PLOS ONE: High-Throughput Séquençage et Copy Number Variation de détection utilisant la formaline fixe Tissue embarqué dans métastatiques gastrique Cancer

Résumé

Dans l'ère de la thérapie ciblée, mutation profilage du cancer est un aspect crucial de prendre des décisions thérapeutiques . Pour caractériser le cancer au niveau moléculaire, l'utilisation de tissus de paraffine fixés au formol est important. Nous avons testé la v2 Panel Ion AmpliSeq Cancer Hotspot et nCounter Copy Number Variation Assay dans 89 échantillons de cancer gastrique paraffine fixés au formol pour déterminer si elles sont applicables dans des échantillons cliniques d'archives pour les thérapies ciblées personnalisées. Nous avons confirmé les résultats obtenus avec le séquençage de Sanger, la PCR quantitative en temps réel, la fluorescence par hybridation in situ et immunohistochimie. Fréquemment détectés mutations somatiques inclus TP53
(28,17%), APC
(10,1%), PIK3CA
(5,6%), KRAS
(4.5 %), SMO
(3,4%), STK11
(3,4%), CDKN2A
(3,4%) et (3,4% de SMAD4) . Amplifications de HER2
, CCNE1
, MYC
, KRAS
et Les gènes EGFR ont été observés chez des 8 (8,9%) , 4 (4,5%) 2 (2,2%) 1 (1,1%) et 1 (1,1%) des cas, respectivement. Dans les cas avec l'amplification, l'hybridation fluorescente in situ dans HER2 de l'amplification du gène vérifié et immunohistochimie pour HER2, EGFR et CCNE1 a vérifié la surexpression de protéines dans des cellules tumorales. En conclusion, nous avons réalisé avec succès le séquençage à base de semi-conducteurs et des analyses variation nCounter du nombre de copies dans des échantillons de cancer gastrique fixés au formol paraffine. Le criblage à haut-débit dans les échantillons cliniques d'archives permet une détection plus rapide, plus précise et rentable des mutations hotspot ou l'amplification des gènes

Citation:. Kim S, Lee J, Hong ME, Do IG, Kang SY, Ha SY et al. (2014) à haut débit Séquençage et Copie Nombre Variation de détection utilisant la formaline fixe Tissue embarqué dans métastatiques cancer gastrique. PLoS ONE 9 (11): e111693. doi: 10.1371 /journal.pone.0111693

Editeur: Hiromu Suzuki, Université médicale de Sapporo, Japon

Reçu le 28 Avril 2014; Accepté: Septembre 29 2014; Publié 5 Novembre, 2014

Droit d'auteur: © 2014 Kim et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Disponibilité des données:. La auteurs confirment que toutes les données sous-jacentes les résultats sont entièrement disponibles sans restriction. Toutes les données pertinentes sont dans le ses fichiers de renseignements à l'appui du papier et

Financement:. Cette étude a été soutenue par une subvention de la Corée Healthcare Technology R & D Project, Ministère de la Santé & Affaires de bien-être, de la République de Corée (A101130) et une subvention Institut de recherche biomédicale Samsung (# SBRI-SP1B20112). Cette étude a également été soutenue par une subvention intra-muros Samsung Medical Center, 20 x 20 Project (# GFO1140111). Co-auteurs Seokhwi Kim, Jeeyun Lee, Min Eui Hong, In-Gu Do, So Young Kang, Sang Yun Ha, Seung Tae Kim, Se Hoon Park, Won Ki Kang, Min-Gew Choi, Jun Ho Lee, Tae Sung Sohn , Jae Bae Lune, Sung Kim et Kyoung-Mee Kim sont employés par Samsung Medical Center. Co-auteur Duk-Hwan Kim est employé par l'Institut de recherche biomédicale Samsung. Institut de recherche Samsung Biomedical Medical Center et Samsung ont fourni un soutien sous la forme de salaires pour les auteurs Seokhwi Kim, JL, MEH, IGD, SYK, AJS, STK, SHP, WKK, MGC, JHL, TSS, JMB, Sung Kim, KMK et DHK , mais n'a pas eu un rôle supplémentaire dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit. Les rôles spécifiques de ces auteurs sont énoncés dans la section 'auteur de contributions

