PLoS ONE: SIRT3 Migliora glicolisi e la proliferazione di cancro gastrico Cells

Estratto

SIRT3 SIRT3-Esprimendo è una chiave NAD ^{+ - deacetilasi proteina dipendente nei mitocondri delle cellule di mammifero, il funzionamento per prevenire l'invecchiamento delle cellule e la trasformazione attraverso la regolazione di mitocondriale omeostasi metabolica. Tuttavia, SIRT3 si trova anche ad esprimere in alcuni tumori umani; il suo ruolo in queste cellule tumorali Sirt3 esprimono deve essere chiarito. Questo studio ha dimostrato che l'espressione di SIRT3 stata elevata in un gruppo di cellule di cancro gastrico rispetto alle normali cellule epiteliali gastriche. Anche se i livelli di espressione SIRT3 sono stati aumentati nei tessuti tumorali gastrici rispetto ai tessuti non tumorali adiacenti, le cellule tumorali positivo SIRT3 erano più frequentemente rilevata nel tipo intestinale tumori gastrici rispetto al tipo di diffuso tumori gastrici, indicando che SIRT3 è collegato con sottotipi di gastrico cancro. Sovraespressione di SIRT3 promosso la proliferazione cellulare e una maggiore produzione di ATP, l'assorbimento del glucosio, la formazione di glicogeno, l'attività MnSOD e produzione di lattato, che sono stati inibita da SIRT3 atterramento, indicando che SIRT3 svolge un ruolo nella riprogrammazione delle bioenergetica nelle cellule tumorali gastriche. Ulteriori analisi hanno rivelato che SIRT3 e interagito con deacetilata il lattato deidrogenasi A (LDHA), una proteina chiave nella regolazione della glicolisi anaerobica, migliorando l'attività LDHA. In consistenza, un cluster di geni glicolisi-associato è stato upregulated nelle cellule tumorali gastriche SIRT3-iperespressione. Così, oltre alla omeostasi mitocondriale SIRT3 mediata ben documentata in cellule normali, SIRT3 può aumentare la glicolisi e la proliferazione cellulare nelle cellule tumorali che esprimono Sirt3}

Visto:. Cui Y, Qin L, Wu J, Qu X, Hou C, Sun W, et al. (2015) SIRT3 Migliora glicolisi e la proliferazione di cellule cancro gastrico SIRT3-Esprimendo. PLoS ONE 10 (6): e0129834. doi: 10.1371 /journal.pone.0129834

Editor: Xianglin Shi, Università del Kentucky, Stati Uniti |

Ricevuto: April 16, 2015; Accettato: May 13, 2015; Pubblicato: 29 giu 2015

Copyright: © 2015 Cui et al. Questo è un articolo ad accesso libero distribuito sotto i termini della Creative Commons Attribution License, che permette l'uso senza restrizioni, la distribuzione e la riproduzione con qualsiasi mezzo, a condizione che l'autore originale e la fonte sono accreditati

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Finanziamento:. Questo studio è stato in parte sostenuto dalla National Science Foundation naturale della Cina, programma chiave (30.930.105), piano di progetto 12-5 Supporto nazionale del Ministero della Scienza e Tecnologia della Cina (2012BAH30F03), la National Science Foundation naturale della Cina (31.070.740), il 985 e 211 progetti di Xi'an Jiaotong University (JKL), e il National Cancer Institute RO1 concessione CA152313-01-A1 (JJL).

Competere interessi:. Gli autori hanno dichiarato che non esistono interessi in competizione

Introduzione

sirtuine, una famiglia di NAD ^{+ - istone deacetilasi dipendenti (HDAC) a mammiferi le cellule, sono implicati in una vasta gamma di processi fisici, tra cui la sopravvivenza cellulare, apoptosi, il metabolismo, risposte allo stress, l'invecchiamento e la longevità [1,2]. Tra sette membri sirtuin (SIRT1-7), SIRT3 è il miglior sirtuin mitocondriale caratterizzato, funzionamento regolare proteine ​​mitocondriali coinvolte nella fosforilazione ossidativa, l'ossidazione degli acidi grassi, il ciclo dell'urea, e la risposta antiossidante [2-9]. Diversi studi hanno messo in evidenza il ruolo di SIRT3 nel metabolismo e l'omeostasi nelle cellule normali e ha rivelato nuovi obiettivi e substrati per deacetilazione SIRT3-dipendente [10]. Kim et al ha riferito che SIRT3 è una proteina mitocondriale chiave, e la mancanza di espressione SIRT3 è legata alla maggiore danno mitocondriale del DNA e l'invecchiamento, così come una maggiore capacità di trasformazione cellulare Ras indotta e l'attivazione MnSOD SIRT3 mediata contribuire alla omeostasi mitocondriale [11,12]. A sostegno, embrionali renali 293 cellule umane (HEK293), le cellule mostrano l'espressione SIRT3 maggiore in condizioni di stress ossidativo, che porta a deacetilazione e l'attivazione di MnSOD [13]. SIRT3 si crede di funzionare come un gene soppressore del tumore e svolge un ruolo fondamentale nel migliorare l'omeostasi cellulare contro l'invecchiamento e carcinogenesi.}

