PLoS ONE: High-секвенирования и Copy Number Variation Обнаружение Использование Фиксированные в формалине ткани Встроенный в метастатической Желудочный Cancer

Абстрактный
<р> В эпоху таргетной терапии, мутации профилирование рака является одним из важнейших аспектов принятия терапевтических решений , Для того, чтобы охарактеризовать рак на молекулярном уровне, использование фиксированных формалином в парафин ткани имеет важное значение. Мы тестировали v2 Panel Ion AmpliSeq Рак Hotspot и nCounter Copy Number Variation Пробирной в 89 фиксированных формалином погруженных в парафин образцов желудочного рака, чтобы определить, являются ли они применимы в архивных клинических образцов для персонализированных целенаправленной терапии. Мы подтвердила результаты с Sanger секвенирования, в реальном масштабе времени количественной ПЦР, флуоресценция гибридизация и иммуногистохимии. Часто обнаружены соматические мутации включены TP53
(28,17%), APC
(10,1%), PIK3CA
(5,6%), KRAS
(4.5 %), SMO
(3,4%), STK11
(3,4%), CDKN2A
(3,4%) и SMAD4
(3,4%) , Усилений HER2
, CCNE1
, MYC
, KRAS
и EGFR
генов наблюдались у 8 (8,9%) , 4 (4,5%), 2 (2,2%), 1 (1,1%) и 1 (1,1%) случаев соответственно. В случаях с усилением, флуоресцентная гибридизация для в файле Her2
проверена амплификации гена и иммуногистохимии для HER2, EGFR и CCNE1 проверили избыточную экспрессию белков в опухолевых клетках. В заключение, мы успешно выполнены на основе полупроводников последовательности и вариации nCounter количества копий анализы в фиксированных формалином погруженных в парафин образцах рака желудка. Высокопроизводительный скрининг в архивных клинических образцах позволяет быстрее, более точные и экономически эффективное обнаружение горячих точек мутации или амплификации генов в
<р> Образец цитирования:. Ким S, Ли J, Hong ME, Do И.Г., Кан SY, ха SY и др. (2014) High-секвенирования и Copy Number Variation Обнаружение Использование Фиксированные в формалине Embedded ткани в метастатического рака желудка. PLoS ONE 9 (11): e111693. DOI: 10.1371 /journal.pone.0111693
<р> Редактор: Хирому Suzuki, Саппоро медицинский университет, Япония
<р> Поступило: 28 апреля 2014 года; Принято 29 сентября, 2014 года; Опубликовано: 5 ноября 2014
<р> Copyright: © 2014 Ким и др. Это статья с открытым доступом распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник приписывают наличие
<р> Data:. авторы подтверждают, что все данные, лежащие в основе выводы полностью доступны без ограничений. Все соответствующие данные находятся в пределах своих подтверждающей информации, файлов бумаги и
<р> Финансирование:. Это исследование было поддержано грантом от Korea Healthcare Technology R &Amp; D проекта, Министерство здравоохранения и усилителя; Дела благосостояния, Республика Корея (A101130) и грант Samsung Biomedical Research Institute (# SBRI-SP1B20112). Это исследование было также поддержана очный гранта медицинский центр Samsung, 20 х 20 проекта (# GFO1140111). Соавторы Seokhwi Ким, Jeeyun Ли, Мин Eui Хонг, In-Gu Do, So Young Kang, Санг Юн Ха, Сунг Тэ Ким, Се Хун Парк Вон Ки Кан Мин-GEW Чой Джун Хо Ли, Tae Sung Sohn Чжэ Мун Bae, Сунг Ким и Kyoung-Мей Ким работают на Samsung Medical Center. Соавтор Дук-Хван Ким является сотрудником Научно-исследовательского института медико-биологических Samsung. Научно-исследовательский институт Samsung Биомедицинские и Samsung медицинский центр оказывал поддержку в виде заработной платы для авторов Seokhwi Ким, JL, Мех, IgD, Syk, ЛМО, STK, SHP, WKK, MGC, лдх, УТП, JMB, Сунг Ким, КМК и DHK , но не было никакой дополнительной роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи. Конкретные роли этих авторов сформулированы в разделе «взносов автора»
<р> Конкурирующие интересы:. Авторы имеют следующие интересы: Это исследование было частично финансировался научно-исследовательским институтом Samsung биомедицинской и Samsung Medical Center. Соавторы Seokhwi Ким, Jeeyun Ли, Мин Eui Хонг, In-Gu Do, So Young Kang, Санг Юн Ха, Сунг Тэ Ким, Се Хун Парк Вон Ки Кан Мин-GEW Чой Джун Хо Ли, Tae Sung Sohn Чжэ Мун Bae, Сунг Ким и Kyoung-Мей Ким работают на Samsung Medical Center. Соавтор Дук-Хван Ким является сотрудником Научно-исследовательского института медико-биологических Samsung. Там нет патентов, продукты в разработке или реализуемой продукции, чтобы объявить. Это не меняет приверженность авторов на всех политик PLoS ONE на данных и материалов общего доступа.

