulare e senescenza erano simili a quello che abbiamo osservato in vitro
. Tuttavia, l'esaurimento delle Sirtuin (Sirt) 1 invertito gli effetti del resveratrolo sopra descritti sia in vitro
e in vivo
. I nostri dati suggeriscono che il resveratrolo inibisce il cancro gastrico in maniera Sirt1-dipendente e fornire prove dettagliate per la possibilità di applicare resveratrolo nella prevenzione del cancro gastrico e la terapia

Visto:. Yang Q, Wang B, Zang W, Wang X , Liu Z, Li W, et al. (2013) Il resveratrolo inibisce la crescita di cancro gastrico inducendo G1 fase dell'arresto e senescenza in modo Sirt1-dipendente. PLoS ONE 8 (11): e70627. doi: 10.1371 /journal.pone.0070627

Editor: Dominique Heymann, Faculté de médecine de Nantes, Francia |

Ricevuto: 20 Marzo 2013; Accettato: 19 Giugno 2013; Pubblicato: 21 novembre 2013

Copyright: © 2013 Yang et al. Questo è un articolo ad accesso libero distribuito sotto i termini della Creative Commons Attribution License, che permette l'uso senza restrizioni, la distribuzione e la riproduzione con qualsiasi mezzo, a condizione che l'autore originale e la fonte sono accreditati

Finanziamento:. Questo lavoro è stata sostenuta dalla National Science Foundation naturale della Cina (n ° 81.101.869, 81.100.103, 81.171.536 e 81.000.868), il programma di ricerca di base nazionale della Cina (973 Programma, n 2012CB911202), e indipendente Innovazione Fondazione di Shandong University (2012TS108) .La finanziatori avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta e l'analisi dei dati, la decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto

Competere interessi:.. Gli autori hanno dichiarato che nessun interesse facente concorrenza esiste

Introduzione

cancro gastrico (GC) è il quarto cancro più comune e la seconda causa di morte per cancro nel mondo. Secondo una stima globale, per un totale di 989,600 nuovi casi sono stati diagnosticati GC e un minimo di 738.000 pazienti è morto da questa malattia nel 2008, pari al 10% dei decessi totali per cancro [1]. Sebbene l'incidenza di GC è in calo a livello globale, rimane alta nei paesi in via di sviluppo, soprattutto in Cina [1], [2]. Studi precedenti hanno rivelato l'intimo rapporto tra gastrite cronica causata da Helicobacter pylori
infezione e lo sviluppo di GC [3]. Inoltre, gli ospiti genetici, ambientali, alimentari e di altri fattori sono stati implicati nel processo oncogeno gastrica [1]. Dato che è ancora difficile fare una diagnosi precoce per GC, la maggior parte dei pazienti sono diagnosticati in fase avanzata. Nonostante il miglioramento delle terapie convenzionali per GC avanzate, tra cui la chirurgia, la chemioterapia e la radioterapia, la lunghezza o la qualità della vita dei pazienti affetti da CG avanzato è ancora scarsa [2], [4]. Pertanto, l'esplorazione di nuovi farmaci preventivi o bersagli terapeutici di GC è urgente.

Il consumo di frutta e verdura fresca contribuisce ad una minore incidenza di cancro, tra cui GC [2], [5]. Applicazioni cliniche suggeriscono anche che alcune molecole bioattive alimentari hanno la capacità di inibire più passaggi oncogeni [5] - [7]. Resveratrolo (Res, 3,5,4'-triidrossistilbene) è un naturale composto polifenolico presente in quasi 70 specie vegetali, tra cui la pelle di uve rosse, arachidi, bacche e altri [6] - [8]. Res è stato segnalato prima di esercitare le attività anti-tumorali nel 1997 [8]. rapporti successivi hanno dimostrato che Res impartisce effetti inibitori sulla diversi tipi di tumori, come il cancro del colon, cancro al seno e il linfoma, e colpisce diversi bersagli molecolari [9] - [11]. SIRT1 (Sirt1), una classe III nicotinamide adenina nucleotide (NAD ^{+) - dipendente deacetilasi degli istoni /proteine, è stato segnalato per essere un obiettivo chiave di Res in diversi modelli tumorali [9], [10]. Tuttavia, alcuni dati mostrano risultati contrari suggeriscono che Res esercita effetti chemoprotective indipendente di Sirt1 [11]. Gli effetti inibitori delle FER sul GC e il meccanismo sottostante non sono ben studiati.}

Nel presente studio, abbiamo dimostrato che Res ha inibito la proliferazione delle cellule GC in vitro
. trattamento Res indotta arresto del ciclo cellulare in fase G1 e ha portato alla senescenza cellulare. Questi effetti di Res sono state annullate con l'esaurimento delle Sirt1. Le attività Sirt1-dipendente inibitori della Res sulle cellule GC sono stati anche verificati in vivo
. Nel loro insieme, i nostri risultati indicano che Res esercita effetti inibitori Sirt1-dipendente sul GC e suggerisce un ruolo terapeutico per la Res in GC.