Tuttavia, alcune cellule tumorali mostrano l'espressione di SIRT3 e il ruolo potenziale di SIRT3 in queste cellule tumorali , in particolare il suo potenziale relazione al fenotipo aggressivo, è stato controverso [14]. espressione SIRT3 è più bassa o non rilevabile in una vasta gamma di tumori umani, tra cui il cancro al seno, il glioblastoma, il tumore del colon, e osteosarcoma, della prostata e tumori ovarici [11,15,16]. SIRT3 induce arresto della crescita ed apoptosi mediante silenziamento selettivo di Bcl-2 nelle cellule HCT116 attraverso la modulazione JNK2 percorso di segnalazione [17]. Inoltre, SIRT3 è segnalato per contribuire a una maggiore sensibilità delle cellule di leucemia umana a chemioterapia, eventualmente attraverso l'induzione di apoptosi mitocondri-mediata [18]. D'altra parte, l'espressione SIRT3 si trova anche essere aumentata nel cancro orale, cancro al seno con linfonodi positivi, il cancro esofageo, e carcinomi della tiroide; e l'aumento SIRT3 è associata con una maggiore fenotipo maligno e down-regulation di SIRT3 migliora la sensibilità del tumore alla terapia anti-cancro [19-23]. Questi risultati segnalano un ruolo diverso di SIRT3 nei tumori specifici che devono essere chiariti.

Le cellule tumorali sono metabolicamente attive e consumano più carburante cellulare delle cellule normali. Tuttavia le cellule tumorali relè sulla principalmente sulla sintesi di ATP da glicolisi aerobica, una caratteristica nota come effetto Warburg [24]. Tale glicolisi aerobica è creduto per proteggere le cellule tumorali formano lo stress ossidativo in quanto la respirazione mitocondriale è la principale fonte di ROS intracellulari [25]. Il lattato deidrogenasi A (LDHA) è un enzima che controlla interconversione fra piruvato e L-lattato reversibilmente alla fase finale della glicolisi anaerobica [26]. L'inibizione della LDHA diminuisce il potenziale oncogeno con un aumento del consumo di ossigeno mitocondriale e diminuita potenziale di membrana mitocondriale [26] e la produzione di ATP cellulare complessiva e glicolisi [27].

In questo studio, abbiamo studiato il ruolo potenziale di SIRT3 in gastrica le cellule tumorali che esprimono SIRT3. L'espressione di SIRT3 è stato collegato con la crescita aggressiva, che è stato mediato attraverso SIRT3-deacetilata e attivato LDHA, migliorando la glicolisi e l'espressione di un gruppo di geni glicolisi-associata. metabolismo glicolisi Così SIRT3-LDHA mediata può essere un potenziale bersaglio terapeutico per il trattamento di cellule tumorali che esprimono SIRT3.

Materiali e Metodi

linee cellulari e cultura

umana cancro gastrico linee cellulari MGC-803, HGC-27, SGC-7901 [28] e AGS [29] e immortalata linea di cellule epiteliali gastriche umane GES-1 [30] sono stati mantenuti in terreno RPMI-1640 (Invitrogen) supplementato con 10% fetale bovino siero e 1% di penicillina /streptomicina, e coltivate a 37 ° C in atmosfera di 5% CO2.

immunoprecipitazione e western blot
celle

subconfluenti state lisate e lisati sono stati incubati con proteina a /G perline agarosio più la quantità raccomandata di anticorpi contro entrambi SIRT3 (Cell Signaling Technology) o LDHA (Santa Cruze) a 4 ° C durante la notte. I campioni sono stati centrifugati e separati da SDS gel di poliacrilammide e electroblotted su membrane di nitrocellulosa. Dopo aver bloccato con 5% latte scremato in TBST, membrane sono state incubate con l'anticorpo primario a 4 ° C per una notte seguita da incubazione con anticorpo secondario per 1 ora a RT. Le proteine ​​di interesse sono stati visualizzati da kit di rilevamento ECL (Thermo Fisher).

