PLoS ONE: SIRT3 Verbetert glycolyse en proliferatie in-SIRT3 uitdrukken maagkanker Cellen

Abstract

SIRT3 is een belangrijke NAD ^{+ - afhankelijke eiwit deacetylase in de mitochondriën van zoogdiercellen, functioneert tot veroudering van cellen en transformatie te voorkomen via regulering van de mitochondriale metabole homeostase. Echter, SIRT3 ook gevonden om uit te drukken in een aantal menselijke tumoren; zijn rol in deze SIRT3-tot expressie brengende tumorcellen te worden toegelicht. Deze studie toonde aan dat de expressie van SIRT3 in een groep van maagkanker cellen werd verhoogd in vergelijking met normale maagepitheelcellen. Hoewel SIRT3 expressieniveaus in de maag tumorweefsels werden verhoogd vergeleken met de naburige niet-tumorweefsels, SIRT3 positieve kankercellen werden vaker waargenomen in de intestinale soort maagkanker dan diffuse soort maagkanker, wat aangeeft dat SIRT3 verbonden met subtypen van maag- kanker. Overexpressie van SIRT3 bevorderd celproliferatie en verhoogde ATP productie, glucoseopname vorming glycogeen, MnSOD activiteit en lactaatproductie, die werden geremd door SIRT3 knockdown, wat aangeeft dat SIRT3 speelt een rol bij het herprogrammeren van de bio-energetica gastrische tumorcellen. Verdere analyse toonde aan dat SIRT3 interactie met en gedeacetyleerd de lactaat dehydrogenase A (LDHA), een belangrijk eiwit in het reguleren van anaerobe glycolyse, het verbeteren van LDHA activiteit. In consistentie, een cluster van glycolyse geassocieerde genen werd opgereguleerd in de SIRT3 overexpressie gastrische tumorcellen. Dus naast de goed gedocumenteerde SIRT3-gemedieerde mitochondriale homeostase in normale cellen, SIRT3 kan glycolyse en celproliferatie in SIRT3 expressie brengende kankercellen verbeteren}

Citation:. Cui Y, L Qin, Wu J, Qu X, Hou C, Zon w, et al. (2015) SIRT3 Verbetert de glycolyse en proliferatie in-SIRT3 uitdrukken Gastric kankercellen. PLoS ONE 10 (6): e0129834. doi: 10.1371 /journal.pone.0129834

Editor: Xianglin Shi, Universiteit van Kentucky, Verenigde Staten

Ontvangen: 16 april 2015; Geaccepteerd: 13 mei 2015; Gepubliceerd: 29 juni 2015

Copyright: © 2015 Cui et al. Dit is een open toegang Artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Data Beschikbaarheid: Alle relevante gegevens zijn binnen het papier en de Ondersteunende informatie bestanden

Financiering:. Deze studie werd gedeeltelijk ondersteund door de National Natural Science Foundation of China, Key Program (30930105), Nationaal 12-5 Support Plan Project van het ministerie van Wetenschap en Technologie van China (2012BAH30F03), de National Natural Science Foundation of China (31.070.740), de 985 en 211 projecten van Xi'an Jiaotong University (JKL), en het National Cancer Institute RO1 subsidie ​​CA152313-01-A1 (JJL).

Competing belangen. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

Sirtuins, een familie van NAD ^{+ - afhankelijke histondeacetylasen (HDACs) in zoogdiercellen cellen, zijn betrokken bij een breed scala van fysische processen zoals celoverleving, apoptose, metabolisme, de stressrespons, veroudering en levensduur [1,2]. Onder de zeven sirtuin leden (SIRT1-7), SIRT3 is de best gekarakteriseerde mitochondriale sirtuin, functioneert tot mitochondriale eiwitten die betrokken zijn bij oxidatieve fosforylering, vetzuur oxidatie, de ureum cyclus, en de antioxidant reactie [2-9] te reguleren. Verschillende studies hebben de rol van SIRT3 in de stofwisseling en homeostase gemarkeerd in normale cellen en onthulde nieuwe doelen en substraten voor SIRT3-afhankelijke deacetylering [10]. Kim et al gemeld dat SIRT3 een belangrijke mitochondria eiwit, en gebrek aan SIRT3 expressie verband houdt met verhoogde mitochondriale DNA-schade en veroudering, evenals verhoogde potentie Ras-geïnduceerde celtransformatie en SIRT3 gemedieerde MnSOD activering bijdraagt ​​aan de mitochondriale homeostase [11,12]. Ter ondersteuning, humane embryonale nier 293 cellen (HEK293) cellen een verhoogde SIRT3 expresseren door oxidatieve stress, wat leidt tot activatie van deacetylering en MnSOD [13]. SIRT3 wordt verondersteld te functioneren als een tumorsuppressorgen en speelt een belangrijke rol bij het verbeteren celhomeostase tegen veroudering en kanker.}

