PLoS ONE: suuren tuotantotehon Yhdistelmät ja Kopioi numero vaihtelu Detection käyttäminen Formaliini Kiinteät Embedded Tissuelle Metastaattinen Mahalaukun Cancer

tiivistelmä

aikakaudella täsmähoitoihin, mutaatio profilointi syöpä on ratkaiseva tekijä terapeuttisten päätöksiä . Luonnehtia syövän molekyylitasolla, käyttöä formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotettu kudos on tärkeää. Testasimme Ion AmpliSeq Cancer hotspot Panel v2 ja NCounter Kopioi numero vaihtelu Assay 89 formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut mahasyövän näytteitä onko niitä sovelletaan arkistointiin kliinisissä näytteissä henkilökohtaista kohdennettuja hoitoja. Me validoitu tuloksia Sangerin sekvensoinnilla, reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR, fluoresenssi in situ -hybridisaatio ja immunohistokemia. Usein havaitaan somaattiset mutaatiot sisällyttää TP53
(28,17%), APC
(10,1%), PIK3CA
(5,6%), KRAS
(4.5 %), SMO
(3,4%), STK11
(3,4%), CDKN2A
(3,4%) ja Smad4
(3,4%) . Amplifikaatioita HER2
, CCNE1
, MYC
, KRAS
ja EGFR
geenien havaittiin 8 (8,9%) , 4 (4,5%), 2 (2,2%), 1 (1,1%) ja 1 (1,1%) tapauksista, vastaavasti. Tapauksissa, joissa vahvistus, fluoresenssi in situ -hybridisaatio HER2
todennettujen-geenin monistuminen ja immunohistokemiaa HER2, EGFR ja CCNE1 tarkasti yliekspressio proteiinien kasvainsoluissa. Lopuksi olemme menestyksellisesti suoritetaan puolijohde-pohjainen sekvensointi ja NCounter kopioluvun vaihtelua analyysien formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut mahasyövän näytteitä. Korkean suoritustehon seulonnan arkistointia kliinisistä näytteistä mahdollistaa nopeamman, tarkemman ja kustannustehokkaampaa havaitseminen hotspot mutaatioiden tai vahvistusta geenien.

Citation: Kim S, Lee J, Hong ME, Do IG, Kang SY, Ha SY, et ai. (2014) suuren tuotantotehon Yhdistelmät ja Kopioi numero vaihtelu Detection käyttäminen Formaliini Kiinteät Embedded Tissue metastaattisessa syöpään. PLoS ONE 9 (11): e111693. doi: 10,1371 /journal.pone.0111693

Editor: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japani

vastaanotettu: 28 huhtikuu 2014; Hyväksytty: 29 syyskuu 2014; Julkaistu: 5. marraskuuta 2014

Copyright: © 2014 Kim et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustusta Koreasta Healthcare Technology R &D Project, Ministry for Health & Welfare asioiden Korean tasavalta (A101130) ja Samsung Biomedical Research Institute avustus (# SBRI-SP1B20112). Tutkimus tukee myös Samsung Medical Center sisäiset avustus, 20 x 20 Project (# GFO1140111). Tekijäkumppaneita Seokhwi Kim, Jeeyun Lee, Min Eui Hong, In-Gu Do, joten Young Kang, Sang Yun Ha, Seung Tae Kim, Se Hoon Park, Won Ki Kang, Min-Gew Choi, Jun Ho Lee, Tae Sung Sohn Jae Moon Bae, Sung Kim ja Kyoung-Mee Kim työskentelee Samsung Medical Center. Co-kirjailija Duk-Hwan Kim työskentelee Samsung Biomedical Research Institute. Samsung Biomedical Research Institute ja Samsung Medical Center tuettiin muodossa palkkojen tekijöille Seokhwi Kim, JL, MEH, IGD, SYK, SYH, STK, SHP, WKK, MGC, JHL, TSS, JMB, Sung Kim, KMK ja DHK , mutta ei ollut mitään ylimääräistä roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Erityinen roolit nämä kirjoittajat ovat muotoutuneet "kirjoittaja maksujen osiossa.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat seuraavat edut: Tämä tutkimus osarahoitteinen Samsung Biomedical Research Institute ja Samsung Medical Center. Tekijäkumppaneita Seokhwi Kim, Jeeyun Lee, Min Eui Hong, In-Gu Do, joten Young Kang, Sang Yun Ha, Seung Tae Kim, Se Hoon Park, Won Ki Kang, Min-Gew Choi, Jun Ho Lee, Tae Sung Sohn Jae Moon Bae, Sung Kim ja Kyoung-Mee Kim työskentelee Samsung Medical Center. Co-kirjailija Duk-Hwan Kim työskentelee Samsung Biomedical Research Institute. Ei ole olemassa patentteja, tuotteiden kehittämiseen tai kaupan tuotteiden julistaa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Vaikka mahasyövän on neljänneksi yleisin syöpä maailmassa, se on toinen kuolinsyy. [1] Sen esiintyvyys on huomattavasti korkeampi Aasian maissa, kuten Koreassa, missä se on toiseksi yleisin syöpä. [2] Viime aikoina useat kohdennettuja hoitomuotoja mahasyövän on löydetty, jotka tarjoavat lisävaihtoehtoja lääkäreille ja potilaille [3] - [5].