L'immunoistochimica test

diapositive patologiche di cancro gastrico con i tessuti normali adiacenti sono stati analizzati mediante test di immunoistochimica sono stati effettuati seguendo le istruzioni del produttore. Il kit Polymer Detection per l'analisi immunoistochimica è stato acquistato da Zhongshan Golden Bridge Biotechnology. Brevemente, sezioni di paraffina sono stati decerati e reidratato in etanolo (100%, 90% e 75%). Le sezioni sono state incubate con 3% H _{2O 2 a temperatura ambiente per 10 minuti e quindi bloccate con siero di capra non-immune a temperatura ambiente per 15 minuti. Le sezioni sono state poi incubate con l'anticorpo primario SIRT3 (Cell Signaling Technology) per 2 ore a RT seguita da anti-coniglio incubazione anticorpo secondario per 15 minuti a RT. Le sezioni sono state poi incubate con DAB reagente di rilevamento per 2 minuti ciascuno, con ematossilina e dehydraded in etanolo (90% e 100%). Le sezioni sono state montate e la colorazione è stato analizzato sotto il microscopio.}

costruzione plasmidi e di transfezione delle cellule

SIRT3 intera lunghezza cDNA è stato sintetizzato mediante RT-PCR con RNA totale estratto da GES-1 le cellule come template (primer: 5 'CCGCGGTACCATGGCGTTGTGGGGTTG 3' e 5 'CCGCTCTAGACTATTTGTCTGGTCCATCAAGC 3'). Il cDNA è stato poi clonato in pcDNA3.1 + vettore di espressione (Invitrogen). Il /GFP /Neo-SIRT3-sHRNA plasmidi pGPH1 mira SIRT3 umano (5 'CTTGCTGCATGTGGTTGAT 3') ed il controllo sHRNA plasmidi sono stati ottenuti da GenePharma. Per generare trasfettanti stabili, AGS e le cellule SGC-7901 sono state trasfettate con Lipofectamine 2000 reagente (Invitrogen) e le trasfettanti stabili sono stati selezionati da 400ug /ml G418 (Gibco).

La proliferazione cellulare e saggio clonogenicità

Per saggio di proliferazione, le cellule sono state seminate in un 6-pozzetti a 2 x 10 ^{4 cellule /pozzetto. La proliferazione cellulare è stata calcolata nei giorni 2, 4, 6, e 8 dopo la placcatura. Per assay clonogenicità, le cellule sono state piastrate in una piastra da 6 pozzetti con numero di cellule differenziate e coltivate per 14 giorni e le colonie sono state poi colorate con cristalvioletto, e il numero di colonie (> 50 cellule /colonia) è stato contato secondo i metodi stabiliti [31].}

Misurazione di glucosio, lattato e glicogeno

Il rosso fenolo mezzo privo è stato utilizzato per le cellule di coltura in 6 pozzetti per 24 ore ed i livelli di assorbimento del glucosio e lattato generazione sono stati misurati utilizzando il kit di glucosio Assay e acido lattico Kit (Jiancheng Bioingegneria Institute). I valori relativi sono stati normalizzati per il numero di cellule di ciascun pozzetto. livelli di glicogeno cellulari sono stati rilevati utilizzando il Assay Kit glicogeno (Biovision). Brevemente, 1 × 10 ^{6 cellule sono stati omogeneizzati in acqua 200μL su ghiaccio, e gli omogenati sono stati bolliti per 5 minuti per inattivare gli enzimi e centrifugati a 13.000 rpm per 5 minuti a 4 ° C per rimuovere il materiale insolubile. La produzione di glicogeno è stata misurata con il valore di densità ottica a 570 nm.}

Misura della produzione di ATP
livelli

​​Cellular ATP e ROS sono stati misurati come descritto in precedenza [32]. Cellule coltivate in un 6-pozzetti dopo vari trattamenti, sono stati lisati e livelli di ATP cellulare sono stati misurati con l'ATP bioluminescenza Assay Kit (Sigma). Per misurare la produzione di ATP glicolisi-mediata, le cellule sono state trattate con 2 mM rotenone per 24 ore prima di misurazioni.

Misurazione della generazione di ROS

generazione cellulare di ROS è stato analizzato con 5- (e 6-) carbossi-2 ', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetato (DCFDA) metodo utilizzando micropiastre spettrofotometro (Thermo Fisher) a 488 nm /530 nm di lunghezza d'onda.

attività MnSOD

cellule coltivate in un 6-pozzetti piatto sono stati lisati e l'attività MnSOD è stata determinata da WST-8 metodi utilizzando il kit di test MnSOD (Beyotime) seguendo le istruzioni del produttore.