Sommige tumorcellen tonen de expressie van SIRT3 en de potentiële rol van SIRT3 in deze tumorcellen vooral de potentiële relatie tot de agressieve fenotype, controversieel [14] is. SIRT3 expressie lager of niet detecteerbaar in een reeks humane kankers, waaronder borstkanker, glioblastoma, colonkanker en osteosarcoom, prostaat- en eierstokkanker [11,15,16]. SIRT3 induceert groeistop en apoptose door selectieve silencing van Bcl-2 in HCT116 cellen door het moduleren JNK2 signaleringsroute [17]. Ook SIRT3 gerapporteerd bijdragen aan verhoogde gevoeligheid van menselijke leukemiecellen chemotherapie eventueel door inductie van mitochondriën-gemedieerde apoptose [18]. Anderzijds, SIRT3 expressie ook gevonden worden verhoogd mondkanker, klierpositieve borstkanker, slokdarmkanker en schildklier carcinoma's; en de toegenomen SIRT3 wordt geassocieerd met hogere maligne fenotype en downregulatie van SIRT3 verbetert tumor gevoeligheid voor anti-kankerbehandeling [19-23]. Deze resultaten doorgegeven aan een andere rol van SIRT3 specifieke tumoren die moet worden toegelicht.

Kankercellen zijn metabolisch actief en verbruiken meer cellulaire brandstof dan normale cellen. Maar kankercellen relais op vooral op de ATP-synthese door aërobe glycolyse, een functie die bekend staat als Warburg effect [24]. Een dergelijke aerobe glycolyse mogelijk een beschermende kankercellen vormen oxidatieve stress omdat mitochondriale respiratie is de belangrijkste bron van intracellulair ROS [25]. Lactaat dehydrogenase A (LDHA) is een enzym regelen interconversie tussen pyruvaat en L-lactaat reversibel bij de laatste stap van de anaërobe glycolyse [26]. Remming van de LDHA vermindert tumorigene potentieel met verhoogde mitochondriale zuurstofverbruik en een verminderde mitochondriale membraanpotentiaal [26] en de totale cellulaire ATP productie en glycolyse [27].

In dit onderzoek onderzochten we de mogelijke rol van SIRT3 gastrische kankercellen die SIRT3 uitdrukken. Expressie van SIRT3 is toegevoegd aan de agressieve groei, die via SIRT3-gedeacetyleerd werd bemiddeld en geactiveerd LDHA, verbetering glycolyse en expressie van een groep van glycolyse geassocieerde genen. Zo SIRT3-LDHA-gemedieerde glycolyse metabolisme kan een potentieel therapeutisch doelwit zijn om kankercellen die SIRT3 uiten behandelen.

Materialen en methoden

Cellijnen en cultuur

Human maagkanker cellijnen MGC-803, HGC-27, SGC-7901 [28] en AGS [29] en geïmmortaliseerde humane gastrische epitheel cellijn GES-1 [30] werden in RPMI-1640 medium (Invitrogen) aangevuld met 10% foetaal runderserum gehandhaafd serum en 1% penicilline /streptomycine en gecultiveerd bij 37 ° C onder een atmosfeer van 5% CO2.

Immunoprecipitatie en western blot

Subconfluente cellen werden gelyseerd en de lysaten werden geïncubeerd met proteïne A /G agarose korrels plus de aanbevolen hoeveelheid antilichamen tegen ofwel SIRT3 (Cell Signaling Technology) of LDHA (Santa Cruze) bij 4 ° C overnacht. Monsters werden gecentrifugeerd en gescheiden door SDS polyacrylamide gelelektroforese en geëlektroblot op nitrocellulose membranen. Na het blokkeren met 5% magere melk in TBST werden de membranen geïncubeerd met primair antilichaam bij 4 ° C geïncubeerd, gevolgd door incubatie met secundair antilichaam gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Eiwitten van belang werden gevisualiseerd door ECL Detectie Kit (Thermo Fisher).