Введение
<р> В то время как рак желудка является четвертым наиболее распространенным видом рака в мире, это второй ведущей причиной смерти. [1] Его частота значительно выше в азиатских странах, включая Корею, где он является вторым наиболее распространенным видом рака. [2] В последнее время несколько целевых лекарственными средствами для лечения рака желудка были обнаружены, которые предоставляют дополнительные возможности для врачей и пациентов [3] - [5]
<р> В эпоху таргетной терапии, мутации профилирования рака причинного. имеет решающее значение для принятия терапевтических решений. Попытки к профилю мутации были сделаны с использованием традиционных Sanger секвенирования; Тем не менее, это не является оптимальным способом в клинических условиях из-за стоимости, времени и труда, необходимого. Кроме того, метод сэнгера требует значительных количеств ДНК; оценки небольших количеств образца в течение нескольких генов, в то же время не представляется возможным. Внедрение следующего поколения секвенирования методов (NGS) решил эту проблему путем мультиплекс, высокой пропускной последовательности многих образцов для нескольких генов одновременно. [6], [7] Одна из платформ NGS, Ион Торрент AmpliSeq Рак Группа, опирается на не-оптического детектирования ионов водорода в полупроводниковом устройстве, [8] и способен обнаружить 2,855 онкогенные мутации в 50 обычно мутировавших генов (Таблица S1). Он превосходит другие методы секвенирования масс-спектроскопии на основе, обеспечивая последовательность результатов быстрее и с меньшими затратами. [8] Он применим в фиксированных формалином погруженных в парафин образцов (FFPE) ткани с небольшими количествами ДНК. Потому что это обеспечивает высокую чувствительность при скрининговых известно онкогенных мутаций, [9], [10] Ion Torrent AmpliSeq Рак Группа является выбор из 5 крупных онкологических центров в Соединенных Штатах для молекулярной диагностики в целенаправленной терапии [11].
<р> амплификация онкогенов является основным механизмом для генной избыточной экспрессии и способствует развитию опухоли. [12] Примеры включают усиление HER2
, MET
, FGFR2
и Крас
гены рака желудка. [13], [14] В обнаружении вариаций числа копий (ВКК) в клинических образцах, флуоресцентная гибридизация (FISH) и /или иммуногистохимических (IHC) широко используется. Тем не менее, высокая стоимость и небольшие размеры выборки биопсии материалов ограничивают применение этих методов, и по-прежнему существует необходимость в дальнейшей технологии с высокой пропускной способностью с легкой доступностью, высокой чувствительностью и низкими затратами. nCounter CNV кодировок (технологии Nanostring, Life Sciences, Seattle, WA) обеспечивают превосходную точность и воспроизводимость для изучения всех размеров и производить лучшие, более быстрые результаты с существенно меньшими затратами, чем в режиме реального времени количественной полимеразной цепной реакции (КПЦР) или CNV массивов [ ,,,0],15].
<р> Лучше сшитый лечение рака может улучшить исход пациента. Пациент образцы опухоли будут необходимы для того, чтобы охарактеризовать рак на молекулярном уровне и выявить заболевание подгруппы, которые должны получать различные виды лечения. Использование FFPE ткани имеет важное значение для обеспечения таких исследований. [16] Здесь мы тестировали AmpliSeq и nCounter пользовательских Cnv панелей в FFPE образцах рака желудка, чтобы определить, если они применимы в архивных клинических образцов для персонализированного целенаправленной терапии.