saggi di cancerogenicità a nudo topi

SGC7901 cellule (7,5 x 10 ^{6) con SIRT3 sovraespressione o caduta sono stati sospesi in 0,1 ml di PBS e inoculato in entrambe le fasce di 5 settimane di età maschio BALB /c atimici topi nudi, ea 28 ° giorno dopo l'inoculazione quando il volume massimo del tumore (~ 1500 millimetri 3) raggiunto nel gruppo di controllo, gli esperimenti sono stati terminati e tutti tumori da ciascun gruppo sono stati escissi e pesati. La procedura sperimentale che coinvolge i test sugli animali è stata condotta in conformità con le linee guida istituzionali; la cura e l'uso Comitato Istituzionale Animal (IACUC) a Xian Jiao Tong University specificamente approvato questo studio (protocollox181).}

lattato deidrogenasi test

Il lattato deidrogenasi è stata determinata seguendo il protocollo stabilito misurando il tasso di riduzione della assorbanza a lunghezza d'onda di 340 nm risultante dalla ossidazione di NADH [27]. Brevemente, le cellule sono state coltivate in 10 piatti cm e omogeneizzati in PBS su ghiaccio. Gli omogenati sono stati aggiunti in tampone contenente 6,6 mM di NADH, 30 mM di sodio piruvato e 0,2 M Tris-HCl, pH 7.3 e misti. Incubare la miscela per 5 minuti per raggiungere la temperatura di equilibrio e quindi registrare il tasso di diminuzione di assorbanza a 340 nm.

SIRT3 in vitro
deacetylation test

SIRT3 umana enzima ricombinante ( BPS) è stato incubato con deidrogenasi L-lattico da cuore bovino (Sigma) in tampone di reazione (50 mM NaCl, 4 mM MgCl _{2, 10 mM NAD ^{+, 50 mM DTT, 50 mM Tris, pH 8,0) con /senza inibitore SIRT3 nicotinamide (NAM, 10 mM) a 37 ° C per 1,5 ore, e poi le reazioni sono stati usati per il saggio dell'attività LDHA descritto come sopra.}}

Real-time PCR

L'RNA totale è stato isolato usando TRIZOL Reagent (Invitrogen) seguita da trattamento con fenolo /cloroformio e precipitazione con 2-propanolo. RNA totale pellet è stato lavato con 75% etanolo e risospeso in acqua. RNA è stato sottoposto a trascrizione inversa con Kit PrimeScript RT-PCR (Takara) e quantitativa in tempo reale, l'analisi PCR dei geni di interesse è stata condotta utilizzando kit SYBR PremixExTaq II (Takara) seguendo le istruzioni del produttore. I dati sono stati normalizzati al livello di γ-tubulina.

immunofluorescenza

cellule AGS seminate sul vetrino in una piastra da 6 pozzetti sono stati fissati in paraformaldeide al 4% per 10 minuti e bloccati in 1% BSA per 1 ora a RT. Incubare le cellule con anticorpi primari contro SIRT3 e LDHA a 4 ° C durante la notte, seguito da incubazione con anticorpo secondario fluorescenza coniugato per 1 ora a RT. Di contrasto è stata eseguita con DAPI utilizzando kit di immunofluorescenza (Beyotime). Le cellule sono state montate e ripreso dalla scansione laser microscopio confocale.

Analisi statistica

I dati sono presentati come media ± SE di almeno tre esperimenti indipendenti. L'analisi statistica è stata effettuata con t test non appaiati a due code di Student se non diversamente specificato. P
< 0.05 è stato considerato significativo.

Risultati

espressione SIRT3 in cellule di cancro gastrico

SIRT3 è ben definito nella regolazione dell'omeostasi mitocondriale in anti-invecchiamento e anti-trasformazione. Recentemente, sono riportati i risultati differenti per quanto riguarda l'inibizione delle cellule SIRT3-mediata e la proliferazione, che porta alla polemica dei suoi ruoli nei tumori [19,20]. Per determinare il ruolo potenziale di SIRT3 nel carcinoma gastrico, espressione di SIRT3 è stato rilevato in 4 linee AGS cellule di cancro gastrico, SGC-7901, MGC-803, HGC-27 e un gruppo di tessuti tumorali del cancro gastrico. Abbiamo scoperto che i livelli di proteina SIRT3 erano elevati in tutte e 4 le linee di cellule di cancro gastrico rispetto ai immortalati GES-1 epiteliali gastriche cellule (AGS, 1,9 volte; SGC-7901, di 1,5 volte; MGC-803, 2.0-fold, e HGC -27, 1,8 volte rispetto alle cellule GES-1) (Fig 1A). In accordo, i livelli di mRNA di SIRT3 in queste linee cellulari sono stati anche aumentati (AGS, 2,6 volte; SGC-7901, 1,7 volte; MGC-803, 2,5 volte; HGC-27, 2,2 volte) rispetto a GES- 1 le cellule (Fig 1b).