Intérêts concurrents:. Les auteurs ont les intérêts suivants: Cette étude a été financée en partie par l'Institut de recherche biomédicale Samsung et Samsung Medical Center. Co-auteurs Seokhwi Kim, Jeeyun Lee, Min Eui Hong, In-Gu Do, So Young Kang, Sang Yun Ha, Seung Tae Kim, Se Hoon Park, Won Ki Kang, Min-Gew Choi, Jun Ho Lee, Tae Sung Sohn , Jae Bae Lune, Sung Kim et Kyoung-Mee Kim sont employés par Samsung Medical Center. Co-auteur Duk-Hwan Kim est employé par l'Institut de recherche biomédicale Samsung. Il n'y a pas de brevets, produits en développement ou les produits commercialisés à déclarer. Cela ne modifie pas l'adhésion des auteurs à tous les PLOS ONE politiques sur les données et les matériaux de partage.

Introduction

Bien que le cancer gastrique est le quatrième cancer le plus répandu dans le monde, il est le deuxième principale cause de décès. [1] Son incidence est significativement plus élevé dans les pays asiatiques, dont la Corée, où il est le deuxième cancer le plus commun. [2] Récemment, plusieurs thérapies ciblées pour le cancer gastrique ont été découverts, qui offrent des options supplémentaires pour les médecins et les patients [3] - [5]

Dans l'ère de la thérapie ciblée, mutation profilage du cancer causal. est crucial pour les décisions thérapeutiques. Les tentatives pour le profil de mutations ont été faites en utilisant le séquençage Sanger traditionnelle; cependant, il ne constitue pas une méthode optimale dans les milieux cliniques en raison du coût, le temps et le travail requis. De plus, le séquençage Sanger nécessite des quantités importantes d'ADN; l'évaluation de petites quantités d'échantillon pour plusieurs gènes en même temps est impossible. L'introduction de séquençage de prochaine génération (NGS) méthodes a résolu ce problème par séquençage multiplex, à haut débit de nombreux échantillons pour plusieurs gènes simultanément. [6], [7] L'une des plates-formes de l'END, le Cancer Panel Ion Torrent AmpliSeq, repose sur la détection non-optique des ions d'hydrogène dans un dispositif semi-conducteur, [8] et est en mesure de détecter 2855 mutations oncogéniques dans 50 gènes couramment mutés (tableau S1). Il est supérieur à d'autres méthodes de séquençage à base de spectroscopie-masse, fournissant le séquençage des résultats plus rapidement et à moindre coût. [8] Elle est applicable dans les échantillons (FFPE), les tissus fixés au formol paraffinées avec de petites quantités d'ADN. Parce qu'elle assure une sensibilité élevée dans dépistage connu des mutations oncogéniques, [9], [10] le Cancer Panel Ion Torrent AmpliSeq est le choix de 5 centres anticancéreux majeurs aux États-Unis pour le diagnostic moléculaire en thérapie ciblée [11].

Amplification d'oncogènes est un mécanisme important pour la surexpression du gène et contribue au développement de la tumeur. [12] Les exemples comprennent l'amplification de HER2
, MET
, FGFR2
et Les gènes KRAS dans les cancers de l'estomac. [13], [14] Dans la détection des variations du nombre de copies (CNV) dans des échantillons cliniques, l'hybridation fluorescente in situ (FISH) et /ou immunohistochimie (IHC) a été largement utilisé. Cependant, les coûts élevés et de petites tailles de matériaux de biopsie de l'échantillon limitent l'application de ces méthodes, et il y a encore un besoin pour plus de la technologie à haut débit avec un accès facile, une sensibilité élevée et de faibles coûts. Jeux de codes nCounter CNV (technologies Nanostring, Sciences de la vie, Seattle, WA) offrent une précision supérieure et la reproductibilité des études de toutes tailles et de produire de meilleurs, des résultats plus rapides avec beaucoup moins d'efforts que en temps réel la réaction en chaîne par polymérase quantitative (qPCR) ou des tableaux CNV [ ,,,0],15].

traitement du cancer Mieux-mesure peut améliorer les résultats des patients. des échantillons de tumeurs de patients seront nécessaires afin de caractériser le cancer au niveau moléculaire et identifier les sous-groupes de maladies qui doivent recevoir des traitements différents. L'utilisation de tissus FFPE est important pour permettre de telles études. [16] Ici, nous avons testé les panneaux personnalisés CNV AmpliSeq et NCounter dans FFPE échantillons de cancer gastrique pour déterminer si elles sont applicables dans des échantillons cliniques d'archives pour les thérapies ciblées personnalisées.