aikakaudella täsmähoitoihin, mutaatio profilointi aiheuttava syöpä on ratkaisevaa terapeuttista päätöksiä. Yritykset profiili mutaatioita on tehty perinteisin Sangerin sekvensointia; kuitenkin, se ei ole optimaalinen menetelmä kliinisissä yhteyksissä kustannusten vuoksi, aikaa ja työtä tarvitaan. Lisäksi Sangerin sekvensointia vaatii huomattavia määriä DNA: ta; arvioidaan pieniä määriä näytteen useita geenejä samaan aikaan ei ole mahdollista. Käyttöönotto seuraavan sukupolven sekvensointi (NGS) menetelmät on ratkaissut ongelman multiplex, suurikapasiteettisten sekvensointi monia näytteitä useita geenejä samanaikaisesti. [6], [7] Yksi NGS alustoja, Ion Torrent AmpliSeq Cancer Panel, perustuu ei-optinen havaitseminen vetyionien puolijohdekomponentin, [8], ja pystyy havaitsemaan 2855 onkogeenisen mutaation 50 yleisesti mutatoituja geenejä (taulukko S1). Se on ylivoimainen muihin massaspektroskopia-pohjainen sekvensointi menetelmiä sillä edellytyksellä, sekvensointi tuloksia nopeammin ja halvemmalla. [8] sovelletaan formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotettuja (FFPE) kudosnäytteiden pieniä määriä DNA: ta. Koska se takaa suuren herkkyyden seulonta tunnetaan onkogeeniset mutaatiot, [9], [10] Ion Torrent AmpliSeq Syöpä Panel on valinta 5 suurten syöpä keskukset Yhdysvalloissa molekyylidiagnostiikassa vuonna täsmähoitoihin [11].

monistaminen onkogeenien on tärkeä mekanismi geenin yli-ilmentymisen ja edistää kasvainten kehittymiseen. [12] Esimerkkeinä monistamiseen HER2
, MET
, FGFR2
ja KRAS
geenien syöpien. [13], [14] on havaittu kopioluvun vaihtelut (CNVs) kliinisistä näytteistä, fluoresenssi in situ -hybridisaatio (FISH) ja /tai immunohistokemia (IHC) on laajalti käytetty. Kuitenkin korkeat kustannukset ja pieni näyte koot koepala materiaalien rajoittaa näiden menetelmien soveltamiseen, ja on edelleen tarvetta suurikapasiteettisten tekniikka helppo saatavuus, korkea herkkyys ja alhaiset kustannukset. NCounter CNV koodistoja (Nanostring tekniikat, Life Sciences, Seattle, WA) tarjoavat erinomaisen tarkkuuden ja toistettavuuden tutkimuksiin kaikenkokoisille ja tuottaa parempia, nopeampia tuloksia huomattavasti vähemmällä vaivalla kuin reaaliaikainen kvantitatiivinen polymeraasiketjureaktio (qPCR) tai CNV taulukot [ ,,,0],15].