analisi immunoistochimica nel tumore e adiacenti non tumorali normali tessuti di un gruppo di pazienti affetti da cancro gastrico hanno dimostrato che le cellule SIRT3-positivi sono stati più frequentemente rilevabili nei tessuti tumorali rispetto a quella nei tessuti normali. I risultati hanno mostrato che il 55,1% di tessuti tumorali (7% dei tessuti normali) esposto alto livello (fortemente positivo), 41,4% di tessuti tumorali (28% dei tessuti normali) esposto livello medio alto (debole positivo), mentre il 3,5% del tumore tessuti e il 64% dei tessuti normali era negativo nell'espressione SIRT3 (Fig 1C e 1D, S1A Fig). È interessante notare che, SIRT3 espressione nel tipo intestinale di tessuti tumorali (15 casi; 93,3% fortemente positivo e il 6,6% debole positivo) era significativamente più alta di quella di tipo diffuso di tessuti tumorali (14 casi; 14,3% fortemente positivo, 78,6% debole positivo e 7.1 % negativo) (Fig 1C e 1E, S1B Fig). Questi risultati suggeriscono che l'espressione SIRT3 è aumentata in alcuni tumori rispetto ai tessuti normali correlate e SIRT3 espressione può essere variare nei singoli tumori, che devono essere ulteriormente approfondito.

livelli di SIRT3 sono collegati con la proliferazione cellulare

Poi abbiamo stabilito SIRT3 sovraespressione e linee cellulari atterramento utilizzando AGS e cellule SGC-7901. L'espressione di SIRT3 in trasfettanti stabili è stata confermata mediante Western blot. Sovraespressione di SIRT3 aumentato la crescita cellulare, mentre SIRT3 knockdown crescita cellulare inibita di entrambe le linee di cellule di cancro gastrico (fig 2A). Inoltre, l'iperespressione di SIRT3 attivata più la formazione di colonie di cellule di controllo trasfettate che era in contrasto con solo un minor numero di colonie formate nelle SIRT3 atterramento cellule (Fig 2B).

Per determinare ulteriormente il ruolo di SIRT3 nella capacità formazione del tumore, abbiamo iniettato SIRT3 sovraespressione e le cellule SGC-7901 atterramento nei fianchi di topi nudi e la crescita tumorale era permesso per 28 giorni dopo l'inoculazione di cellule (S2 Fig). Il peso medio dei tumori derivati ​​da cellule overexpressing SIRT3 era 0.7079g, significativamente più grande del peso medio del tumore del controllo (NC), p = 0,015
, (fig 2C, pannello di sinistra). Al contrario, il peso medio dei tumori derivati ​​da cellule knockdown SIRT3 era 0.0588g, significativamente più piccolo di quello da cellule scramble controllo shRNA (SCR) (0.2033g; p
= 0,009) (Fig 2C, pannello di destra) . Il volume medio di tumori derivati ​​da cellule overexpressing SIRT3 è stata aumentata rispetto a quella da cellule di controllo (NC) (Fig 2C, pannello di sinistra fino a destra). Al contrario, il volume medio dei tumori che crescono da cellule knockdown SIRT3 era notevolmente ridotto rispetto a quello di cellule di controllo (SCR) (Fig 2C, pannello di destra nell'angolo in alto a destra).

glicolisi rafforzate in SIRT3 esprimendo cancro gastrico cellule

Siamo stati poi chiedendo come bioenergetica cellulare potrebbe essere alterato in cellule di cancro gastrico SIRT3-iperespressione. SIRT3 sovraespressione drammaticamente aumentato assorbimento di glucosio (1,4 volte in AGS e 1,9 volte in SGC-7901), mentre SIRT3 atterramento diminuito assorbimento del glucosio (circa il 40% in entrambi i AGS e SGC-7901) (Fig 3A e 3B). In linea con il modello di utilizzo del glucosio, le cellule che iperesprimono SIRT3 avevano aumentato i livelli di secrezione di lattato (1,2 volte in AGS e 1,3 volte in SGC-7901), mentre le cellule atterramento SIRT3 avevano diminuzione dei livelli di secrezione di lattato (55% in AGS e 45 % in SGC-7901) (Fig 3C e 3D). Abbiamo anche trovato che la formazione di glicogeno è risultato significativamente aumentato da SIRT3 sovraespressione (1,5 volte in AGS e 1,3 volte in SGC-7901), una caratteristica di rapida crescita delle cellule tumorali [33], mentre ridotta di SIRT3 atterramento (40% in AGS e il 70% in SGC-7901) (Fig 3E e 3F).