Материалы и методы

Образцы <бр> <р> опухолевой клетки процент с более чем 75% рассекали под микроскопом из неокрашенных участков 4 мм по сравнению с H &Amp; E окрашивали слайд, и геномную ДНК экстрагировали с использованием Tissue Kit Qiagen ДНК FFPE (Qiagen, Hilden, Германия) в соответствии с инструкциями завода-изготовителя из 96 пациентов с распространенным раком желудка. После экстракции, мы измеряли концентрацию, а также соотношение 260/280 и 260/230 нм с помощью спектрофотометра (ND1000, NanoDrop Technologies, ThermoFisher Scientific, MA, USA). Каждый образец затем количественно с Кубит флуорометре (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния). Геномную ДНК с > 10 нг измеряется кубита флуорометре подвергали подготовке библиотеки и семь образцов не удалось построить библиотеки и были исключены из этого исследования. И, наконец, 89 случаев были окончательно проанализированы и включал в себя 31 женщину и 58 пациентов мужского пола. В таблице 1 перечислены клинические и патологические особенности пациентов в данном исследовании. Рецидив или метастазирование разработаны у 11 пациентов с медианным периода наблюдения 76 месяцев (диапазон 5.5-149.3). Исследование было одобрено этическими комитетами (IRB) в Samsung Medical Center. Все клиническое исследование было проведено в соответствии с принципами, выраженными в Хельсинкской декларации. Письменное информированное согласие было снято IRB в результате ретроспективного анализа и анонимных данных. Образцы были собраны в рамках обычной медицинской процедуры и были собраны авторами для данного исследования. Образцы, взятые у пациентов, умерших или живых пациентов были обезличенной, включая удаление любых и всех демографических данных, до анализа и формы информированного согласия было снято IRB.

Ion AmpliSeq панель рак v2
<р> Мы использовали Ion AmpliSeq Cancer Panel v2 (Ion Torrent), чтобы обнаружить частые соматические мутации, которые были отобраны на основе обзора литературы. В нем рассматриваются 2855 мутации в 50 обычно мутировавших онкогенов и генов-супрессоров опухолей (таблица S1). Во-первых, 10 нг ДНК из каждого из 89 образцов опухолей FFPE прошли в одной пробирке, мультиплекс ПЦР-амплификации с использованием праймера Ion AmpliSeqCancer пула и реагенты Ion AmpliSeqKit (Life Technologies). Обработка полученного ампликонов с Fupa Реагент частично переваривают праймеры и фосфорилируется ампликонов. Фосфорилированные ампликонов лигировали с ионными адаптерами и очищают. Для Barcoded подготовки библиотеки, мы заменили Barcoded адаптеры от 1-96 Kit Ion Xpress Штрих-адаптеры для не-Barcoded адаптера смеси, поставляемой в комплекте Ion AmpliSeq Library. Сшита ДНК подвергся ник-трансляции и усиления для завершения связи между адаптерами и ампликонов и генерировать достаточное количество материала для подготовки вниз по течению шаблона. Два раунда Ажанкур AMPure XP Реагент связывания на 0,6 и 1,2 объемных соотношениях шарик к образцу ДНК удаляется входной и некорпоративные праймеров из ампликонов. Конечные молекулы библиотеки были 125~300 п.о.. Затем мы передали библиотеки в системе OneTouch Ion для автоматизированной подготовки шаблона. Секвенирование проводили на секвенсор Ion PGM в соответствии с инструкциями изготовителя. Мы использовали IonTorrent Программное обеспечение для анализа данных автоматизированной.
<Р> Для измерения чувствительности и специфичности панели рака Ion AmpliSeq, использовались целые результаты секвенирование экзома из 4 образцов желудочного рака с известным статусом мутации [17].