Parempi räätälöity syövän hoito saattaa parantaa potilaiden hoitotuloksiin. Potilaan kasvain näytteet tarpeen luonnehtia syövän molekyylitasolla ja tunnistaa sairauden alaryhmissä että pitäisi saada erilaisia ​​hoitoja. Käyttö FFPE kudos on tärkeää mahdollistaa tällaisten tutkimusten. [16] Tässä testasimme AmpliSeq ja NCounter mukautettuja CNV paneelit FFPE mahasyövän näytteitä onko niitä sovelletaan arkistointiin kliinisissä näytteissä henkilökohtaista kohdistettuja hoitomuotoja.

Materiaalit ja menetelmät

Näytteet

Kasvainsolulinja prosenttiyksikköä yli 75% leikeltiin alle mikroskoopilla 4 mm värjäämätön kohdat vertaamalla H &E värjättyä dia, ja genominen DNA uutettiin käyttäen Qiagen DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Saksa) mukaan valmistajan ohjeita 96 potilasta, joilla on edennyt mahasyöpä. Uuton jälkeen mittasimme pitoisuus sekä 260/280 ja 260/230 nm suhde spektrofotometrillä (ND1000, Nanodrop Technologies, ThermoFisher Scientific, MA, USA). Jokainen näyte sitten määrällisesti kanssa Qubit fluorometriä (Life Technologies, Carlsbad, Kalifornia). Genominen DNA > 10 ng mitattuna Qubit fluoromittaria alistettiin kirjaston valmistelua ja seitsemän näytettä epäonnistui rakentaa kirjastoja ja ne jätettiin pois tästä tutkimuksesta. Lopuksi, 89 tapausta lopuksi analysoitiin ja mukana 31 naisen ja 58 miehen potilailla. Taulukossa 1 luetellaan kliiniset ja patologinen ominaisuudet tutkimuspotilaat. Uusiutuminen tai etäpesäkkeitä kehittänyt 11 potilaalla, joilla mediaani seuranta-aika oli 76 kuukautta (vaihteluväli 5,5-+149,3). Tutkimuksen hyväksyi Institutional Review Board (IRB) Samsung Medical Center. Kaikki kliiniset tutkimuksen suorittanut periaatteiden mukaisesti ilmaistu Helsingin julistus. Kirjallisen suostumus oli luopunut IRB takia retrospektiivinen analyysi ja anonyymia tietoa. Näytteitä kerättiin osana rutiini lääketieteellinen toimenpide ja kerättiin tekijät tälle tutkimukselle. Näytteitä kuolleen potilaista tai eläviä potilaita kaikki de-tunnistettu, mukaan lukien poistaminen kaikki mahdolliset demografiset tiedot, ennen analysointia ja tietoisen suostumuksen muoto oli luopunut IRB.

Ion AmpliSeq syöpä paneeli v2

Käytimme Ion AmpliSeq Cancer Panel v2 (Ion Torrent) havaitsemiseksi usein somaattisia mutaatioita, jotka valittiin perustuu kirjallisuuskatsaukseen. Siinä tarkastellaan 2855 mutaatiot 50 yleisesti muuntunut onkogeenien ja tuumorisuppressorigeeneille (taulukko S1). Ensimmäinen, 10 ng DNA: ta jokaisesta 89 FFPE tuumorinäytteet tehtiin yhden putken, multiplex PCR-monistus käyttäen Ion AmpliSeqCancer Primer Pool ja Ion AmpliSeqKit reagenssien (Life Technologies). Käsittelemällä saatua amplikonien kanssa Fupa Reagent osittain pilkottu alukkeiden ja fosforyloituu amplikoneista. Fosforyloitu amplikonit liitettiin Ion sovittimet ja puhdistettu. Sillä viivakoodilla kirjasto valmisteluun, me substituoidut viivakoodilla sovittimet Ion Xpress Viivakoodi sovittimet 1-96 Kit ei-viivakoodilla sovittimen yhdistelmä toimitetaan Ion AmpliSeq Library Kit. Ligoitu DNA tehtiin nick-translaatio ja vahvistus loppuun kytkös adapterit ja amplikonien ja tuottamaan riittävästi materiaalia loppupään mallin valmistelu. Kaksi kierrosta Agencourt AMPure XP Reagent sitovia 0,6 ja 1,2 helmi-to-näytteen tilavuuden suhde pois tulo DNA ja rekisteröimättömät alukkeita amplikoneista. Lopulliset kirjasto molekyylit olivat 125~300 emäsparin kokoisia. Sitten siirrettiin kirjastojen Ion OneTouch System for automatisoidun mallin valmistelu. Sekvensointi suoritettiin Ion PGM sekvensseri mukaan valmistajan ohjeiden. Käytimme IonTorrent Ohjelmistotyökaluja tietojen analysointia.