Materiali e Metodi

Etica Dichiarazione

Tutto studi su animali sono stati approvati dal Comitato Etico della Shandong University School of Medicine (n 001 del 2011 per l'etica degli animali di approvazione) e tutti gli sforzi sono stati fatti per ridurre al minimo le sofferenze.

linee cellulari, Cultura Condizioni e Res trattamento

linee cellulari GC umana AGS (ottenute da cellule Resource center, Shanghai, Istituto di Biochimica e Biologia cellulare presso l'Accademia Cinese delle Scienze), BGC-823 e SGC-7901 (acquistato dalla Cina center for Type Culture Collection, Wuhan, Cina) sono stati utilizzati in questo studio. Le cellule sono state coltivate in F12 (AGS) o RPMI 1640 (BGC-823 e SGC-7901) contenente 10% FCS, 100 unità /ml di penicillina e 2 mmol /L di L-glutammina a 37 ° C in atmosfera umidificata contenente il 5% CO _{2. Elevata purezza Res è stato acquistato da Sigma (St. Louis, MO, USA), sciolto in DMSO e aggiunte in mezzo di coltura alla concentrazione indicata. Tutti gli esperimenti sono stati effettuati 24 ore dopo l'integrazione Res, se non diversamente indicato.}

Piccolo RNA interference Transfection

chimicamente modificato small interfering RNA (siRNA) di targeting siRNA Sirt1 e di controllo sono stati acquistati da GenePharma (Shanghai , Cina). La sequenza del Sirt1 siRNA era 5'-CCAUCUCUCUGUCACAAAUTT-3 '. Le cellule sono state incubate durante la notte e poi trasfettate con siRNA utilizzando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) secondo il protocollo del produttore. Quarantotto ore dopo la trasfezione di siRNA, le cellule sono state trattate con 50 um Res per 24 ore prima di ulteriori studi.

Cell vitalità Assay

La proliferazione è stata valutata utilizzando il titolo cellulare 96 ® acquosa One Solution Cell Proliferation Assay (Promega, Madison, WI, USA). In breve, 2 × 10 ^{3 cellule sono state seminate in una piastra da 96 pozzetti e permesso di crescere per 24 ore. Ventiquattro ore dopo, 20 microlitri MTS (3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3-carbossi-metossifenil) -2- (4-solfofenil) -2H-tetrazolio) è stato aggiunto a ciascun bene. Dopo incubazione per 3 ore a 37 ° C, l'assorbanza a 490 nm è stato registrato su un Varioskan Flash Multiplate Reader (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). La vitalità cellulare è stato calcolato con la seguente formula: relative vitalità cellulare = (assorbanza media del gruppo trattato - assorbanza media di vuoto) /(assorbanza media del controllo gruppo- assorbanza media di vuoto). I dosaggi sono stati eseguiti in triplicato e ripetuti tre volte.}

Colony Formazione Assay

Le cellule sono state seminate in 6 pozzetti (300 o 500 cellule per pozzetto) e incubate per 10 giorni fino a quando le colonie erano abbastanza grande da essere chiaramente discernere. Le cellule sono state fissate con metanolo e colorate con cristalvioletto, e il numero di colonie con più di 50 cellule è stato contato manualmente. Gli esperimenti sono stati eseguiti in triplicato e ripetuti tre volte.

Cell Cycle Analysis

Le cellule sono state raccolte, fissato con pre-raffreddata etanolo al 70% a 4 ° C per una notte e quindi colorate con ioduro di propidio (Beyotime , Jiangsu, Cina) contenente RNasi a a 37 ° C per 30 minuti al buio. La distribuzione del ciclo cellulare è stato determinato utilizzando un citofluorimetro (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) ei dati sono stati analizzati con il software Multicycle (sistemi a flusso Phoenix, San Diego, CA, USA). Gli esperimenti sono stati condotti in modo indipendente per tre volte.