immunohistochemie assay

Pathologische slides maagkanker met aangrenzende normale weefsels werden geanalyseerd door immunohistochemie assay werd uitgevoerd volgens instructies van de fabrikant. The Polymer Detection kit voor de immunohistochemie analyse werd gekocht van Zhongshan Golden Bridge Biotechnology. In het kort werden paraffinesecties was ontdaan en opnieuw gehydrateerd in ethanol (100%, 90% en 75%). De secties werden geïncubeerd met 3% H _{2O 2 bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten en vervolgens geblokkeerd met niet-immuun geit serum bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. De coupes werden vervolgens geïncubeerd met primair antilichaam tegen SIRT3 (Cell Signaling Technology) gedurende 2 uur bij kamertemperatuur, gevolgd door anti-konijn secundair antilichaam incubatie gedurende 15 minuten bij KT. De coupes werden vervolgens geïncubeerd met DAB detectiereagens gedurende 2 minuten elk, tegengekleurd met hematoxyline en dehydraded in ethanol (90% en 100%). De secties werden onder de microscoop bevestigd en de kleuring werd geanalyseerd.}

Plasmideconstructie en celtransfectie

SIRT3 volledige lengte cDNA werd gesynthetiseerd onder gebruikmaking van RT-PCR met totaal RNA geëxtraheerd uit GES-1 cellen template (primers: 5 'CCGCGGTACCATGGCGTTGTGGGGTTG 3' en 5 'CCGCTCTAGACTATTTGTCTGGTCCATCAAGC 3'). Het cDNA werd vervolgens gekloneerd in pcDNA3.1 + expressievector (Invitrogen). De pGPH1 /GFP /Neo-SIRT3-shRNA targeting plasmide menselijke SIRT3 (5 'CTTGCTGCATGTGGTTGAT 3') en de besturings- shRNA plasmide verkregen uit GenePharma. Om stabiele transfectanten gegenereerd, AGS en SGC-7901-cellen werden getransfecteerd met gebruik van Lipofectamine 2000 reagens (Invitrogen) en stabiele transfectanten werden geselecteerd met 400 ug /ml G418 (Gibco).

celproliferatie assay en clonogenicity

proliferatie assay werden cellen uitgeplaat in 6-well plaat bij 2 x 10 ^{4 cellen /putje. Celproliferatie werd berekend op dagen 2, 4, 6 en 8 na uitplaten. Voor clonogenicity assay werden cellen uitgeplaat in een 6-wells plaat met gevarieerde celaantallen en gedurende 14 dagen en kolonies werden vervolgens gekleurd met kristal violet en het aantal kolonies (> 50 cellen /kolonie) werd geteld volgens de gebruikelijke methoden [31].}

Meting van glucose, lactaat en glycogeen

de fenolrood vrij medium werd gebruikt om kweken cellen in 6-well platen voor 24 uur en de niveaus van glucose en lactaat generatie werden gemeten met behulp van de Glucose Assay Kit en Lactic Acid Kit (Jiancheng Bioengineering Institute). De relatieve waarden zijn genormaliseerd naar het aantal cellen van elk putje. Cellulair glycogeen niveaus werden gedetecteerd met behulp van de glycogeen Assay Kit (Biovision). Kort samengevat, 1 x 10 ^{6 cellen werden gehomogeniseerd in 200 ui water op ijs en de homogenaten werden gekookt gedurende 5 minuten om enzymen te inactiveren en gecentrifugeerd bij 13.000 rpm gedurende 5 minuten bij 4 ° C om onoplosbaar materiaal te verwijderen. De glycogeenproductie werd gemeten met de OD waarde bij 570 nm.}

Meting van ATP productie

Cellular ATP en ROS niveaus werden gemeten zoals eerder beschreven [32]. Cellen gekweekt in een 6-wells plaat na verschillende behandelingen werden gelyseerd en cellulaire ATP-niveaus werden gemeten met ATP bioluminescentie Assay Kit (Sigma). Voor het meten glycolyse-gemedieerde ATP productie, werden de cellen behandeld met 2 uM rotenon gedurende 24 uur voor metingen.

Meting van ROS generatie

Cellular ROS generatie werd getest met 5- (en 6-) carboxy-2 ', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetaat (DCFDA) methode met microplaat spectrometer (Thermo Fisher) bij 488 nm nm /530.

MnSOD activiteiten

De cellen gekweekt in een 6-well plaat werden gelyseerd en MnSOD activiteit werd bepaald door WST-8 methoden waarbij de MnSOD testkit (Beyotime) volgens de instructies van de fabrikant.

tumorigeniciteit assays naakt muizen

SGC7901 cellen (7,5 x 10 ^{6) met SIRT3 overexpressie of knockdown in 0,1 ml PBS gesuspendeerd en geïnoculeerd in ofwel flank van 5 weken oude mannelijke BALB /c athymische naakt muizen, en in het 28 e dag na inoculatie als de maximale tumorvolume (~ 1500 mm 3) bereikte in de controlegroep werden de experimenten beëindigd en alle tumoren van elke groep werden uitgesneden en gewogen. De experimentele procedure waarbij dierproeven werd uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele richtlijnen; de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) bij Xian Jiao Tong University specifiek goedgekeurd deze studie (Protocolx181).}