mittaamiseksi herkkyys ja spesifisyys Ion AmpliSeq syöpä paneeli, koko exome sekvensointi tuloksia 4 mahasyövän näytteet, joiden tiedetään mutaatiostatus käytettiin [17].

NCounter Kopioi numero vaihtelu koodistoja

havaitsemiseksi CNV, NCounter Kopioi numero vaihtelu koodistoja käytettiin 300 ng puhdistettua genomista DNA: ta 2-3 kohdat 4-pm paksun FFPE edustaja kasvainkudospalasta käyttäen QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Saksa). DNA hajanainen kautta AluI ruoansulatusta ja denaturoitiin 95 ° C: ssa. Fragmentoitunutta DNA: ta hybridisoitiin codeset 86 geenien NCounter Cancer CN Assay Kit (Nanostring Technologies) 18 tuntia 65 ° C: ssa ja käsitellään valmistajan ohjeiden mukaisesti. NCounter Digital Analyzer lasketaan ja taulukoidaan signaalien reportteri antureista ja keskimääräinen määrä numerot > 3 kutsuttiin ja varmistettiin IHC, kalaa tai reaaliaikainen PCR.

IHC HER2, EGFR (HER1) ja CCNE1

validointi CNV saatujen tulosten NCounter teimme IHC HER2 kaikissa tapauksissa, ja EGFR ja CCNE1 valikoiduissa tapauksissa. Sen jälkeen deparaffinization ja nesteytys, 4 mm osioista silaanilla päällystettyä diat immunovärjättiin HER2. HercepTest (Dako, Glostrup, Tanska) käytettiin mukaisesti valmistajan ohjeita kuten aiemmin on kuvattu. [18] EGFR käytimme anti-NCL-L-EGFR-384 hiiren monoklonaalinen primaarinen vasta-aine (1:100 laimennus; Novocastra /Vision Biosystems, Newcastle, UK) ja CCNE1 käytimme anti-CCNE1 /sykliini E1-vasta-aineen (klooni HE12; 1:200 laimennus; Thermo Fisher Scientific, MA). Ventana BenchMark XT automatisoitu slide-käsittelyjärjestelmä käytettiin mukaan valmistajan protokollaa. Asiantuntija patologi (KMK) arvioi tulokset.

FISH HER2

FISH suoritettiin käyttäen dual-väri DNA-koettimien välillä PathVision ™ (Abbott /Vysis: LSI HER2 SpectrumOrange ™ ja CEP 17 SpectrumGreen ™), kuten on aiemmin kuvattu tapauksissa moniselitteisiä yli-ilmentävät HER2. [19] Laskimme hybridisaatiosignaalit 20 ytimet näytettä kohti fluoresenssimikroskoopilla (Zeiss Axioskop) käyttäen suodinsarjat suosittelemia Vysis (DAPI /Spectrum Orange dual kaistanpäästö-, DAPI /Spectrum Green dual bandpass). Kaikki päällekkäiset tumat ulkopuolelle, ja vain ytimet selvä ydin- rajan arvioitiin. HER2
geeni pidettiin monistettiin kun FISH signaali suhde HER2 /CEP17
oli suurempi tai yhtä suuri kuin 2,0 [20].