L'apoptosi Assay

rilevazione e la quantificazione di apoptosi sono state eseguite mediante l'etichettatura di rotture del DNA utilizzando un In Situ Cell Death Detection Kit, TMR rosso (Roche Applied Science, Basilea, Svizzera). Cellule o sezioni di paraffina di xenotrapianti sono stati etichettati con TUNEL secondo le istruzioni del produttore. Per le cellule, il trattamento con 0,2 mm H _{2O 2 per 12 ore servito come controllo positivo. Per le sezioni di paraffina, controlli positivi sono stati acquistati da Millipore (Billerica, MA, USA). I nuclei sono stati di contrasto con DAPI (Beyotime) e le diapositive o le sezioni sono stati ripresi da un microscopio a fluorescenza (Olympus, Tokyo, Giappone) utilizzando il software cellSens Dimension. Gli esperimenti sono stati condotti in modo indipendente per tre volte.}

β-galattosidasi colorazione

La senescenza è stata valutata utilizzando una senescenza β-galattosidasi colorazione Kit (Beyotime). Brevemente, cellule o sezioni congelate di xenotrapianti sono stati fissati e poi incubate con appena preparato β-galattosidasi (β-Gal) soluzione colorante a 37 ° C durante la notte. Gli esperimenti sono stati condotti in modo indipendente per tre volte.

stabili lentivirali-breve tornante RNA (shRNA) Le cellule GC

vettori lentivirali contenenti controllo o Sirt1 shRNA sono stati costruiti da GenePharma e utilizzati per trasfettare BGC-823 cellule. atterramento efficiente di Sirt1 è stato verificato da Western Blot. Per la trasduzione stabile, il controllo-lentivirus-infetto o Sirt1 shRNA-lentivirus-infettato BGC-823 cellule sono state coltivate in terreno completo fornito con 2 mg /puromicina ml per quattro settimane e considerato come, rispettivamente, LV-C e LV-S,.

nude Mouse dello xenotrapianto modello

femminile atimici BALB /c topi nudi (6~8 settimane) sono stati acquistati presso l'Università di Pechino (Beijing, Cina) e sono stati mantenuti sotto specifiche condizioni esenti da organismi patogeni al Key Laboratorio di rimodellamento cardiovascolare e della ricerca funzione, ospedale Qilu, Shandong University. I topi sono stati divisi casualmente in quattro gruppi (8 topi per gruppo): gruppo I e II, BGC-823 cellule (1 × 10 ^{6 cellule per iniezione in 0,1 ml di PBS) sono stati iniettati sottocute nella regione fianco del topi nudi; Gruppo III, LV-C (BGC-823 celle) è stato iniettato; e del gruppo IV, LV-S (BGC-823 celle) è stato iniettato. Dopo l'impianto, il topi nudi da gruppi II, III e IV sono stati trattati con Res (40 mg kg -1 a 0,1 ml di olio vegetale, amministrata dalla sonda gastrica, una volta al giorno). La dimensione del tumore sottocutaneo è stata misurata con un calibro, ed i volumi del tumore sono stati calcolati con la formula (lunghezza) x (larghezza 2) /2. I topi sono stati sacrificati quattro settimane più tardi. I tumori sono state raccolte ed elaborate per gli studi di Western Blot e immunochimiche.}

Tempo-quantitativa Real Time PCR (RT-QPCR)

L'RNA totale di cellule è stato isolato utilizzando TRIzol reagente (Invitrogen) e convertiti in cDNA utilizzando il kit di reagenti PrimeScript ™ RT (Takara, Tokyo, Giappone). RT-QPCR è stata eseguita per i geni, tra cui la ciclina D1, ciclina-dipendente chinasi 4 (CDK4), p21 e β-actina come descritto in precedenza [12]. Le sequenze dei primer di amplificazione sono elencati nella Tabella S1. L'espressione dell'mRNA della ciclina D1, CDK4 e p21 è stata normalizzata per beta-actina rispetto al controllo con il 2 ^{-ΔΔCt metodo. Ogni esperimento è stato ripetuto in triplicato.}

Western Blot

proteine ​​delle cellule o dei campioni tumorali è stato estratto con RIPA lisi Buffer (Beyotime), come descritto [12]. La concentrazione proteica è stata determinata utilizzando il kit Protein Assay BCA (Pierce, Rockford, IL, USA). La membrana è stata sondato con anticorpi contro Sirt1 (Abcam, Cambridge, MA, USA), Bcl-2, Bax, caspasi-3, ciclina D1, CDK4 e 6 (Cell Signaling, Danvers, MA, USA), p16 e p21 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA). L'anticorpo secondario utilizzato era una perossidasi di rafano (HRP) coniugata anti-coniglio o anticorpi mouse. Le bande proteiche sono state visualizzate utilizzando un sistema ECL (Pierce). β-actina (Cell Signaling) è servito come controllo di caricamento.