nCounter Copy Number Variation кодировок
<р> Для обнаружения CNV, nCounter Copy Number Variation кодировок были использованы с 300 нг очищенной геномной ДНК, выделенной из 2-3 секций 4 мкм толщиной FFPE представитель опухолевых блоков с использованием QIAamp ДНК FFPE ткани (Qiagen, Hilden, Germany). ДНК была фрагментирована с помощью AluI пищеварения и денатурировали при 95 ° С. Фрагментированной ДНК гибридизовали с Codeset 86 генов в nCounter рака CN Пробирной Kit (Nanostring Technologies) в течение 18 часов при температуре 65 ° C и обрабатывается в соответствии с инструкциями изготовителя. Цифровой анализатор nCounter подсчитаны и сведены в таблицу сигналов репортер зондов и среднего числа количества в &ГТ; 3 были названы и подтверждены IHC, FISH или ПЦР в реальном времени

IHC для HER2, EGFR (HER1) и CCNE1.
<р> для подтверждения результатов, полученных из CNV nCounter, мы выполнили IHC для HER2 во всех случаях, и EGFR и CCNE1 в отдельных случаях. После депарафинизации и повторной гидратации, 4 мм секции на слайдах силана покрытием были иммуноокрашиванию для HER2. HercepTest (Dako, Glostrup, Дания) была использована в соответствии с указаниями изготовителя, как описано выше. [18] Для EGFR мы использовали анти-NCL-L-EGFR-384 Мышиные моноклональные первичные антитела (1:100 разведении; Novocastra /Vision Biosystems, Ньюкасл, Великобритания) и CCNE1 мы использовали анти-CCNE1 /циклин E1-антителом (клон HE12; 1:200 разведение, Thermo Fisher Scientific, MA). Автоматизированная система обработки слайдов Вентана BenchMark XT был использован в соответствии с протоколом производителя. Эксперт патологоанатом (КМК) оценили результаты

FISH для Her2
<р> FISH проводили с использованием двухцветных ДНК-специфических зондов из PathVision ™ (Abbott /Vysis:. LSI HER2 SpectrumOrange ™ и КООС 17 SpectrumGreen ™), как описано выше в тех случаях, неоднозначные гиперэкспрессией HER2. [19] Мы рассчитывали гибридизация сигналы в 20 ядер в образце под флуоресцентным микроскопом (Zeiss Axioskop) с использованием наборов фильтров, рекомендованные Vysis (DAPI /Spectrum Orange двойной полосовой, DAPI /Spectrum Зеленый двойной полосовой). Все перекрывающие ядра были исключены, и только ядра с отдельной ядерной границы были оценены. против HER2
ген был рассмотрен усиливается, когда отношение FISH сигнала HER2 /CEP17
был больше или равен 2,0 [20].

ПЦР в реальном времени для KRAS и MET усиление
<р> Мы использовали ДНК, полученные из FFPE желудка опухолевых тканей карциномы. Реакционная смесь содержала 2 мкл шаблон геномной ДНК, 10 мкл основной смеси Taqman универсальный PCR (Applied Biosystems Inc, Foster City, CA) и 0,2 мкМ каждого праймера. Для точного обнаружения КН изменений, мы проанализировали три различные области Крас
гена: область в пределах интрона 1 (TaqMan Copy Number пробирной Hs06943812_cn), область в пределах интрона 2 (Hs002534878_cn) и область в пределах экзона 6 (Hs02739788_cn). . Для Met
гена, мы использовали праймеры, как описано ранее [21]
<р> Мы измерили коэффициент усиления число копий, используя следующий профиль: 2 мин при 50 ° C, денатурацию при 95 ° С в течение 10 мин, затем 40 циклов при 95 ° с в течение 15 с и 60 ° с в течение 1 мин. Мы определили относительную количественную оценку с использованием 7900 HT быстро в режиме реального времени система ПЦР в четырех экземплярах. RNaseP набора для анализа (Applied Biosystems), использовали в качестве контроля. После амплификации мы импортирован результаты эксперимента, содержащих значения порогового цикла для числа копий и эталонного анализа в CopyCaller программного обеспечения (Applied Biosystems) для последующей ПЦР-анализа данных, как описано выше. [22] Мы присвоили статус усиления CN и количество Крас
копии, основанные на согласовании результатов, по меньшей мере, двух из трех зондов.