Reaaliaikainen PCR KRAS ja MET vahvistus

Käytimme DNA: iden saatu FFPE mahakarsinoo- tuumorikudoksia. Reaktioseos sisälsi 2 ui genomista DNA: ta templaattina, 10 ui Taqman Universal PCR Master-seos (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA) ja 0,2 uM kutakin aluketta. Tarkkaa havaitsemista CN muutoksia, analysoitiin kolme eri alueilla KRAS
geeni: alue sisällä introni 1 (TaqMan kopiomäärän määritys Hs06943812_cn), alueen sisällä intronin 2 (Hs002534878_cn), ja alueen sisällä eksonin 6 (Hs02739788_cn). Sillä MET
geenin, käytimme alukkeita, kuten aiemmin on kuvattu [21].

mitattu kopioluvun saada käyttäen seuraavaa profiilia: 2 min 50 ° C: ssa, denaturaatio 95 ° C: ssa 10 min, jota seurasi 40 sykliä 95 ° C 15 sekuntia ja 60 ° C 1 min. Meillä on määritetty suhteessa kvantifioinnin avulla 7900 HT nopea reaaliaikainen PCR systeemi nelinkertaisena. RNaseP iinianalyysikitissä (Applied Biosystems) käytettiin kontrollina. Sen jälkeen vahvistus toimme kokeilun tulokset sisältävä raja-sykli arvot kopiomäärä ja viite määritys osaksi CopyCaller Software (Applied Biosystems) jälkeisen PCR data-analyysi edellä kuvatulla tavalla. [22] Me osoitettu CN vahvistuksen tila ja määrä KRAS
kappaletta perustuu konkordanssin tulokset vähintään kaksi kolmesta antureista.

Määritysmenetelmät

Me sulkea kaikki samaa muutokset jälkeen automatisoitu mutaation-kutsuvan algoritmia käytettiin havaitsemaan väitettyä mutaatioita. Toistuvat puhelut yli 10 89 näytettä pidettiin vääriä positiivisia ja jätettiin pois. Käytimme raja-arvot yli 6% variantti taajuus ja yli X100 kattavuus havaita tosi mutaatiomuutosten mukaisesti aiempien tutkimusten ja omaan kokemukseen. [9], [10] Me suodatettu pois yhden nukleotidin polymorfismien jälkeen manuaaliseen tarkistukseen kunkin polymorfismi Luettelon Somaattiset mutaatiot Cancer (COSMIC, http://cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmic) ( Kuvio 1). Tunnettujen geenien mutatoitunut mahakarsinoomat ( TP53
, APC
, PIK3CA
, STK11
, CDKN2A
, KRAS
, HRAS
, BRAF
ja CTNNB1
), manuaalinen tarkistus automaattisten puhelujen tuloksista tehtiin kiinni haitallisia mutaatioita hieman laitteista matalissa variantti taajuus.