L'immunoistochimica

I campioni tumorali dei topi nudi sono stati deparaffinate, reidratate e l'antigene recuperati. Le sezioni sono state incubate con un anticorpo contro Ki67 (1:500, Abcam) notte a 4 ° C. HRP-coniugato IgG anti-coniglio e DAB colorazione sono stati impiegati per visualizzare l'anticorpo Ki67. I vetrini sono stati, infine, di contrasto con ematossilina. Le diapositive sono stati ripresi da una luce microscopio Olympus (Tokyo, Giappone) utilizzando il software cellSens Dimension. Le cellule Ki67-positive sono state contate manualmente e la percentuale di cellule Ki67-positivi sono stati valutati per campo. Cinque campi separati sono stati contati per ogni sezione.

Analisi statistica

I dati sono stati espressi come media ± SD. Le analisi statistiche sono state effettuate utilizzando pacchetto di statistica per le scienze sociali (SPSS, versione 16.0, Chicago, IL, USA) mediante ANOVA con test post-hoc di Tukey. P-valori inferiori a 0,05 sono stati considerati statisticamente significativi.

Risultati

Res Inibisce la vitalità delle cellule GC in un Sirt1-dipendente Manner

Tre linee cellulari GC (AGS, BGC-823 e SGC-7901) sono stati esaminati nei nostri esperimenti. Coltivando le cellule in veicolo (0,1% DMSO) non ha influenzato vitalità cellulare (dati non mostrati). Tuttavia, quando trattati con differenti concentrazioni di Res per 24 h, la proliferazione cellulare è stata dose-dipendente inibito a 25, 50, 100 e 200 micron Res (Figura 1A). Da segnalare, la proliferazione delle AGS era ovviamente inibita quando vengono trattati con 10 micron Res, che non è stato osservato nelle altre due linee cellulari (Figura 1A). In tutte le tre linee cellulari, la presenza di 100 mM Res era sufficiente per indurre l'inibizione più del 50% di crescita (56.78% per AGS, 54,87% per BGC-823 e 52.16% per SGC-7901, rispettivamente). Pertanto, 25 e 50 mM Res stati usati per esperimenti successivi. Per determinare il ruolo funzionale di Sirt1 nel trattamento Res, abbiamo abbattuto espressione Sirt1 utilizzando uno specifico siRNA. L'inibizione efficace di espressione Sirt1 è stata verificata mediante Western blot (Figura 1B). I risultati del saggio MTS hanno dimostrato che in cellule Sirt1-impoverito, Res non inibisce la proliferazione cellulare (Figura 1C). Questi dati indicano che la Res è in grado di inibire la proliferazione delle cellule GC e che l'effetto inibitorio può essere salvato da esaurimento Sirt1.

Res diminuisce l'potenziale clonogenica delle cellule GC in maniera Sirt1-dipendente

per le cellule tumorali, formazione di colonie è stato trovato per essere un parametro più sensibile di fattibilità per valutare l'effetto di un farmaco. Così, gli sforzi sono stati poi intrapresi per determinare l'effetto della risoluzione sul potenziale clonogenico delle cellule GC. Res, alla concentrazione di 25 pM, hanno determinato una significativa riduzione del numero di foci così come le dimensioni in cellule di GC. Dopo il trattamento con 50 um Res, il potenziale clonogenica diminuita ulteriormente. Tuttavia, l'abbattimento di Sirt1 prima del trattamento Res ha aumentato il numero di focolai ad un livello paragonabile a quello del gruppo veicolo (Figura 2).