Аналитические методы
<р> Мы исключили все синонимичные изменения после того, как автоматизированный алгоритм мутации вызова был использован для обнаружения мутаций предполагалось. Повторные звонки в более чем 10 из 89 образцов были расценены как ложный положительный результат и были исключены. Мы использовали значения отсечку более чем на 6% варианта частоты и более охвата X100 для выявления истинных мутационные изменения в соответствии с предыдущими исследованиями и нашего собственного опыта. [9], [10] Мы отфильтровываются однонуклеотидных полиморфизмов после ручной проверки каждого полиморфизма в Каталоге соматических мутаций в Раке (КОСМИК, http://cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmic~~HEAD=pobj) ( Рисунок 1). Для хорошо известных генов, мутировавших в желудочных карцином ( TP53
, APC
, PIK3CA
, STK11
, CDKN2A
, KRAS
, HRAS
, BRAF
и CTNNB1
), ручной обзор автоматизированных призывающих результатов было проведено с целью поймать вредных мутаций с немного низким вариант частоты.

Результаты

Результаты Ion AmpliSeq панели рака
<р> концентрации ДНК, их концентрация раза, средний охват образцов, общее число оснований, и GT; Q20 основы, читает, значит прочитать длину, сопоставляются чтений, на целевой показатель (%), средняя глубина и однородность результатов описаны в таблице S2. В общей сложности мы получили 8178 вариантные вызовов из 89 образцов, из них 3554 были звонки, не синонимичные изменения. После фильтрации повторяющихся вызовов, &Лт; 6% от варианта-аллель частоты, и ЛТ; охват 100X и те в области интрона, были выбраны 65 вариант вызовов. Кроме того, мы рассмотрели автоматизированные звонки в хорошо известных мутаций, таких как BRAF
, KRAS
и PIK3CA
и может сохранить два вариантных вызовов, которые были исключены во время фильтрации процессы. Тридцать девять из 89 образцов (43,8%) питали по меньшей мере, одну мутацию (рисунок 1). Два случая показали 22 и 5 мутации, соответственно. В последнем случае укрывал MLH1
соматической мутации [миссенс мутации в экзоне 20: c.1147A ≫ G (p.M383 V)] и MLH1
промотор гиперметилирование с потерями белка MLH1 по IHC, используя описанные выше методы, [23] указывает hypermutated опухоль. Однако, несмотря на мутации, обнаруженные в первом случае передается вариант частоты и охвата сократить офф, эти мутации не были подтверждены Sanger секвенирования, предлагая ложный положительный результат в этом случае из-за плохого качества ДНК. Таким образом, этот случай был исключен из окончательных анализов результатов. Часто обнаружены соматические мутации включены TP53
(24 случаев, 27,0%), APC
(9 случаев, 10,1%), PIK3CA
(5 случаев, 5,6%), %), Крас
(3 случая, 3,4%), SMO
(4 случая, 4,5%), STK11
(3 случая, 3,4%), CDKN2A
(3 случая, 3,4%), и SMAD4
(3 случая, 3,4%), как показано в таблице 2. в таблице 2 также приведены изменения аминокислот в часто мутировавших генов. Мы выявили 19 пациентов (21,3%) с двумя или более уникальных и сопутствующих соматических мутаций.
<Р> В четырех образцах рака желудка с известными частотами мутаций, определяемых всей ExoME секвенирования и подтверждается Sanger секвенирования, мы определили соматические мутации в TP53
, ERBB4
и CTNNB1
без ложных-положительных вызовов в других генах (таблица S3).

Amplification с помощью nCounter и проверки компанией IHC, FISH или ПЦР в реальном времени
<р> усилений HER2
, CCNE1
, MYC
, KRAS
и EGFR
гены были обнаружены у 8 (8,9%), 4 (4,5%), 2 (2,2%), 1 (1,1%) и 1 (1,1%) случаях соответственно (таблица 3). Мы не наблюдали усиление MET
, FGFR2
, CDK4
и CDK6 ни в одном из случаев. В тех случаях, с усилением, ВВК для HER2, EGFR и CCNE1 показали избыточную экспрессию белков в опухолевых клетках (Фигура 2А, В и С). В одном случае с HER2 2+ HercepTest, FISH показали неоднородную усиление Her2
генов (рис 2D).