tulokset

tulokset Ion AmpliSeq syöpä paneeli

pitoisuudet DNA: t, niiden pitoisuus kertaiseksi, keskimääräinen kattavuus näytteiden kokonaismäärät emäksiä, > Q20 emäkset, lukee, merkitse lukea pituus, kartoitettu lukee, on-tavoitetason (%), keskimääräinen syvyys ja yhdenmukaisuutta tulokset on kuvattu taulukossa S2. Kaikkiaan saimme 8178 variantti puhelut 89 näytettä, joiden joukossa 3554 puhelut eivät olleet synonyymejä muutoksia. Suodattamisen jälkeen toistuvia puheluja, < 6% variantin-alleelin taajuus, < 100X kattavuus ja niille intronialueesta, 65 variantti puhelut valittiin. Lisäksi olemme tarkastaneet automatisoitu puhelut tunnettuja mutaatioita kuten BRAF
, KRAS
ja PIK3CA
ja voi tallentaa kaksi varianttia puhelut, jotka oli jätetty aikana suodatuksen prosesseja. Kolmekymmentäyhdeksän 89 näytettä (43,8%) kanna ainakin yksi mutaatio (kuvio 1). Kaksi tapausta osoitti 22 ja 5 mutaatioita, vastaavasti. Jälkimmäisessä tapauksessa kanna MLH1
somaattinen mutaatio [missensemutaatio eksonissa 20: c.1147A > G (p.M383 V)] ja MLH1
promoottori hypermetylaation kanssa MLH1 proteiinin tappioita IHC käyttämällä aiemmin kuvatuilla menetelmillä [23], mikä viittaa siihen, hypermutated kasvain. Vaikka mutaatiot löytyy edellisessä tapauksessa kulunut variantti taajuus ja kattavuus leikata off, nämä mutaatiot eivät vahvistaneet Sangerin sekvensoinnilla, mikä viittaa vääriä positiivisia tässä tapauksessa johtuu huonosta laadusta DNA. Eli tässä tapauksessa jätettiin lopullisen analyysien tulokset. Usein havaitaan somaattiset mutaatiot sisällyttää TP53
(24 tapausta, 27,0%), APC
(9 tapausta, 10,1%), PIK3CA
(5 tapausta, 5,6%), %), KRAS
(3 tapausta, 3,4%), SMO
(4 tapausta, 4,5%), STK11
(3 tapausta, 3,4%), CDKN2A
(3 tapausta, 3,4%), ja Smad4
(3 tapausta, 3,4%), kuten on esitetty taulukossa 2. Taulukko 2 myös esitetty yhteenveto aminohapon muutoksia usein mutatoituja geenejä. Havaitsimme 19 potilasta (21,3%), jossa on kaksi tai useampia ainutlaatuisia ja samanaikaisesti somaattisista mutaatioista.

neljä mahasyövän näytteitä, joilla on tunnettu mutaatio taajuudet määritetään koko exome sekvensointi ja vahvistettiin Sangerin sekvensoinnilla, olemme määritelleet somaattiset mutaatiot TP53
, erbB4
ja CTNNB1
ilman vääriä positiivisia puheluita muiden geenien (taulukko S3).

monistaminen NCounter ja validointi IHC, FISH tai reaaliaikaisen PCR

Amplifikaatiot on HER2
, CCNE1
, MYC
, KRAS
ja EGFR
geenien havaittiin 8 (8,9%), 4 (4,5%), 2 (2,2%), 1 (1,1%) ja 1 (1,1%) tapauksista, vastaavasti (taulukko 3). Emme havainneet monistamiseen MET
, FGFR2
, CDK4
ja CDK6 missään tapauksissa. Tapauksissa, joissa vahvistus, IHC HER2, EGFR ja CCNE1 osoitti yliekspressio proteiinien kasvainsolujen (kuvio 2A, B ja C). Yhdessä tapauksessa HER2 2+ by HercepTest, FISH osoitti heterogeeninen monistamiseen HER2
geeneistä (kuvio 2D).

reaaliaikaisia ​​PCR KRAS
, yhdessä tapauksessa jossa vahvistus osoittivat lisääntynyttä kopioida numeroita (36, 37 ja 49); tapauksissa, jotka olivat negatiivisia KRAS
vahvistusta, ei ollut kasvua kopiomääränä (0,9-2,4, keskiarvo 1,4).

MET
geeni, emme löydä positiivinen tapaus, koska niiden harvinaisuus [21]. Siksi käytimme vielä kymmenen (viisi kutakin vahvistetaan ja vahvistamattoman) mahasyövän näytteitä ja MET
monistettiin mahasyövän solulinjoissa (MKN45 ja SNU5), joiden tiedetään kopioida numeroita ja mRNA määriä. CNVs havaita NCounter korreloivat hyvin kopio tunnistettuja reaaliaikaisella PCR (taulukko S4) ja mRNA tasot MET
geeni (Pearsonin korrelaatio koe; r = 0,874, p = 0,001) (Kuva S2).

keskustelu

käyttämällä Ion AmpliSeq v2 huomasimme, että 39 ulos 89 kehittyneen mahalaukun adenokarsinooman näytteet sisälsivät somaattiset mutaatiot, mikä osoittaa, että tämä alusta on helposti sovellettavissa arkistointia FFPE kudosnäytteistä. TP53
oli useimmin havaittu mutaatio, jonka jälkeen APC
, PIK3CA
ja KRAS
. Lisäksi meidän tapamme CNV paneelin onnistuneesti havaittu CN nousua HER2
, CCNE1
, MYC
, EGFR
ja KRAS
geenejä, jota vahvistettiin IHC ja reaaliaikainen PCR.