Res induce l'accumulo di cellule GC nella fase G1 in modo Sirt1-dipendente

Per esaminare l'effetto inibitorio della Res sulle cellule GC, abbiamo effettuato analisi del ciclo cellulare. Abbiamo osservato che 25 e 50 um Res aumentato la proporzione di cellule nella fase G1 sia BGC-823 e le cellule SGC-7901 (figure 3a e 3b). L'induzione dell'arresto fase G1 di Res era dose-dipendente. Res una concentrazione di 50 mM mostrato un effetto più forte che faceva a 25 pM. L'aumento del numero di cellule nella fase G1 è stata accompagnata da una diminuzione nelle popolazioni cellulari soprattutto nelle fasi S. L'esaurimento di Sirt1 prima del trattamento Res diminuita l'induzione della fase G1 Res (Figure 3A e 3B). Per corroborare i risultati di cui sopra, abbiamo esaminato l'espressione di regolatori del ciclo cellulare della fase G1, tra ciclina D1, CDK4, CDK6, p21 e p16 in BGC-823 cellule. Come mostrato nella Figura 3C, in Res-trattata cellule BGC-823, i livelli di proteina di attivatori del G1 /transizione S (ciclina D1, CDK4 e CDK6) è diminuita, mentre i livelli di proteina di inibitori di CDK (CDKIs) (p21 e p16) è aumentata. Al contrario, questi cambiamenti non sono stati trovati in Sirt1-impoverito BGC-823 cellule quando sono stati trattati con 50 um Res. Risultati simili sono stati ottenuti dalla RT-QPCR di ciclina D1, CDK4 e p21 (Figura 3D).

La mancanza di cellule sub-G1 indicato che il trattamento Res non innescare l'apoptosi nelle cellule GC (Figura 3A) , che era in linea con i risultati di esperimenti di etichettatura TUNEL da BGC-823 cellule (Figura S1A). I livelli proteici di molecole apoptosi correlati, come Bcl-2, Bax e caspasi-3, di ogni gruppo sono stati paragonabili (Figura S1B). Nel loro insieme, i nostri risultati mostrano che Res induce arresto fase G1 nelle cellule GC in maniera Sirt1-dipendente e non induce apoptosi.

Res Induce senescenza delle cellule GC in maniera Sirt1-dipendente

nelle nostre mani, Res si traduce in arresto della crescita, piuttosto che un aumento dell'apoptosi. Pertanto, abbiamo fatto ulteriori sforzi per esplorare se Res potrebbe indurre senescenza nelle cellule GC. ß-Gal colorazione, un marcatore specifico per le cellule senescenti di mammifero, è stato utilizzato. Dopo il trattamento Res, abbiamo riscontrato un aumento delle frazioni di cellule sono state colorate con β-Gal. Tuttavia, il pretrattamento con Sirt1 siRNA bloccato senescenza cellulare Res-indotta (Figura 4). Risultati simili sono stati ottenuti da entrambi BGC-823 e le cellule SGC-7901, il che suggerisce che a carico Res su Sirt1 per indurre la senescenza cellulare in cellule di GC.

Res Inibisce la crescita tumorale in vivo in un modo Sirt1-dipendente

Successivamente, ulteriori studi sono stati condotti per determinare gli effetti della Res su BGC-823 xenotrapianti crescita in topi nudi. Per il in vivo
studio, sono stati utilizzati trasdotte lentivirali-shRNA BGC-823 cellule stabili. Dei quattro Sirt1 shRNA-lentivirus, LV-1 e LV-4 esercita effetti silenziamento evidenti sull'espressione Sirt1 (figura S2). Dopo quattro settimane di proiezione, l'espressione di Sirt1 è stata mantenuta a livelli diminuiti nel lentivirali-shRNA BGC-823 cellule stabili (figura S2). Stabile LV-1 lentiviral-shRNA BGC-823 cellule sono state usate in xenotrapianti successivi studi a causa degli effetti inibitori forti sull'espressione Sirt1 rispetto al LV-4. Tutti gli animali sopravvissuti alla fine dei nostri esperimenti, e nessuna differenza evidente è stato trovato nel loro peso corporeo (dati non mostrati). Quattro settimane dopo l'impianto, le misurazioni dei volumi tumorali hanno indicato che il trattamento Res ha ridotto significativamente la crescita di BGC-823 xenotrapianti (Res vs controllo: 0.5728 ± 0,2276 centimetri ^{3 vs 1.4288 ± 0,1741 centimetri 3, P < 0,001) . trasduzione stabile del controllo shRNA-lentivirus non ha influenzato in modo significativo il volume del tumore (Res vs Res + Ci: 0.5728 ± 0,2276 centimetro 3 vs 0.68 ± 0,0672 centimetri 3, P = 0,603). Tuttavia, negli xenotrapianti Sirt1-impoverito, gli effetti inibitori di Res sulla crescita del tumore sono stati salvati (Res + Si vs Res + Ci: 1.2313 ± 0,1777 centimetri 3 vs 0.68 ± 0,0672 centimetri 3, P < 0,001, res + Si vs controllo: 1.2313 ± 0,1777 centimetri 3 vs 1,4288 ± 0,1741 centimetri 3, P = 0,123) (Figura 5A). Negli xenotrapianti Res-trattati, il marcatore di proliferazione, Ki67, è diminuito significativamente (Figura 5B) (% di cellule Ki67-positivi, Res vs controllo: 3 ± 1.8 vs 44.67 ± 3.79, P < 0,001). La senescenza è stata osservata in xenotrapianti da topi Res-trattati indicati da β-Gal colorazione (Figura 5B). Tuttavia, non apoptosi evidente è stata indotta da Res nei xenotrapianti (Figura S1D) e sono stati osservati cambiamenti nei regolatori di apoptosi, come Bcl-2, Bax e caspasi-3 (Figura S1C). Questi risultati sono stati in linea con le in vitro
esperimenti. Inoltre, i cambiamenti nell'espressione dei regolatori del ciclo cellulare, tra cui ciclina D1, CDK4, CDK6, p21 e p16 erano simili a quello che abbiamo osservato in vitro
(Figura 5C). Tutti i cambiamenti osservati in Ki67, β-Gal ei regolatori del ciclo cellulare sono stati invertiti da Sirt1 esaurimento (figure 5B e C) (% di cellule Ki67-positivo, Res + Si vs Res + Ci: 46.32 ± 6,03 vs 2,65 ± 1,53, P < 0,001, Res + si vs controllo: 46.32 ± 6.03 vs 44.67 ± 3.79, p = 0,946)}