Lactaat dehydrogenase test

The lactaatdehydrogenase activiteit werd bepaald naar aanleiding van de vastgestelde protocol door meting van de verlaging van de absorptie bij een golflengte van 340 nm als gevolg van de oxidatie van NADH [27]. Kort samengevat werden cellen gekweekt in 10 cm schalen en gehomogeniseerd in PBS op ijs. De homogenaten werden toegevoegd aan buffer die 6,6 mM NADH, 30 mM natriumpyruvaat en 0,2 M Tris-HCl, pH 7,3 en gemengd. Incubeer het mengsel gedurende 5 minuten om de temperatuur equilibratie te bereiken en vervolgens noteer de daling snelheid van de absorptie bij 340 nm.

SIRT3 In vitro
deacetylering assay

Human SIRT3 recombinant enzym ( BPS) werd geïncubeerd met L-lactaatdehydrogenase uit runderhart (Sigma) in reactiebuffer (50 mM NaCl, 4 mM MgClz _{2, 10 mM NAD ^{+, 50 mM DTT, 50 mM Tris, pH 8,0) met /zonder SIRT3 inhibitor nicotinamide (NAM, 10 mM) bij 37 ° C gedurende 1,5 uur, waarna de reacties werden gebruikt voor LDHA activiteitstest zoals hierboven beschreven.}}

Real-time PCR

Totaal RNA werd geïsoleerd met behulp van TRIZOL Reagent (Invitrogen) gevolgd door behandeling met fenol /chloroform en precipitatie met 2-propanol. Totaal RNA pellet werd dan gewassen met 75% ethanol en geresuspendeerd in water. RNA werd onderworpen aan transcriptie met PrimeScript RT-PCR Kit (Takara) en kwantitatieve real-time PCR-analyse van genen van interesse werd uitgevoerd met behulp van SYBR PremixExTaq II kit (Takara) volgens de instructies van de fabrikant te keren. Gegevens werden genormaliseerd tot het niveau van γ-tubuline.

Immunofluorescentie

AGS cellen gezaaid op het dekglaasje in een 6-well plaat werden gefixeerd in 4% paraformaldehyde gedurende 10 minuten geblokkeerd in 1% BSA gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Incubeer cellen met primaire antilichamen tegen SIRT3 en LDHA bij 4 ° C geïncubeerd, gevolgd door incubatie met fluorescentie-geconjugeerd secundair antilichaam gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Tegenkleuring werd uitgevoerd met behulp van DAPI immunofluorescentie kit (Beyotime) uitgevoerd. De cellen werden gemonteerd en afgebeeld door confocale laser scanning microscoop.

Statistische analyse

De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SE van ten minste drie onafhankelijke experimenten. Statistische analyse werd uitgevoerd met ongepaarde tweezijdige Student's t-test, tenzij anders vermeld. P
< 0,05 werd beschouwd als significant.

Resultaten

SIRT3 expressie bij maagkanker cellen

SIRT3 is goed gedefinieerd in het reguleren van de mitochondriale homeostase in anti-aging en anti-transformatie. Recentelijk zijn verschillende resultaten gemeld met betrekking tot SIRT3 gemedieerde remming en proliferatie, waardoor de controverse van zijn rol in kanker [19,20]. Om de mogelijke rol van SIRT3 bij maagkanker bepalen expressie van SIRT3 werd gedetecteerd in 4 maagkanker cellijnen AGS, SGC-7901, MGC-803, HGC-27 en een groep van maagkanker tumorweefsels. We vonden dat SIRT3 eiwitniveaus in alle 4 maagkanker cellijnen werden verhoogd vergeleken met de geïmmortaliseerde maagepitheel GES-1 cellen (AGS, 1,9-voudig, SGC-7901, 1,5-voudig, MGC-803, 2,0-voudig en HGC -27, 1,8-voudige van GES-1-cellen) (figuur 1A). Overeenkomstig waren de mRNA-niveaus van SIRT3 in deze cellijnen toegenomen (AGS, 2,6-voudig, SGC-7901, 1,7-voudig, MGC-803, 2,5-voudig, HGC-27, 2,2-voudig) vergeleken met GES- 1 cellen (figuur 1B).