SIRT3 è stato dimostrato coinvolto nella deacetilazione degli enzimi del metabolismo a livello globale e il mantenimento dei livelli di ATP basali nelle cellule sia in condizioni normali e in malattie [1 , 2]. Totale ATP e ATP glicolisi generazione cellulare sono stati rilevati in AGS e cellule SGC-7901 sia con SIRT3 sovraespressione o SIRT3 atterramento. Il totale i livelli di ATP cellulari sono stati aumentati nelle cellule overexpressing SIRT3 (circa 1,3 volte in entrambe le linee cellulari), ma è diminuita nelle cellule SIRT3 atterramento (circa il 75% in entrambe le linee cellulari) rispetto alle cellule di controllo NC o SCR (Fig 4A e 4B) . Poi abbiamo trattato le cellule con rotenone per inibire la fosforilazione ossidativa, e testato produzione di ATP da glicolisi. Come mostrato nella figura 4C e 4D, SIRT3 sovraespressione ha portato ad un aumento della produzione glicolisi ATP (1,4 volte in AGS e 1,6 volte in SGC-7901), mentre SIRT3 atterramento ha portato ad una significativa riduzione della produzione di glicolisi ATP (20% in AGS e il 40% in SGC-7901) rispetto al NC o Scr controllo.

SIRT3 regola l'omeostasi del ROS in cellule di cancro gastrico

un corpo di evidenza supporta che ha aumentato il livello di ROS è un caratteristica fondamentale nelle cellule tumorali, che rendono le cellule tumorali più sensibili alle sollecitazioni aggiuntive ROS [34]. Qui abbiamo scoperto che l'iperespressione di SIRT3 diminuito livelli di ROS al 70% e l'80% nelle cellule AGS e SGC-7901, mentre l'inibizione dell'espressione SIRT3 aumento dei livelli di ROS (1,4 volte in cellule AGS e 1,6 volte in cellule SGC-7901), rispettivamente (Fig 5A e 5B). In accordo con la letteratura che mostra deacetylates SIRT3 e attiva MnSOD (11, 12), in cellule di cancro gastrico, l'attività MnSOD è stata arricchita da SIRT3 sovraespressione (1,4 volte nelle cellule AGS e 1,2 volte nelle cellule SGC-7901), ma ridotto SIRT3 atterramento (50% nelle cellule AGS e il 65% nelle cellule SGC-7901) (Fig 5C e 5D), suggerendo che SIRT3 può proteggere le cellule dal danno ossidativo indotto dallo stress riequilibrando intracellulare di ROS attraverso il rafforzamento di attività MnSOD in cellule di cancro gastrico.

deacetylates SIRT3 e attiva LDHA

LDHA svolge un ruolo chiave nella iniziazione del tumore, la manutenzione e la progressione. L'inibizione di LDHA blocchi di attività tumorigenicità e tumore progressione [26,27] e l'attività LDHA può essere regolata da modifica acetilazione /deacetilazione [35]. Ci chiedevamo se SIRT3 è coinvolto nella regolazione dell'attività LDHA. Abbiamo scoperto che, in cellule di cancro gastrico, l'attività LDHA è risultato significativamente aumentato nel SIRT3 overexpressing cellule, mentre è diminuita nelle cellule SIRT3 atterramento rispetto alle cellule di controllo NC o Scr separatamente senza cambiamento rilevabile nel livello delle proteine ​​LDHA nei trasfettanti stabili (Fig 6A). risultati immunostaining mostrato che LDHA e SIRT3 sono stati co-localizzato nel citoplasma (Fig 6B), e l'analisi co-IP sia con LDHA o anticorpi SIRT3 rivelato che SIRT3 è in grado di interagire con LDHA (Fig 6C). Inoltre, il livello di LDHA acetilazione era diminuita nelle cellule overexpressing SIRT3, ma è aumentata nelle cellule SIRT3 atterramento (Fig 6D). Inoltre, in vitro
LDHA saggio di attività condotta utilizzando SIRT3 umana ricombinante commerciale e cuore bovino L-lattico deidrogenasi indicato che l'attività LDHA è stata aumentata con la presenza di SIRT3 nella reazione, che è stato invertito mediante l'aggiunta di inibitore SIRT3 , nicotinamide (Fig 6E). Per identificare il potenziale sito SIRT3 deacetilazione (s) su LDHA, abbiamo cercato di database e ha scoperto che K5, K14, K57, K81, K118, K126, K222 e K318 sono potenziali siti di acetilazione di LDHA, e precedente studio riportato che K5 acetilazione /deacetilazione era implicati nella regolazione dell'attività LDHA [35]. Poi abbiamo fatto saggio di attività LDHA utilizzando lisina 5 e lisina 318 acetilazione imitare (K5Q /K318Q) o deacetylation mimica (K5R /K318R) LDHA mutante, e abbiamo trovato che né K5 né K318 è stato richiesto per l'attivazione LDHA SIRT3-mediata (S3 Fig). Ulteriore identificazione di SIRT3-mediata LDHA deacetilazione è nel bisogno.