Discussione

Res, un polifenolo naturale, è attualmente in corso di valutazione come antitumorale promettente. agente. Anche se è stato dimostrato di impartire effetti antiproliferativa nei confronti di diversi tipi di cancro, sia in colture cellulari e modelli di xenotrapianto [9] - [11], i suoi effetti di chemioprevenzione sul GC e il meccanismo sottostante non sono stati ben studiato. In questo studio, abbiamo dimostrato che Res ha inibito la proliferazione delle linee cellulari GC (AGS, BGC-823 e SGC-7901). L'attività anti-crescita è stata osservata dopo le cellule sono state trattate con 25 mM Res per 24 ore, e l'effetto inibitorio era dose-dipendente. Ad una concentrazione di 50 mM Res, i rapporti di inibizione di queste tre linee cellulari erano 41%, 34% e 32% rispettivamente. Quando la concentrazione di Res ulteriormente aumentato, sono stati rafforzati gli effetti inibitori. Entrambi 100 e 200 mM Res inibito la crescita di oltre il 50% rispetto al gruppo del veicolo. Inoltre, la dose più alta di Res è troppo grande per raggiungere il in vivo
e quindi non ha senso in un ambiente clinico [13], [14]. Pertanto, le due concentrazioni efficaci inferiori di 25 e 50 mM Res sono stati utilizzati negli studi successivi. L'attività di inibizione della crescita di Res sembra essere specifico celle, come IC50 differisce a seconda del tipo di cellula e varia da 27 mM a 180 mM [9], [10], [15], [16]. Alcuni di questi studi hanno anche dimostrato che Res esercita effetti inibitori in un modo dipendente dal tempo [15], [16]. La concentrazione e la durata del trattamento Res utilizzato nel nostro studio erano coerenti con la maggior parte delle segnalazioni di altri gruppi [8], [9], [16]. Per il in vivo
studio, il metodo amministrazione abbiamo usato è gavage perché questo è il metodo che viene comunemente utilizzato nei topi come alternativa a iniezione intraperitoneale [15], [17]. Inoltre, gli studi sui topi hanno rivelato che Res viene assorbita in modo efficace dopo somministrazione orale e possono essere trovati in tutto il corpo [17], [18]. Quando viene utilizzato in vivo
, Res diminuito in modo significativo la proliferazione delle cellule in quanto caratterizzati da espressione Ki67, che è coerente con i risultati dei nostri in vitro
esperimenti.