Immunohistochemie analyse tumor en aangrenzende niet-tumor- normale weefsels van een groep maagkanker patiënten toonde dat SIRT3-positieve cellen waren frequenter detecteerbaar in tumorweefsels dan in normale weefsels. De resultaten toonden aan dat 55,1% van tumorweefsels (7% van de normale weefsels) vertoonden hoge (sterk positief), 41,4% van tumorweefsels (28% van de normale weefsels) vertoonde matig niveau (zwak positief), terwijl 3,5% van de tumor weefsels en 64% van de normale weefsels was negatief in SIRT3 expressie (Fig 1C en 1D, S1A figuur). Interessant SIRT3 expressie in intestinale type tumorweefsels (15 gevallen, 93,3% sterk positief en 6,6% zwak positief) was significant hoger dan in diffuse type tumorweefsels (14 gevallen, 14,3% sterk positief, 78,6% zwak positieve en 7,1 % negatief) (Fig 1C en 1E, S1B figuur). Deze resultaten suggereren dat SIRT3 expressie in sommige tumoren is toegenomen in vergelijking met verwante normale weefsels en SIRT3 expressie kunnen worden variëren in individuele tumoren, die moeten verder worden onderzocht.

SIRT3 niveaus zijn gekoppeld aan celproliferatie

dan hebben we vastgesteld SIRT3 overexpressie en knock-down cellijnen met behulp van AGS en SGC-7901-cellen. De expressie van SIRT3 in stabiele transfectanten werd bevestigd door Western blot. Overexpressie van SIRT3 verhoogde celgroei, terwijl SIRT3 knockdown remde celgroei van zowel maagkanker cellijnen (figuur 2A). Verder overexpressie van SIRT3 veroorzaakt meer kolonievorming dan controle getransfecteerde cellen die in tegenstelling tot slechts minder kolonies gevormd in de SIRT3 knockdown cellen (Figuur 2B).

De rol van SIRT3 in tumorvorming vermogen vervolgens bepalen, geïnjecteerd SIRT3 overexpressie en knock-down SGC-7901 cellen in flanken van naakt muizen en tumorgroei werd toegestaan ​​gedurende 28 dagen na cel enting (S2 Afb). Het gemiddelde gewicht van de tumoren verkregen uit SIRT3 overexpressie cellen was 0.7079g aanzienlijk groter dan het gemiddelde tumorgewicht van controle (NC), p
= 0,015, (figuur 2C, linkerpaneel). In tegenstelling, het gemiddelde gewicht van tumoren verkregen uit SIRT3 knockdown cellen was 0.0588g aanmerkelijk kleiner dan die van scramble shRNA controlecellen (Scr) (0.2033g; p
= 0,009) (figuur 2C, rechter paneel) . De gemiddelde omvang van tumoren verkregen uit SIRT3 overexpressie cellen werd verhoogd dan die van controlecellen (NC) (figuur 2C, linkerpaneel up rechtsboven). Integendeel, de gemiddelde omvang van tumoren groeien van SIRT3 knockdown cellen was aanzienlijk klein in vergelijking met die van controlecellen (Scr) (figuur 2C, rechterpaneel up rechtsboven).

Verbeterde glycolyse SIRT3 expressie maagkanker cellen

We werden vervolgens af hoe de cellulaire bio-energetica kan worden gewijzigd-SIRT3 overexpressie maagkanker cellen. SIRT3 overexpressie dramatisch toegenomen opname van glucose (1,4-voudig AGS en 1,9-voudig SGC-7901), terwijl SIRT3 knockdown verlaagde glucoseopname (ongeveer 40% in zowel AGS en SGC-7901) (Figuur 3A en 3B). Consistent met het patroon van glucose gebruik, had SIRT3 overexpressie cellen verhoogde niveaus van lactaat uitscheiding (1,2-voudig AGS en 1,3-voudig SGC-7901), terwijl SIRT3 knockdown cellen niveaus van lactaat afscheiding (55% in AGS en 45 afgenomen % in SGC-7901) (figuur 3C en 3D). We vonden ook dat glycogeenopbouw aanzienlijk werd verhoogd SIRT3 overexpressie (1,5-voudig AGS en 1,3-voudig SGC-7901), een kenmerk van snelle groei van tumorcellen [33], terwijl verminderd SIRT3 knockdown (40% in AGS en 70% in SGC-7901) (figuur 3E en 3F).

SIRT3 bewezen betrokken bij de deacetylering van globale metabolisme enzymen en onderhoud van ATP basale niveaus in cellen, zowel in normale toestand en bij ziekten [1 , 2]. Totale cellulaire ATP en glycolyse ATP generatie werden gedetecteerd in AGS en SGC-7901-cellen met hetzij SIRT3 overexpressie of SIRT3 knockdown. De totale cellulaire ATP-niveaus waren verhoogd in SIRT3 overexpressie cellen (ongeveer 1,3-voudig in beide cellijnen), maar daalde in SIRT3 knockdown cellen (ongeveer 75% in beide cellijnen) vergeleken met NC of Scr controlecellen (figuur 4A en 4B) . Vervolgens behandeld met rotenon we cellen voor oxidatieve fosforylering te remmen en getest ATP generatie van glycolyse. Zoals wordt getoond in figuur 4C en 4D, SIRT3 overexpressie leidde tot een verhoging van glycolyse ATP productie (1,4-voudig AGS en 1,6-voudig SGC-7901), terwijl SIRT3 knockdown leidde tot een significante daling van glycolyse ATP productie (20% in AGS en 40% in SGC-7901) in vergelijking met NC of Scr controle.