SIRT3 upregulates geni coinvolti nel metabolismo cellulare

Per caratterizzare la firma molecolare di SIRT3-LDHA bioenergetica mediate in cellule di cancro gastrico, abbiamo misurato la espressione di geni associati con il trasporto di glucosio e glicolisi. I dati in figura 7A e 7B hanno dimostrato che l'iperespressione di SIRT3 in AGS o SGC-7901 ha indotto l'espressione di HK2 (1,47 volte nelle cellule AGS, 1,3 volte in cellule SGC-7901), MCT4 (2,3 volte in cellule AGS, 1.34 fold in cellule SGC-7901) e Glut1 (1,55 volte nelle cellule AGS, 1,38 volte in cellule SGC-7901) a livello di mRNA testato da real-time PCR. Al contrario, SIRT3 knockdown diminuito l'espressione del gene HK2 al 76%, MCT4 al 73% e Glut1 al 62% in cellule AGS, mentre HK2 al 80%, MCT4 al 62% e Glut1 al 74% in cellule SGC-7901. Inoltre, quando SIRT3 era sovraespresso, livello MCT1 mRNA è stata aumentata nelle cellule AGS di 1,6 volte, ma non nelle cellule SGC-7901, e quando SIRT3 fu knockdown, MCT1 è stata ridotta al 59% nel AGS e il 65% nelle cellule SGC-7901 rispettivamente.

Discussione

Questo studio fornisce la prova che indica che SIRT3 espressa in alcune cellule tumorali, come le cellule di cancro gastrico, può essere collegato con l'aggressività arricchita da bioenergetica SIRT3 mediata tramite deacetilazione e l'attivazione di LADH. Sebbene accumulando evidenze indica che SIRT3 svolge un ruolo chiave nella protezione delle cellule normali contro l'invecchiamento e la trasformazione maligna, la sua funzione in cellule già trasformate come le cellule tumorali che esprimono SIRT3 deve essere esaminato [19]. La mancanza di SIRT3 in MEF porta a instabilità genomica e una frequenza elevata di trasformazione cellulare mediata da Ras con un aumento del tasso di formazione del tumore e invecchiamento, suggerendo che SIRT3 è necessaria nella prevenzione di invecchiamento cellulare e cancerogenesi [11,15]. Inoltre, la mancanza di o minore espressione di SIRT3 viene rilevato in diversi tumori umani e il livello SIRT3 è associata con la sensibilità delle cellule tumorali alla chemio e radioterapia [11,15,16]. Tuttavia, SIRT3 è dimostrato anche essere sovraespresso nei tumori umani e associata a resistenza alla terapia [19,21,36]. Questi risultati suggeriscono che SIRT3 può indirizzare le diverse proteine ​​tra cellule normali e tumorali, e che l'espressione SIRT3 possono essere variati in diversi tipi di cancro, come i risultati attuali indicano che il tipo intestinale del carcinoma gastrico esprime un livello di SIRT3 quella diffusa tipo di cancro gastrico.

e 'stato generalmente accettato che le cellule tumorali consumano più energia cellulare per supportare la rapida crescita e la proliferazione di cellule normali utilizzando la glicolisi come la principale fonte di produzione di ATP, invece di fosforilazione ossidativa [24] . In questo studio, abbiamo dimostrato che, nelle cellule di cancro gastrico, SIRT3 interagisce e deacetylates LDHA, causando una maggiore attività LDHA; e SIRT3 sovraespressione porta ad un aumento della produzione di ATP cellulare e l'attività MnSOD in parallelo con un ridotto livello di ROS cellulare, indicando un aumento della capacità ossidativa scavenger di SIRT3 possibilmente attraverso l'attivazione di enzimi MnSOD deacetilazione-mediata. Una crescente evidenza mostra che SIRT3 è necessario per il mantenimento dell'omeostasi cellulare e mitocondri attraverso la regolazione dei mitocondri metabolismo e sistema di equilibrio redox cellulare, proteggendo le cellule contro lo stress ossidativo mediante regolazione generazione di ROS, un meccanismo fondamentale nelle malattie invecchiamento, cancro e il cuore [1,2, 37]. SIRT3 può deacetylate un gruppo di destinazioni mitocondri implicati nella regolazione di entrambi glicolisi e stress ossidativo cellulare. Recentemente, SIRT3 si trova in grado di deacetylate e aumentare l'attività piruvato deidrogenasi nelle cellule tumorali, che può aumentare sia la bioenergetica mitocondriale e glicolisi [38]. D'accordo, questo studio indica che SIRT3 può deacetylate e attivare LDHA che può essere utilizzato sia per la respirazione mitocondriale e glicolisi. D'altra parte, SIRT3 può deacetylate e successivamente attivare altri substrati mitocondri, come MnSOD [11,12], foxo3 [39] e IDH2 [9] per pulire ROS prodotta dalla fosforilazione ossidativa, proteggendo le cellule dal danno ossidativo [40] . Anche in linea con questi risultati, in questo studio, abbiamo scoperto che l'iperespressione di SIRT3 aumenta l'attività MnSOD, che potrebbe essere uno dei motivi di ridotti livelli di ROS cellulare in una maggiore condizione di metabolismo cellulare.