Res può rallentare la proliferazione delle cellule tumorali attraverso meccanismi diversi, tra cui, regolazione del ciclo cellulare è un importante [9], [15], [19]. Il nostro in vitro
i dati hanno dimostrato che il trattamento delle cellule GC con Res induce arresto fase G1. La fase G1 è la prima delle quattro fasi del ciclo cellulare che avviene nella divisione cellulare eucariotica. G1 è particolarmente importante fase del ciclo cellulare perché è il punto in cui una cellula impegna ad un giro di divisione. La progressione attraverso fase G1 richiede la formazione e l'azione di ciclina D-CDK4 o -CDK6 complessi. Questi complessi poi fosforilano retinoblastoma, che conduce al rilascio dei fattori di trascrizione E2F e la trascrizione del gene valle coinvolti nella progressione fase S. Le attività dei complessi ciclina D-CDK sono regolati da inibitori a monte, tra cui i membri del INK (p15, p16 e p18) e le famiglie CIP (p21, p27 e p57) [20], [21]. Lungo la stessa linea, accompagnato con l'arresto di fase G1, abbiamo osservato la down-regulation di ciclina D1, CDK4 e CDK6 e l'up-regolazione di p21 e p16 in cellule GC Res-trattati. Il nostro in vivo
risultati dei livelli di espressione di questi regolatori del ciclo cellulare nei campioni tumorali sono coerenti con il in vitro
risultati. I nostri risultati sono coerenti con quelli di studi precedenti [15], anche se alcuni altri hanno riferito che S fase di arresto è indotta da Res [9], [19]. Persistenza di arresto della crescita può portare ad apoptosi o senescenza nelle cellule. Poiché entrambe le vie di segnalazione p21 e p16 partecipa nella progressione senescenza mediata da vari tipi di stress [22], [23], abbiamo effettuato β-Gal colorazione. trattamento Res ha aumentato significativamente la frequenza di cellule GC senescenti in modo dose-dipendente. Il programma di senescenza cellulare costituisce una barriera importante contro il cancro iniziazione e sviluppo [24], [25]. Anche se gli studi precedenti dimostrano che, attraverso l'attenuazione dello stress ossidativo e il miglioramento del metabolismo, Res esercita effetti anti-invecchiamento sia in vitro
e in vivo
[26] - [28], gli effetti opposti hanno dimostrato nel cancro. Res è stato trovato per indurre inibizione della crescita simile alla senescenza in diversi tipi di tumori [29], [30]. Il doppio ruolo di Res in senescenza cellulare, ritardando l'invecchiamento nei tessuti normali e accelerare la senescenza nei tumori, lo rende un candidato ideale per la prevenzione e il trattamento del cancro.

L'apoptosi è un altro effetto comune che è di solito osservato in Res-trattati le cellule tumorali [9], [11], [15], [16]. Evidenze sperimentali indicano che l'apoptosi può essere mediata da diversi percorsi differenti e numerose molecole regolatrici. Tra questi regolatori, le proteine ​​che compongono la famiglia Bcl-2 sono importanti. Ci sono entrambe le proteine ​​anti-apoptotici (Bcl-2, Bcl-XL) e proteine ​​pro-apoptotici (bax, cattivo, Bak e Bcl-XS) in questa famiglia. Un aumento della bcl-2 rapporto bax pro-apoptotica /anti-apoptotica aumenta la permeabilità della membrana mitocondriale, provoca il rilascio del citocromo c dai mitocondri al citosol, a sua volta, determina l'attivazione della caspasi-9 e la valle bersaglio caspasi-3 [31]. Nonostante questo via apoptotica intrinseca, i ligandi pro-apoptotica, come FasL, legandosi ai loro recettori, provocano l'attivazione della caspasi-8 e effettori a valle, come la caspasi-3. L'attivazione delle caspasi effettrici induce la scissione di molti substrati cellulari e provoca direttamente l'apoptosi [31] - [33]. Sebbene numerosi rapporti precedenti hanno indicato che l'apoptosi è stato responsabile per l'inibizione della crescita Res-indotta, non abbiamo osservato evidente apoptosi nelle cellule GC Res-trattati. Questa assenza di apoptosi può essere dovuto alla concentrazione e durata del trattamento Res adattato nel nostro esperimento perché gli studi di diversi gruppi mostrano che Res esercita effetti dosatrice e durata dipendente [34], [35]. Inoltre, come gli effetti della Res sono anche specifici delle cellule [36] - [38], le cellule GC utilizzate nel nostro studio possono essere resistenti all'apoptosi Res-indotta