SIRT3 regelt de homeostase van ROS bij maagkanker cellen

een hoeveelheid bewijs ondersteunt dat verhoogde ROS-niveau is een kritische kenmerk in kankercellen, die kankercellen gevoeliger voor aanvullende ROS spanning [34] maken. Hier hebben wij overexpressie van SIRT3 daalde ROS levels tot 70% en 80% in AGS en SGC-7901 cellen, terwijl remming van SIRT3 expressie verhoogde ROS levels (1,4-voudig AGS cellen en 1,6-voudig SGC-7901-cellen) respectievelijk (figuur 5A en 5B). In overeenstemming met de literatuur blijkt SIRT3 deacetylates en activeert MnSOD (11, 12), bij maagkanker cellen, MnSOD activiteit werd versterkt door SIRT3 overexpressie (1,4-voudig in AGS cellen en 1,2-voudig in SGC-7901-cellen), maar verminderd met SIRT3 knockdown (50% in AGS cellen en 65% in SGC-7901-cellen) (figuur 5C en 5D), hetgeen suggereert dat SIRT3 cellen tegen oxidatieve stress geïnduceerde schade beschermen door evenwicht brengen intracellulaire ROS door het verbeteren MnSOD activiteit bij maagkanker cellen.

SIRT3 deacetylates en activeert LDHA

LDHA speelt een belangrijke rol in de tumor initiatie, het onderhoud en de progressie. Remming van LDHA activiteit blokken tumorgeniciteit en progressie van de tumor [26,27] en LDHA activiteit kan worden gereguleerd door acetylatie /deacetylering wijziging [35]. We vroegen ons af of SIRT3 betrokken is bij de regulatie van LDHA activiteit. We vonden dat, bij maagkanker cellen LDHA activiteit significant verhoogd SIRT3 overexpressie cellen, terwijl in SIRT3 knockdown cellen verminderd in vergelijking met NC of Scr controlecellen afzonderlijk zonder detecteerbare verandering in LDHA eiwitgehalte in de stabiele transfectanten (figuur 6A). Immunokleuring resultaten toonden dat LDHA en SIRT3 werden tezamen gelokaliseerd in het cytoplasma (figuur 6B), en co-IP analyse met ofwel LDHA of SIRT3 antilichaam bleek dat SIRT3 kan samenwerken met LDHA (figuur 6C). Bovendien is het niveau van acetylering LDHA verlaagd in SIRT3 overexpressie cellen maar steeg in SIRT3 knockdown cellen (figuur 6D). Verder in vitro
LDHA activiteit test uitgevoerd met commerciële humane recombinante SIRT3 en runderhart L-lactaatdehydrogenase aangegeven dat LDHA activiteit werd verhoogd met de aanwezigheid van SIRT3 in het reactiemengsel, dat werd omgekeerd door toevoeging van remmer SIRT3 nicotinamide (figuur 6E). Om potentiële SIRT3 deacetylering site (s) op LDHA identificeren, zochten we database en vond dat K5, K14, K57, K81, K118, K126, K222 en K318 zijn potentiële acetylering plaatsen van LDHA en eerdere studie gemeld dat K5 acetyleren /deacetylering was betrokken bij de regulatie van LDHA activiteit [35]. Daarna deden we LDHA activiteit test met behulp van lysine 5 en lysine 318 acetylering mimic (K5Q /K318Q) of deacetylering mimic (K5R /K318R) mutant LDHA, en vond dat noch K5 noch K318 nodig was voor-SIRT3 gemedieerde LDHA activering (S3 figuur). Verdere identificatie van SIRT3 gemedieerde LDHA deacetylering in nood.