LDHA, come un membro della famiglia di lattato deidrogenasi (LDH), si trova esistito in cellule glycolytic e localizzata nei mitocondri oltre al citosol [41], e catalizzando principalmente l'inter-conversione di piruvato e lattato [42]. LDHA è dimostrato di giocare un ruolo chiave nella glicolisi aerobica e tumorigenicità in cellule maligne [26,27]. Nelle cellule tumorali, LDHA consuma rapidamente il piruvato prodotto dalla via glicolitica, con conseguente aumento della produzione di lattato aerobico [26]. L'inibizione della LDHA induce la produzione di ROS, diminuisce i livelli di ATP cellulare e inibisce la glicolisi, inibisce quindi la crescita delle cellule e fa scattare la morte delle cellule nel cancro [27]. Composto con questi rapporti, abbiamo scoperto che SIRT3 può interagire e attivare LDHA. Nel SIRT3 overexpressing cellule, LDHA acetilazione è stata ridotta ad un aumento dell'attività enzimatica LDHA. Anche se il meccanismo esatto che causa regolazione LDHA SIRT3 mediata deve essere ulteriormente indagato, questi risultati dimostrano che LDHA controllato via glicolisi che accelera la bioenergetica tumore può essere influenzata da livelli di espressione SIRT3.

Il nostro studio ha anche rivelato che l'espressione di un gruppo di geni, quali MCT1, MCT4, HK2 e Glut1, noto come regolatori chiave del metabolismo energetico nel cancro sono anche aumentata in cellule di cancro gastrico SIRT3-sovraespressione, dimostrando un ruolo potenziale di SIRT3 nel migliorare glicolisi nelle cellule tumorali. HK2 catalizza la fosforilazione del glucosio in glucosio-6-fosfato nella fase iniziale di glicolisi [43]. trasportatore del glucosio (GLUT) controlla il trasporto di glucosio attraverso la membrana plasmatica, funziona come il primo fattore limitante per il metabolismo del glucosio [44]. MCT1 e MCT4, membri di monocarboxylates (come il lattato e piruvato) famiglia trasportatore, sono coinvolti anche nella crescita dei tumori glicolisi-dipendenti [45]. Insieme, questi risultati suggeriscono una potenziale interazione tra SIRT3 e un gruppo di geni glicolisi associata a segnalare la crescita tumorale aggressiva, che deve essere ulteriormente approfondito.

In conclusione, anche se SIRT3 è ben caratterizzato nella omeostasi mitocondriale contro cellule l'invecchiamento e la trasformazione, espressione di SIRT3 nelle cellule tumorali è legata con una maggiore proliferazione e la crescita aggressiva delle cellule di cancro gastrico. interagisce SIRT3 e attiva LDHA, con conseguente aumento della glicolisi e la produzione di ATP, che insieme con una maggiore attività antiossidante MnSOD mitocondriale e diminuito il livello di ROS intracellulari (un modello ipotetico viene proposto in figura 7C). Così, la funzione di crescita che stimola di SIRT3 dimostra un potenziale bersaglio per il trattamento di tumori con l'espressione SIRT3.

Informazioni di supporto
S1 Fig. scivoli Rappresentante patologiche per determinare l'espressione SIRT3 in campioni di cancro gastrico umano.
A, cancro gastrico umano incluso in paraffina e patologicamente normali campioni di tessuto adiacenti accoppiati sono stati sottoposti a immunoistochimica colorazione con SIRT3 anticorpi (marrone), seguita da nuclei di contrasto con ematossilina ( blu, ogni tumore è stato mostrato con adiacenti tessuti normali in una riga da 20 × e 40 ×). B, le immagini rappresentative di espressione SIRT3 nei tipi intestinali e diffuse di cancro gastrico. barra della scala, 50 micron
doi:. 10.1371 /journal.pone.0129834.s001
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S2 Fig. Sovraespressione di SIRT3 promosso carico tumorale in vivo.
Cellule SGC-7901 con SIRT3 sovraespressione (A) o atterramento (B) sono stati iniettati nel sottocute fianco destro della topi nudi con le cellule di controllo relativi (NC o SCR) nella sinistra fianco. tumori xenotrapianto sono stati asportati e pesati al 28 ° giorno dopo l'inoculazione di cellule. Immagini di pannello di destra mostravano tumori trapiantati in vivo alla fine dell'esperimento. Immagini hanno mostrato la crescita del tumore nei topi
doi:. 10.1371 /journal.pone.0129834.s002
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S3 Fig.

• PLoS ONE: metastasi linfonodali, un prognostico unico fattore indipendente in prima cancro gastrico
• PLoS ONE: identificazione e caratterizzazione di CXCR4-positivo cancro gastrico cellule staminali