Mutaatiotutkimukset taajuuksia COSMIC tietokannasta käy ilmi huomattavia yhtäläisyyksiä tietojen saimme tästä tutkimuksesta: TP53
(32%), PIK3CA
(10%), KRAS
(6%), APC
(6%), CTNNB1
(5%), CDKN2A
(5%), FBXW7
(5%), SMO
(4%), erbB2
(2%) ja STK11
(2%). Viimeaikaiset koko exome sekvensointi tutkimukset mahalaukun adenokarsinoomaa osoittivat hieman korkeampia taajuuksia TP53
(36% ja 73%) ja PIK3CA
(14% ja 20%) mutaatioita verrattuna tuloksemme. [24], [25] Vaikka mutaatio taajuuksia olivat alhaisempia verrattuna exome sekvensointi tuloksia, oli merkittävä kasvu verrattuna edellisessä tietoja massaspektrometria-pohjainen OncoMap v4. [26] Sekä AmpliSeq ja OncoMap havaita mutaatioita hotspot alueilla, jotka selittävät havainnot harvemmin mutaatio joissain onkogeenien ja tuumorisuppressorigeeneille. Kuva S1 vertaa AmpliSeq v2 ja OncoMap v4 havaittavia Mutaatioiden. Edellinen OncoMap kokeet 237 mahalaukun adenokarsinooman paljasti, että PIK3CA
mutaatiot olivat yleisiä pitkälle edennyt sairaus (5,1% vaiheessa IV; 6,4% vaiheen II /III; 2,4% vaiheessa IB). [26] Tässä tutkimuksessa havaitsimme kolme PIK3CA
mutaatioita potilailla, joilla on vaiheen III ja kaksi vaiheen II tauti, tukee niiden biologinen rooli syövän etenemiseen. Havaitsimme myös HER2
( ErbB2
) c.2524G > A (V842I) mutaatio tapauksessa mahasyövän. Prekliinisissä tutkimuksissa, solulinjat kätkeminen V842I mutaatio oli resistenttejä trastutsumabille, mutta olivat herkkiä peruuttamattomia HER2 estäjä, neratinib [27].

Semiconductor perustuva sekvensointi on perustavanlaatuisia eroja tunnistus ja signaalitransduktion verrattuna massaspektrometriaa -pohjainen sekvensointi. Sen sijaan käyttää optisia menetelmiä havaitsemiseksi nukleotidin muutoksia, puolijohde-pohjainen tekniikka tunnistaa pH muuttuu vapautuminen protonien (H ^{+), kun nukleotideja integroitua kasvavaan DNA strand. [8] Näin ollen, on olemassa merkittävä kustannusten pieneneminen ja aika, joka tarvitaan tiedon käsittelyyn verrattuna muihin NGS alustoille. Tarjoaa nopean ja tarkan tiedon mutaatioiden edullisesti on ratkaisevan tärkeää potilaille, joilla on erittäin aggressiivinen syövät, kuten mahasyöpä.}

Tässä tutkimuksessa olemme manuaalisesti tarkistetaan automaattiseen puhelujen tunnettujen mutaatioiden levittämisen jälkeen rajataajuus arvot taajuus ja kattavuus, lisäämällä sen jälkeen puhelusta matalan variantti kattavuus. Vaikka niiden kattavuus arvot eivät pääse alkuperäistä kriteerit, niiden taajuudet ylitti ensimmäisen asetus (6%) ja tietojen laatu oli hyvä. Tämä korostaa manuaalista tarkistusta jälkeen automatisoitu seulonnan. Äskettäin julkaistut tulokset käyttäen AmpliSeq kuin analysointi- alustan korostavat korvaus seulonta tietojen manuaalinen tarkastelu [9], [10].