В ПЦР в реальном времени для KRAS
один случай с усилением показали увеличение числа копий (36, 37 и 49); в тех случаях, которые были отрицательными для Крас
усиление, не было увеличение числа копий (от 0,9 до 2,4, средний 1.4).
<р> Для Met
гена, мы находим нет положительный случай из-за их редкости [21]. Поэтому мы использовали дополнительные десять (пять каждый усиливается и без усиления) образцов рака желудка и MET
усиливается желудка линий раковых клеток (MKN45 и SNU5) с известными числа копий мРНК и составляет. ВКК обнаружены nCounter хорошо коррелирует с числом копий, обнаруженных ПЦР в реальном времени (таблица S4), и уровни мРНК
генов встречались (корреляции Пирсона; г = 0,874, р = 0,001). (Рисунок S2)

Обсуждение
<р> с помощью Ion AmpliSeq v2 мы обнаружили, что 39 из 89 передовых образцов аденокарциномы желудка содержали соматические мутации, демонстрируя, что эта платформа легко применима в архивных образцах FFPE ткани. TP53
был наиболее часто встречаются мутации, а затем APC
, PIK3CA
и KRAS
. Кроме того, наш обычай ХНОП панель успешно обнаружен CN увеличивается на HER2
, CCNE1
, MYC
, EGFR
и KRAS
гены, которые мы подтвержденные IHC и ПЦР в реальном времени
<р> Мутационные частоты в базе данных КОСМИЧЕСКОГО выявить существенные общие черты полученные нами данные из этого исследования:. TP53
(32%), PIK3CA
(10%), KRAS
(6%), APC
(6%), CTNNB1
(5%), CDKN2A
(5%), FBXW7
(5%), SMO
(4%), ERBB2
(2%) и STK11
(2%). Недавние исследования в целом секвенирование экзома на аденокарциномы желудка показали несколько более высокие частоты ТР53
(36% и 73%) и PIK3CA
(14% и 20%) мутации по сравнению с нашими результатами. [24], [25] Хотя наши частоты мутаций были ниже по сравнению с ExoME результатами секвенирования, наблюдалось значительное увеличение по сравнению с нашими предыдущими данными по масс-спектрометрии на основе OncoMap v4. [26] Оба AmpliSeq и OncoMap обнаружить мутации в горячих точках регионов, объясняющих результаты менее частой мутации в некоторых онкогенов и генов-супрессоров опухолей. Рисунок S1 сравнивает AmpliSeq v2 и v4 OncoMap в детектируемых мутационных профилей. Предыдущие испытания OncoMap в 237 желудочных аденокарцином показал, что PIK3CA
мутации были частыми в поздних стадиях заболевания (5,1% в IV стадии; 6,4% в II стадии /III; 2,4% в стадии IB). [26] В этом исследовании мы наблюдали три PIK3CA
мутации у больных с двумя стадии III и в стадии заболевания II, поддерживая их биологическую роль в опухолевой прогрессии. Мы также наблюдали HER2
( ERBB2
) c.2524G > A (V842I) мутация в случае рака желудка. В доклинических исследованиях, клеточные линии, несущие мутации V842I были устойчивы к трастузумаб, но были чувствительны к необратимым ингибитором HER2, neratinib [27].
<Р> на основе полупроводников секвенирование имеет принципиальные различия в зондированию и передаче сигнала по сравнению с масс-спектрометрии основанное секвенирования. Вместо того, чтобы с помощью оптических методов для выявления нуклеотидных замен, метод на базе полупроводников обнаруживает изменения рН путем высвобождения протонов (H ^{+), когда нуклеотиды интегрироваться в растущую цепь ДНК. [8] Таким образом, существует значительное снижение стоимости и время, необходимое для обработки данных по сравнению с другими платформами NGS. Обеспечение быстрой и точной информации о мутациях при низкой стоимости имеет решающее значение для пациентов с очень агрессивных видов рака, включая рак желудка.
<Р> В этом исследовании мы рассмотрели вручную автоматизированные вызовы в хорошо известных мутаций после применения значений частоты отсечку и покрытие, последующее добавление двух вызовов с низким уровнем охвата варианта. Хотя их значения охвата не доходили наши первоначальные критерии, их частоты превысила наш первый параметр (6%) и качество данных было хорошим. Это подчеркивает важность ручной проверки после автоматизированного скрининга. Недавно опубликованные результаты, используя AmpliSeq в качестве платформы анализа особенностей подчеркивают также компенсации скрининговых данных с ручной обзор [9], [10].
<Р> Персонализированные таргетной терапии для поздних стадий рака в первую очередь зависит от концепции "онкогенов наркомании" в которой множественные генетические аномалии зависимы от одного или нескольких генов для поддержания и выживания опухолевых клеток. [28] Открытая этикетки, международная, фаза 3, рандомизированное контролируемое ToGA (трастузумаб для рака желудка) испытания указывают на то, что трастузумаб в комбинации с химиотерапией является новым стандартом вариантом для пациентов с HER2-положительным расширенному желудка или желудочно-пищеводного рака соединения. [29] Доклинические исследование показало, что подмножество рака желудка с EGFR
или Met
усиление и избыточная экспрессия реагируют на цетуксимаб или MET-рецептора тирозин-киназы терапии. [30] Кроме того, амплификация клеточного цикла медиатора CCNE1
предполагают потенциал для терапевтического ингибирования циклин-зависимых киназ в рака желудка. [31] Скрининг амплифицированные гены для целенаправленной терапии с высокой пропускной способностью технологии является очень важным. Традиционные методы, такие как рыба и массив сравнительной геномной гибридизации страдают от низкого разрешения геномных областей, высокая стоимость и трудо- и отнимает много времени. [32] В этом первом исследовании на nCounter CNV анализ, мы обнаружили, что эта технология применима в FFPE клинических образцах и мы подтвердила результаты по IHC, FISH и ПЦР в реальном времени. Несмотря на то, что мы не проверить все гены, используемые в пользовательских праймеров, результаты проверки в нескольких выбранных генов были замечательны.
<Р> Таким образом, мы успешно выполнены на базе полупроводников секвенирование и nCounter ХНОП анализа в образцах тканей FFPE от 89 желудка аденокарциномы. Высокая пропускная способность секвенирования и ХНОП скрининг в архивных клинических образцах позволяет быстрее, более точные и экономически эффективное обнаружение горячих точек мутаций и CNV в генах. В эпоху персонализированной геномной медицины, мы планируем использовать эти инструменты для скрининга больных раком желудка, которые могут принести пользу от целенаправленной терапии.}