SIRT3 upregulates genen die betrokken zijn bij de celstofwisseling

Om de moleculaire ondertekening van SIRT3-LDHA gemedieerde bio-energetica bij maagkanker cellen te karakteriseren, we meten de expressie van genen geassocieerd met glucose transport en glycolyse. Gegevens in Figuur 7A en 7B aangetoond dat overexpressie van SIRT3 in AGS of SGC-7901 induceerde de expressie van HK2 (1,47-voudig AGS cellen 1,3-voudig SGC-7901 cellen), MCT4 (2,3-voudig AGS cellen, 1,34 -voudige in SGC-7901-cellen) en GLUT1 (1,55-voudig AGS cellen, 1,38-voudig SGC-7901 cellen) op mRNA-niveau getest door real-time PCR. Integendeel, SIRT3 knockdown verminderde de expressie van gen HK2 tot 76%, MCT4 tot 73% en GLUT1 tot 62% in AGS cellen terwijl HK2 tot 80%, MCT4 tot 62% en GLUT1 tot 74% in SGC-7901 cellen. Bovendien, als SIRT3 werd overexpressie MCT1 mRNA-niveau werd in AGS cellen met 1,6-voudig, maar niet in SGC-7901 cellen, en wanneer SIRT3 werd knockdown werd MCT1 verlaagd tot 59% in AGS en 65% in SGC-7901-cellen , respectievelijk.

Discussie

Deze studie levert het bewijs dat SIRT3 uitgedrukt in sommige kankercellen, zoals maagkanker cellen, kunnen worden gekoppeld aan de verhoogde agressiviteit by-SIRT3 gemedieerd bio-energetica via deacetylering en activering van LADH. Hoewel accumuleren bewijs geeft aan dat SIRT3 speelt een belangrijke rol bij de bescherming van normale cellen tegen veroudering en maligne transformatie, de functie reeds getransformeerde cellen zoals tumorcellen die expressie SIRT3 onderzocht moet worden [19]. Gebrek aan SIRT3 in MEFs leidt tot genomische instabiliteit en een hoge frequentie van celtransformatie gemedieerd door Ras met een verhoogde graad van tumorvorming en veroudering, wat suggereert dat SIRT3 noodzakelijk is preventie van cellulaire veroudering en kanker [11,15]. Bovendien wordt geen of lagere expressie van SIRT3 gedetecteerd in verschillende menselijke kankers en SIRT3 niveau wordt geassocieerd met de gevoeligheid van kankercellen op chemo- en radiotherapie [11,15,16]. Echter SIRT3 ook weergegeven worden tot overexpressie gebracht in humane kankers en gekoppeld aan therapieresistentie [19,21,36]. Deze resultaten suggereren dat SIRT3 verschillende eiwitten tussen normale en kankercellen kunnen gericht, en dat SIRT3 expressie kan op verschillende typen kanker, zoals de huidige resultaten wijzen dat de intestinale type maagkanker drukt een hoger SIRT3 dan het diffuse worden gevarieerd type maagkanker.

het is algemeen aanvaard dat tumorcellen meer cellulaire energie verbruiken om de snelle groei en proliferatie dan normale cellen via glycolyse als de belangrijkste bron van ATP productie plaats van oxidatieve fosforylering ondersteunen [24] . In de huidige studie hebben we aangetoond dat, bij maagkanker cellen, SIRT3 wisselwerking met en deacetylates LDHA, waardoor verhoogde LDHA activiteit; en SIRT3 overexpressie leidt tot een verhoogde cellulaire ATP productie en MnSOD activiteit gepaard met een verminderde cellulaire ROS-niveau, wat wijst op een verhoogde oxidatieve scavenger vermogen van SIRT3 eventueel via-deacetylering gemedieerde MnSOD enzym activering. Toenemende aanwijzingen dat SIRT3 nodig voor het behoud van cellulaire en mitochondria homeostase reguleren door middel mitochondriën en cellulaire metabolisme redoxbalans systeem beschermt cellen tegen oxidatieve stress via regulering ROS generatie kritisch mechanisme bij veroudering, kanker en hartziekten [1,2, 37]. SIRT3 kan een groep van mitochondria doelwitten betrokken bij de regulering van zowel de glycolyse en cellulaire oxidatieve stress deacetyleren. Onlangs SIRT3 blijkt kunnen deacetyleren en verhoging pyruvaat dehydrogenase activiteit in kankercellen, die zowel mitochondriale bio-energetica en glycolyse [38] kan verhogen. Overeenstemmen, worden de huidige studie geeft aan dat SIRT3 kunnen deacetyleren en LDHA die kunnen worden gebruikt voor zowel mitochondriale ademhaling en glycolyse activeren. Anderzijds kunnen SIRT3 deacetyleren vervolgens activeren mitochondria andere substraten, zoals MnSOD [11,12], Foxo3 [39] en IDH2 [9] te vangen ROS geproduceerd door oxidatieve fosforylering, beschermt de cellen tegen oxidatieve schade [40] . Ook in overeenstemming met deze bevindingen, in deze studie, vonden we dat overexpressie van SIRT3 verhoogt MnSOD activiteit, die een van de redenen van verminderde cellulaire ROS-niveau onder verscherpt celstofwisseling voorwaarde zou kunnen zijn.