Matériel et méthodes

pourcentage des cellules tumorales de plus de 75% ont été disséquées en microscopie de 4 mm sections non colorées par comparaison avec un H & E lame colorée, et l'ADN génomique a été extrait en utilisant un kit tissulaire Qiagen ADN FFPE (Qiagen, Hilden, Allemagne) selon les instructions du fabricant à partir de 96 patients atteints d'un cancer gastrique avancé. Après extraction, nous avons mesuré la concentration ainsi que 260/280 et 260/230 ratio nm par spectrophotomètre (ND1000, Nanodrop Technologies, ThermoFisher Scientific, MA, USA). Chaque échantillon a ensuite été quantifiée avec le Qubit fluoromètre (Life Technologies, Carlsbad, Californie). L'ADN génomique avec > 10 ng mesurée par Qubit fluorimètre a été soumis à la préparation bibliothèque et sept échantillons n'a pas réussi à construire des banques et ont été exclus de cette étude. Enfin, 89 cas ont finalement été analysés et inclus 31 femmes et 58 patients de sexe masculin. Le tableau 1 présente les caractéristiques cliniques et pathologiques des patients dans cette étude. Récurrence ou des métastases développées chez 11 patients avec période de suivi médiane de 76 mois (intervalle de 5,5 à 149,3). L'étude a été approuvée par le comité d'examen institutionnel (IRB) au Centre médical de Samsung. Toutes les investigations cliniques a été menée selon les principes énoncés dans la Déclaration d'Helsinki. Le consentement éclairé a été levée par la CISR en raison d'une analyse rétrospective et des données anonymes. Des échantillons ont été prélevés dans le cadre d'une procédure médicale de routine et ont été recueillies par les auteurs de cette étude. Les échantillons provenant de patients décédés ou vivants patients ont tous été dépersonnalisés, y compris la suppression de toute information démographique, avant l'analyse et formulaire de consentement éclairé a été levée par la CISR.

panneau de cancer Ion AmpliSeq v2

Nous avons utilisé le Ion AmpliSeq Cancer Panel v2 (Ion Torrent) pour détecter des mutations somatiques fréquentes qui ont été sélectionnés en fonction de revue de la littérature. Il examine 2855 50 mutations dans des oncogenes mutées fréquemment et les gènes suppresseurs de tumeurs (tableau S1). Tout d'abord, 10 ng d'ADN provenant de chacun des 89 échantillons de tumeur FFPE a subi un seul tube, une amplification par PCR multiplex en utilisant l'amorce d'ions AmpliSeqCancer la piscine et les réactifs ions AmpliSeqKit (Life Technologies). Traitement des amplicons résultants avec Fupa réactif partiellement digéré les amorces et phosphorylée les amplicons. Les amplicons phosphorylés ont été ligaturées à ions Adaptateurs et purifiée. Pour la préparation de la bibliothèque à code-barres, nous avons remplacé les adaptateurs à code-barres de la Ion Xpress Barcode adaptateurs 1-96 Kit pour le mélange de l'adaptateur non fourni dans le code-barres Kit Ion AmpliSeq Library. L'ADN ligaturé a subi translation de coupure et d'amplification pour compléter le lien entre les adaptateurs et les amplicons et de générer suffisamment de matériel pour la préparation du modèle en aval. Deux séries de Agencourt AMPure XP Réactif de liaison à 0.6 et 1.2 des rapports de volume de perles à échantillon retiré l'ADN d'entrée et des amorces non constituées à partir des amplicons. Les molécules de la bibliothèque finales étaient 125~300 pb. Nous avons ensuite transféré les bibliothèques au système OneTouch Ion pour la préparation de modèle automatisé. Le séquençage a été réalisé sur le séquenceur d'ions PGM selon les instructions du fabricant. Nous avons utilisé IonTorrent Logiciels d'analyse de données automatisée.