Henkilökohtainen täsmähoitoihin kokeneille syöpien tukeutuu käsitteen "onkogeenin riippuvuus," in jossa useita geneettisiä poikkeavuuksia ovat riippuvaisia ​​yhden tai muutaman geenejä kasvainsolun huolto- ja selviytymistä. [28] Avoimessa, kansainvälinen, vaiheen 3, satunnaistetussa kontrolloidussa Toga (Trastutsumabi mahasyövän) tutkimus osoitti, että trastutsumabia yhdessä kemoterapian on uusi standardi vaihtoehdon HER2-positiivinen edenneen mahasyövän tai maha- ruokatorven risteyksessä syöpä. [29] prekliinisissä tutkimus osoitti, että osajoukko mahasyövistä kanssa EGFR
tai MET
vahvistusta ja yli-ilmentyminen vastata setuksimabista tai MET reseptori tyrosiinikinaasin estäjä hoitoa. [30] Lisäksi amplifikaatioita solusyklin välittäjänä CCNE1
ehdottaa mahdollisia terapeuttisia esto sykliiniriippuvaisten kinaasien syöpien. [31] Seulonta monistettujen geenien kohdennetun hoidon high-throughput tekniikka on erittäin tärkeää. Perinteiset menetelmät, kuten FISH ja array vertaileva genominen hybridisaatio kärsivät alhainen resoluutio perimän alueita, korkeat kustannukset ja ovat labor- ja aikaa vievää. [32] Tässä ensimmäisessä tutkimuksessa NCounter CNV analyysien, huomasimme, että tämä tekniikka on sovellettavissa FFPE kliinisissä näytteissä ja me validoitu tulokset IHC, FISH ja reaaliaikainen PCR. Vaikka emme vahvista kaikki geenit käytettävät mukautetun alukkeiden, validointi johtaa useisiin valitun geenin olivat merkittäviä.

Yhteenvetona suoritettu onnistuneesti puolijohde-pohjainen sekvensointi ja NCounter CNV analyysit FFPE kudosnäytteiden 89 mahalaukun adenokarsinoomat. Suurikapasiteettinen sekvensointi ja CNV seulonta arkistointia kliinisistä näytteistä mahdollistaa nopeamman, tarkemman ja kustannustehokkaampaa havaitseminen hotspot mutaatioiden ja CNV geeneissä. Aikakaudella henkilökohtaisen genomista lääketieteen, aiomme käyttää näitä välineitä seuloa mahasyövän potilaille, jotka voivat hyötyä kohdistettuja hoitoja.

tukeminen Information
Kuva S1.
vertailu kattavuuden Ion AmpliSeq v2 syöpä paneeli versus Oncomap v4.
doi: 10,1371 /journal.pone.0111693.s001
(TIF) B Kuva S2.
Tontit korrelaatio MET
CNVs havaita NCounter ja mRNA tasot MET
geenistä reaaliaikainen PCR.
doi: 10,1371 /journal.pone.0111693.s002
(TIF) B Taulukko S1.
Gene List varten Ion Torrent AmpliSeq Cancer Panel.
doi: 10,1371 /journal.pone.0111693.s003
(XLS) B Taulukko S2.
pitoisuudet DNA: t, niiden pitoisuus kertaiseksi, keskimääräinen kattavuus näytteiden kokonaismäärät emäksiä, > Q20 emäkset, lukee, merkitse lukea pituus, kartoitettu lukee, on-tavoitetason (%), keskimääräinen syvyys ja yhdenmukaisuutta.
doi: 10,1371 /journal.pone.0111693.s004
(XLS) B Taulukko S3.
Somaattiset mutaatiot TP53
, erbB4
ja CTNNB1
.
doi: 10,1371 /journal.pone.0111693.s005
(XLS)
Taulukko S4.
CNVs havaita NCounter korreloivat hyvin kopio tunnistettuja reaaliaikaisella PCR: llä.
doi: 10,1371 /journal.pone.0111693.s006
(XLSX) B

• PLoS ONE: Onko Early Oral Ruokinta jälkeen Mahalaukun syöpä toteutettavissa? Järjestelmällinen katsaus ja meta-analyysi satunnaistetuissa kontrolloiduissa kokeissa
• PLoS ONE: vertailu Operatiivinen Tulokset ja oppimiskäyrät välillä Laparoskooppinen ja Robotic gastrectomy mahasyövän