LDHA, als gezinslid van lactaat dehydrogenase (LDH), het staat bestond glycolytische cellen en mitochondriën gelokaliseerd naast het cytosol [41], en met name het katalyseren van de onderlinge omzetting van pyruvaat en lactaat [42]. LDHA is aangetoond dat het een belangrijke rol spelen in de aërobe glycolyse en tumorgeniciteit in kwaadaardige cellen [26,27]. In kankercellen, LDHA snel verbruikt pyruvaat door glycolytische weg, wat leidt tot verhoogde aërobe lactaatproductie [26]. Remming van LDHA induceert ROS productie, vermindert cellulaire ATP niveaus en remt glycolyse derhalve remt celgroei en triggers celdood bij kanker [27]. Bestaande uit deze rapporten, vonden we dat SIRT3 kunnen communiceren en activeer LDHA. In de SIRT3 overexpressie cellen werd LDHA acetylering af met een verhoogde LDHA enzymactiviteit. Hoewel de exacte mechanisme waardoor SIRT3-gemedieerde LDHA regeling moet verder worden onderzocht, tonen deze resultaten aan dat LDHA gecontroleerde glycolyse route die tumor bio-energetica versnelt kan worden beïnvloed door SIRT3 expressie.

Onze huidige studie is ook gebleken dat de expressie van een groep van genen, zoals MCT1, MCT4, HK2 en GLUT1, bekend als belangrijke regulatoren van energiemetabolisme bij kanker zijn ook verhoogd in SIRT3 overexpressie maagkanker cellen, waaruit een mogelijke rol van SIRT3 het vergroten glycolyse in tumorcellen. HK2 katalyseert fosforylering van glucose naar glucose-6-fosfaat bij de eerste stap van de glycolyse [43]. Glucose transporter (GLUT) bestuurt het transport van glucose in de plasmamembraan, functioneren als de eerste snelheidsbepalende stap voor glucosemetabolisme [44]. MCT1 en MCT4, leden van monocarboxylaten (zoals lactaat en pyruvaat) transporter familie, zijn ook betrokken bij de groei van glycolyse tumoren [45]. Samen vormen deze resultaten suggereren een mogelijke wisselwerking tussen SIRT3 en een groep van glycolyse geassocieerde genen in het signaleren tumor agressieve groei, die verder moet worden onderzocht.

Tot slot, hoewel SIRT3 is goed gekarakteriseerd in het mitochondriaal homeostase tegen cel veroudering en transformatie wordt expressie van SIRT3 in tumorcellen gekoppeld aan verhoogde proliferatie en agressieve groei van maagkanker cellen. SIRT3 wisselwerking LDHA en activeert, wat leidt tot verhoogde glycolyse en ATP productie, die samen met een verhoogde mitochondriale MnSOD antioxidant activiteit en verminderde intracellulaire ROS-niveau (een hypothetische model wordt voorgesteld in figuur 7C). Zo is de groei stimulerende functie van SIRT3 toont een potentieel doelwit om tumoren met SIRT3 expressie te behandelen.

Ondersteunende informatie
S1 Fig. Vertegenwoordiger pathologische dia's voor het bepalen van de SIRT3 expressie in menselijke maagkanker exemplaren. Hotels A, in paraffine ingebedde menselijke maagkanker en gekoppeld aangrenzende pathologisch normaal weefsel monsters werden onderworpen aan immunohistochemie kleuring met SIRT3 antilichaam (bruin), gevolgd door kernen tegenkleuring met hematoxyline ( blauw, elke tumor werd getoond met aangrenzende normale weefsels in een rij met 20 × en 40 ×). B, representatieve beelden van SIRT3 expressie in de darm en diffuse vormen van maagkanker. Schaal bar, 50 um
doi:. 10.1371 /journal.pone.0129834.s001
(TIF)
S2 Afb. Overexpressie van SIRT3 bevorderd tumorlast in vivo.
SGC-7901 cellen met overexpressie SIRT3 (A) of knockdown (B) werden subcutaan geïnjecteerd in de rechterflank van muizen met naakt relatieve controlecellen (NC of Scr) in de linker flank. Xenograft tumoren werden uitgesneden en gewogen op de 28e dag na cel-inoculatie. Afbeeldingen rechterpaneel toonde xenograft tumoren in vivo aan het einde van het experiment. Afbeeldingen toonde tumorgroei in muizen
doi:. 10.1371 /journal.pone.0129834.s002
(TIF)
S3 Fig.

• PLoS: lymfekliermetastase een unieke onafhankelijke prognostische factor in Early Gastric Cancer
• PLoS ONE: Identificatie en karakterisering van CXCR4-positieve maagkanker Stem Cells