Res ha obiettivi multipli.; tra i quali, la classe III NAD ^{+ - dipendente deacetilasi Sirt1 è il più frequentemente studiato. Anche se uno studio ha indicato che biochimico Res non era un attivatore diretto di Sirt1 [39], Res è ancora stato considerato come un classico agonista di Sirt1. Numerosi studi dimostrano che Res esercita effetti diversi in diversi modelli in modo Sirt1-dipendente [40], [41]. Nel nostro esperimento, Sirt1-esaurimento invertito l'inibizione della crescita della Res sia in vitro
e in vivo
. L'arresto fase G1 e senescenza indotta dal trattamento Res sono stati salvati da Sirt1-esaurimento. Questi risultati indicano che gli effetti di inibizione della Res su GC dipendono Sirt1. Secondo gli studi precedenti, Sirt1 può regolare l'espressione genica attraverso due meccanismi differenti. In primo luogo, direttamente, Sirt1 media direttamente la deacetilazione di una proteina e quindi migliora la sua ubiquitinazione e conseguente degradazione del proteasoma ubiquitina [42]. In secondo luogo, indirettamente, Sirt1 esercita l'attività deacetilasi influenzare conferma della cromatina o reprimere le attività di fattori di trascrizione e quindi regola la trascrizione dei geni [43] - [45]. Come le molecole (ciclina D1, CDK4, CDK6, p21 e P16) rilevati nei nostri esperimenti non sono stati segnalati come gli obiettivi diretti di Sirt1, abbiamo ipotizzato che Sirt1 possa regolare l'espressione di questi geni principalmente attraverso il meccanismo indiretto. I risultati di RT-QPCR supportano questa ipotesi.}

Nel loro insieme, i nostri risultati suggeriscono che Res inibisce sia la proliferazione delle cellule GC in vitro
e la crescita di xenotrapianti in vivo
. trattamento Res induce arresto fase G1 nelle cellule GC e porta alla senescenza invece di apoptosi. SIRT1-esaurimento salva gli effetti della Res sopra descritti sia in vitro
e in vivo
. Il nostro lavoro indica che inibisce Res GC in maniera Sirt1-dipendente e fornisce la prova dettagliato per la possibilità di applicare Res nella prevenzione e nella terapia GC.

Informazioni di supporto
Figura S1.
Res esercita effetti sulla apoptosi di BGC-823 cellule. (A) L'apoptosi è stata segnalata da un'etichettatura TUNEL (rosso) e BGC-823 cellule sono state di contrasto con DAPI (blu). Il trattamento con H 2O 2 è servita come controllo positivo. ingrandimento originale: × 200. Barre di scala, 50 micron. (B) Regolatori della apoptosi in BGC-823 cellule, tra cui Bcl-2, Bax e caspasi-3 sono stati analizzati mediante western blot. (C) Regolatori di apoptosi nei xenotrapianti, tra cui Bcl-2, Bax e caspasi-3 sono stati analizzati mediante western blot. Per il rilevamento di spaccati caspasi-3, BGC-823 cellule trattate con H 2O 2 servito come controllo positivo (mostrato nel pannello di destra). (D) L'apoptosi in xenotrapianto è stato rilevato dal TUNEL etichettatura (rosso) e le sezioni sono state di contrasto con DAPI (blu). Le sezioni femminile roditore ghiandola mammaria ottenuti 3~5 dopo lo svezzamento dei cuccioli di ratto (Millipore) è servito come il controllo positivo. ingrandimento originale: × 200. Barre di scala, 50 micron. 'R' rappresenta il resveratrolo, 'Ci' rappresenta il controllo siRNA, e 'si' rappresenta la Sirt1 siRNA
doi:. 10.1371 /journal.pone.0070627.s001
(TIF)
Figura S2.
Knockdown di Sirt1 da shRNA-lentivirus. (A) BGC-823 cellule sono state trasfettate con controllo o Sirt1-specifici shRNA-lentivirus. L'efficienza di trasfezione è stata valutata con un microscopio a fluorescenza. Ad una molteplicità di infezione (MOI) di 50, più del 90% delle cellule sono state trasfettate con shRNA-lentivirus. Dopo quattro settimane di proiezione con puromicina, tutte le cellule viventi sono state trasdotte. Ingrandimento: × 100, bar per 200 micron. (B) Le cellule sono state raccolte 4 giorni dopo l'infezione e 28 giorni dopo lo screening puromicina. L'efficienza silenziamento di Sirt1 è stata verificata mediante Western blot
doi:. 10.1371 /journal.pone.0070627.s002
(TIF)
Tabella S1.
Primer per gli esperimenti di RT-QPCR eseguiti in questo studio
doi: 10.1371. /journal.pone.0070627.s003
(DOC)

• PLoS ONE: Rhoe promuove metastasi in cancro gastrico attraverso un meccanismo dipendente su di espressione migliore di CXCR4
• PLoS ONE: micofenolico acido inibisce la migrazione e l'invasione delle cellule cancro gastrico tramite diversi percorsi molecolari