Pour mesurer la sensibilité et la spécificité du panneau de cancer Ion AmpliSeq, ensemble des résultats de séquençage de l'exome de 4 échantillons de cancer gastrique avec le statut de mutation connue ont été utilisés [17].

nCounter Copy Number Variation
jeux de codes

Pour la détection de CNV, jeux de codes nCounter Copy Number Variation ont été utilisés avec 300 ng d'ADN génomique purifié extrait de 2-3 sections de blocs représentant une tumeur FFPE 4 um d'épaisseur en utilisant QIAamp Kit Tissue ADN FFPE (Qiagen, Hilden, Allemagne). L'ADN a été fragmenté par AluI digestion et dénaturé à 95 ° C. ADN fragmenté a été hybride avec l'ensemble de codes de 86 gènes dans le cancer du Assay Kit CN WhatIsSelected (Nanostring Technologies) pendant 18 heures à 65 ° C et traité selon les instructions du fabricant. L'analyseur numérique nCounter compté et compilé les signaux de sondes rapporteurs et les numéros de compte moyen de > 3 sont appelés et confirmés par IHC, FISH ou PCR en temps réel

IHC pour HER2, EGFR (HER1) et CCNE1.

pour la validation des résultats obtenus à partir de CNV nCounter, nous avons joué IHC pour HER2 dans tous les cas, et EGFR et CCNE1 dans certains cas. Après déparaffinage et réhydratation, sections 4 mm sur des lames de silane revêtues ont été immunocolorées pour HER2. Le HercepTest (Dako, Glostrup, Danemark) a été utilisé selon les directives du fabricant, comme décrit précédemment. [18] Pour EGFR, nous avons utilisé l'anticorps anti-NCL-L-EGFR-384 souris monoclonal primaire (1:100 dilution; Novocastra /Vision Biosystems, Newcastle, Royaume-Uni) et pour CCNE1 nous avons utilisé anti-CCNE1 /cycline E1 Anticorps (clone HE12; 1:200 dilution; Thermo Fisher Scientific, MA). Le système coulissant de traitement automatisé Ventana BenchMark XT a été utilisé selon le protocole du fabricant. Un pathologiste expert (KMK) a évalué les résultats

FISH pour

FISH de HER2 a été réalisée en utilisant des sondes spécifiques de l'ADN double-couleur de PathVision ™ (Abbott /Vysis:. LSI HER2 SpectrumOrange ™ et le SCEP 17 SpectrumGreen ™) comme décrit précédemment dans les cas avec équivoques surexpression de HER2. [19] Nous avons compté les signaux d'hybridation dans 20 noyaux par échantillon sous un microscope à fluorescence (Zeiss Axioskop) en utilisant des jeux de filtres recommandés par Vysis (DAPI /Spectrum orange à double bande passante, DAPI /Spectrum Vert double bande passante). Tous les noyaux se chevauchent ont été exclus, et seuls les noyaux avec une frontière distincte nucléaire ont été évalués. gène HER2 de a été considéré comme amplifié lorsque le rapport signal FISH de HER2 /CEP17
était supérieure ou égale à 2,0 [20].

PCR en temps réel pour KRAS et amplification MET

Nous avons utilisé des ADN obtenus à partir de tissus gastriques tumorales de carcinome FFPE. Le mélange réactionnel contenait 2 uL matrice d'ADN génomique, 10 pi de mélange maître universel TaqMan PCR (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA) et 0,2 uM de chaque amorce. Pour la détection précise des altérations du CN, nous avons analysé trois régions différentes du KRAS
gène: une région dans intron 1 (TaqMan Copy Number Assay Hs06943812_cn), une région dans l'intron 2 (Hs002534878_cn), et une région dans l'exon 6 (Hs02739788_cn). . Pour gène MET de, nous avons utilisé les amorces comme décrit précédemment [21]

Nous avons mesuré copie gain de numéro en utilisant le profil suivant: 2 min à 50 ° C, dénaturation à 95 ° C pendant 10 min, puis 40 cycles de 95 ° C pendant 15 s et 60 ° C pendant 1 min. Nous avons déterminé la quantification relative en utilisant le système de PCR en temps réel rapide 7900 HT en quatre. Un kit d'essai de RNase P (Applied Biosystems) a été utilisé comme témoin. Après amplification, nous avons importé les résultats expérimentaux contenant des valeurs seuil de cycle pour le nombre de copies et le dosage de référence dans le CopyCaller Software (Applied Biosystems) pour le post-PCR analyse des données comme décrit précédemment. [22] Nous avons attribué le statut de gain CN et le nombre de KRAS de les copies en fonction de la concordance des résultats dans au moins deux des trois sondes.