Поддержка информации Рисунок S1 изображения.
Сравнение охвата Ion AmpliSeq v2 панели рака по сравнению с Oncomap v4
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0111693.s001
(TIF) Рисунок S2
.
Графики корреляции между Met
CNVs обнаруженные уровни nCounter и мРНК Met
генов с помощью ПЦР в реальном времени
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0111693.s002
(TIF)
таблице S1.
Список Ген панели рака Ion Torrent AmpliSeq
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0111693.s003
(XLS)
Таблица S2.
Концентрации ДНК, их концентрации складки, средний охват образцов, общего числа оснований, и Гт Q20 оснований, читает, значит прочитать длину, сопоставляются читает, на целевой показатель (%), средняя глубина и однородность.
DOI: 10.1371 /journal.pone.0111693.s004
(XLS)
Таблица S3.
соматические мутации в TP53
, ERBB4
и CTNNB1

DOI:. 10,1371 /journal.pone.0111693.s005
(XLS)
Таблица S4.
ВКК обнаружены nCounter хорошо коррелирует с числом копий, обнаруженных ПЦР в реальном времени
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0111693.s006
(XLSX)

• PLoS ONE: Раннее кормление через рот после того, как рак желудка хирургии реализуемое? Систематический обзор и ме…
• PLoS ONE: Сравнение оперативных результатов и обучения кривых между лапароскопической и роботизированной гастр…