Méthodes d'analyse

Nous avons exclu tous les changements synonymes après un algorithme de mutation d'appel automatisé a été utilisé pour détecter des mutations supposées. appels récurrents à plus de 10 des 89 échantillons ont été considérés comme des faux positifs et ont été exclus. Nous avons utilisé des valeurs de coupure de plus de 6% la fréquence variant et plus de couverture X100 pour détecter les vrais changements mutationnels en conformité avec les études précédentes et notre propre expérience. [9], [10] Nous avons filtré sur les polymorphismes d'un seul nucléotide après examen manuel de chaque polymorphisme dans le catalogue de Somatic Mutations dans le Cancer (COSMIC, http://cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmic) ( Figure 1). Pour les gènes bien connus mutés dans les carcinomes gastriques ( TP53
, APC
, PIK3CA
, STK11
, CDKN2A
, KRAS
, HRAS
, BRAF
et CTNNB1
), un examen manuel des résultats automatisés d'appel a été effectué pour attraper des mutations délétères avec faible ou légèrement fréquence variant.

Résultats

Résultats de la Ion AmpliSeq panneau de cancer

les concentrations des ADN, leur pli de concentration, la couverture moyenne des échantillons, le nombre total de bases, > Q20 bases, lectures, signifient lire la longueur, mappés lectures, le taux sur la cible (%), la profondeur moyenne et l'uniformité des résultats sont décrits dans le tableau S2. Au total, nous avons obtenu 8178 appels de variantes à partir de 89 échantillons, parmi eux 3554 appels étaient des changements non synonymes. Après avoir filtré les appels récurrents, < 6% de la variante allèle fréquence, < couverture 100X et ceux dans la région d'intron, 65 appels de variantes ont été sélectionnés. En outre, nous avons examiné les appels automatisés dans des mutations bien connues telles que BRAF
, KRAS
et PIK3CA
et pourrait sauver deux appels de variantes, qui ont été exclues lors du filtrage procédés. Trente-neuf des 89 échantillons (43,8%) abritaient au moins une mutation (Figure 1). Deux cas ont montré 22 et 5 mutations, respectivement. Le dernier cas nourrissait mutation somatique de MLH1 [missense de mutation dans l'exon 20: c.1147A > G (p.M383 V)] et promoteur de hypermethylation de MLH1 avec des pertes de protéines MLH1 par IHC en utilisant la méthodes décrites précédemment [23], ce qui suggère une tumeur hypermuté. Cependant, bien que les mutations trouvées dans le cas passé ancienne variante fréquence et la couverture coupe offs, ces mutations ne sont pas confirmées par séquençage Sanger, suggérant de faux positifs dans ce cas en raison de la mauvaise qualité de l'ADN. Donc, ce cas a été exclu des analyses finales des résultats. Fréquemment détectés mutations somatiques inclus TP53
(24 cas, 27,0%), APC
(9 cas, 10,1%), PIK3CA
(5 cas, 5,6%), %), (3 cas de KRAS, 3,4%), SMO
(4 cas, 4,5%), STK11
(3 cas, 3,4%), CDKN2A
(3 cas, 3,4%), et SMAD4
(3 cas, 3,4%), comme indiqué dans le tableau 2. le tableau 2 résume également les changements d'acides aminés dans les gènes fréquemment mutés. Nous avons identifié 19 patients (21,3%) avec deux ou mutations somatiques plus uniques et concomitants.

Dans quatre échantillons de cancer gastrique avec des fréquences de mutation connus déterminées par séquençage de l'exome ensemble et confirmés par séquençage Sanger, nous avons identifié des mutations somatiques dans TP53
, ERBB4
et CTNNB1
sans appels de faux positifs dans d'autres gènes (Tableau S3).

Amplification par nCounter et validation par IHC, FISH ou en temps réel
PCR

amplifications de HER2
, CCNE1
, MYC
, KRAS
et EGFR
gènes ont été observés chez 8 (8,9%) 4 (4,5%) 2 (2,2%) 1 (1,1%) et 1 (1,1%) des cas, respectivement (tableau 3). Nous n'avons pas observé l'amplification de MET
, FGFR2
, CDK4
et CDK6 dans aucun des cas. Dans les cas de l'amplification, l'IHC pour HER2, CCNE1 EGFR et a montré une surexpression de protéines dans les cellules tumorales (figure 2A, B et C). Dans un cas avec HER2 2+ par HercepTest, FISH a montré l'amplification hétérogène de gènes (figure 2D)
HER2.

PCR en temps réel pour KRAS
, un cas l'amplification a montré une augmentation des nombres de copies (36, 37 et 49); dans les cas qui étaient négatifs pour KRAS de l'amplification, il n'y avait pas d'augmentation du nombre de copies (de 0,9 à 2,4, la moyenne de 1,4).

Pour gène MET de, nous ne trouvons pas cas positif en raison de leur rareté [21]. Par conséquent, nous avons utilisé plus de dix (cinq chacun amplifié et non amplifié) échantillons de cancer gastrique et MET
amplifié des lignées cellulaires de cancer gastrique (MKN45 et SNU5) avec le nombre de copies connues et l'ARNm revient. CNV détecté par nCounter bien corrélée avec le nombre de copies détectées par PCR (Tableau S4) et ARNm niveaux en temps réel de gène MET de (test de corrélation de Pearson, r = 0,874, p = 0,001). (Figure S2)

Discussion

en utilisant Ion AmpliSeq v2 nous avons constaté que 39 des 89 échantillons d'adénocarcinome gastrique avancé contenaient des mutations somatiques, ce qui démontre que cette plate-forme est facilement applicable dans les échantillons d'archives de tissus FFPE. TP53
a été le plus fréquemment trouvé mutation, suivie par APC
, PIK3CA
et KRAS
. De plus, notre panel CNV personnalisé détecté avec succès les augmentations du CN de HER2
, CCNE1
, MYC
, EGFR
et KRAS
gènes, qui nous a confirmé par IHC et PCR en temps réel

fréquences mutationnelles dans la base de données COSMIC révèlent des similitudes importantes aux données que nous avons obtenu de cette étude:. (32%) de TP53, PIK3CA
(10%), KRAS
(6%), APC
(6%), CTNNB1
(5%), CDKN2A
(5%), FBXW7
(5%), SMO
(4%), ERBB2
(2%) et STK11
(2%). Récentes études de séquençage de l'exome ensemble sur adénocarcinome gastrique ont montré un peu plus hautes fréquences de TP53
(36% et 73%) et PIK3CA
(14% et 20%) des mutations par rapport à nos résultats. [24], [25] Bien que nos fréquences de mutation étaient plus faibles par rapport à Exome résultats de séquençage, il y avait une augmentation significative lorsque basée spectrométrie par rapport à nos données antérieures sur la masse OncoMap v4. [26] Les deux AmpliSeq et OncoMap détecter des mutations dans les régions hotspot, qui expliquent les résultats de mutation moins fréquentes dans certains oncogènes et gènes suppresseurs de tumeur. Figure S1 compare AmpliSeq v2 et OncoMap v4 dans les profils mutationnels détectables. tests de OncoMap précédents dans 237 adénocarcinomes gastriques ont révélé que PIK3CA de les mutations sont fréquentes dans les stades avancés de la maladie (5,1% au stade IV, 6,4% au stade II /III; 2,4% en stade IB). [26] Dans cette étude, nous avons observé trois PIK3CA de les mutations chez les patients de stade III et deux dans la maladie de stade II, l'appui de leur rôle biologique dans la progression tumorale. Nous avons également observé HER2
( ERBB2
) c.2524G > A (V842I) mutation dans un cas de cancer de l'estomac. Dans les études précliniques, les lignées cellulaires hébergeant la mutation V842I étaient résistants au trastuzumab, mais étaient sensibles à l'inhibiteur de HER2 irréversible, nératinib [27].

séquençage à semi-conducteurs a des différences fondamentales dans la détection et la transduction du signal par rapport à la spectrométrie de masse séquençage à base. Au lieu d'utiliser des méthodes optiques pour détecter les changements de nucléotides, la technique à base de semi-conducteur détecte les changements de pH par libération de protons (H ^{+) lorsque les nucléotides intègrent dans le brin d'ADN en croissance. [8] Par conséquent, il existe une réduction significative du coût et du temps nécessaire au traitement des données par rapport à d'autres plates-formes END. Fournir de l'information rapide et précise sur les mutations à faible coût est crucial pour les patients atteints de cancers très agressifs, y compris le cancer gastrique.}

Dans cette étude, nous avons examiné manuellement les appels automatisés dans des mutations bien connus après l'application des valeurs de coupure de fréquence et la couverture, en ajoutant ensuite deux appels à faible variant la couverture. Bien que leurs valeurs de couverture ne sont pas parvenus à nos critères initiaux, leurs fréquences ont dépassé notre premier réglage (6%) et la qualité des données était bonne. Cela souligne l'importance de l'examen manuel après le dépistage automatisé. Les résultats récemment publiés en utilisant AmpliSeq comme plate-forme d'analyse soulignent également la compensation des données de dépistage avec un examen manuel [9], [10].

thérapie ciblée personnalisé pour les cancers avancés repose principalement sur le concept de «dépendance oncogène," dans qui de multiples anomalies génétiques sont accros à un ou quelques gènes pour l'entretien des cellules tumorales et la survie. [28] Un open-label, ToGA international, la phase 3, randomisée et contrôlée (trastuzumab pour le cancer gastrique) essai indiqué que le trastuzumab en association avec la chimiothérapie est une nouvelle option standard pour les patients atteints de cancer avancé de jonction gastrique ou gastro-oesophagien HER2-positif. [29] Un essai préclinique a montré qu'un sous-ensemble des cancers gastriques avec EGFR
ou MET de l'amplification et la surexpression répondent au cétuximab ou MET récepteur tyrosine thérapie d'inhibiteur de kinase. [30] En outre, amplifications de médiateur du cycle cellulaire CCNE1
suggèrent le potentiel d'inhibition thérapeutique de kinases cycline-dépendantes dans les cancers gastriques. [31] Le dépistage des gènes amplifiés pour la thérapie ciblée avec la technologie à haut débit est très important. Les méthodes traditionnelles telles que FISH et hybridation génomique comparative souffrent d'une faible résolution de régions génomiques, le coût élevé et sont Labor- et de longue haleine. [32] Dans cette première étude sur nCounter CNV analyses, nous avons constaté que cette technologie est applicable dans des échantillons cliniques FFPE et nous avons validé les résultats par IHC, FISH et PCR en temps réel. Bien que nous ne validons tous les gènes utilisés dans les amorces personnalisées, des résultats de validation dans plusieurs gènes sélectionnés ont été remarquables.

En résumé, nous avons réalisé avec succès le séquençage à base de semi-conducteurs et nCounter CNV analyses dans des échantillons de tissu FFPE de 89 gastrique adénocarcinomes. séquençage à haut débit et de criblage CNV dans des échantillons cliniques d'archives permet plus rapide de détection, plus précis et rentable des mutations hotspot et CNV dans les gènes. Dans l'ère de la médecine génomique personnalisée, nous prévoyons d'utiliser ces outils pour dépister les patients atteints de cancer gastrique qui pourraient bénéficier de thérapies ciblées.

Informations complémentaires
Figure S1. Comparaison de la couverture du panneau de cancer Ion AmpliSeq de contre Oncomap v4
doi:. 10.1371 /journal.pone.0111693.s001
(TIF)
Figure S2.
Parcelles de corrélation entre MET
CNV détectés par les niveaux de MET de gène par PCR en temps réel
doi NCounter et ARNm:. 10.1371 /journal.pone.0111693.s002
(TIF)
Tableau S1. The List Gene pour le Cancer Panel Ion Torrent AmpliSeq
doi:. 10.1371 /journal.pone.0111693.s003
(XLS)
Tableau S2.
Les concentrations des ADN, leur pli de concentration, la couverture moyenne des échantillons, le nombre total de bases, > bases Q20, lectures, signifient lire la longueur, mappé lit, sur taux cible (%), la profondeur moyenne et de l'uniformité.
doi: 10.1371 /journal.pone.0111693.s004
(XLS)
Tableau S3.
mutations somatiques dans TP53
, ERBB4
et CTNNB1
doi:. 10.1371 /journal.pone.0111693.s005
(XLS)
Tableau S4. 10.1371 /journal.pone.0111693.s006
(XLSX)
: bien
doi
CNV détecté par nCounter en corrélation avec le nombre de copies détectées par PCR de temps réel.

• PLOS ONE: Est précoce alimentation orale après chirurgie du cancer gastrique Faisable? Une revue systématique et méta-analyse des essais contrôlés randomisés
• PLOS ONE: Comparaison des résultats opératoires et courbes d'apprentissage entre laparoscopique et robotique gastrectomie pour cancer gastrique