PLoS ONE: SIRT3 Poboljšava Glikolizu i proliferacija u rak želuca Cells

Sažetak pregled

SIRT3 SIRT3-Izražavajući je ključni NAD ^{+ - ovisna protein deacetilaze u mitohondrijima stanica sisavaca, koji djeluje i kako bi se spriječilo starenje stanica i transformacija putem regulacije mitohondrijske metaboličke homeostaze. Međutim, SIRT3 također pronađena izraziti u nekim humanim tumorima; njegova uloga u tim SIRT3 koje eksprimiraju tumorske stanice treba razjasniti. Ovo istraživanje je pokazalo da je ekspresija SIRT3 je povišen u grupi želuca stanica raka želuca u odnosu na normalne stanice epitela. Iako SIRT3 razinama su povećani u tumorskim tkivima želuca u odnosu na susjedne ne-tumorskih tkiva, SIRT3 pozitivnim stanicama su češće otkrivene u probavnom tipa želučanog karcinoma nego želučanog karcinoma difuzni tip, što znači da SIRT3 je povezan s podtipovima želuca Rak. Pojačanom ekspresijom SIRT3 promovira staničnu proliferaciju i poboljšanu ATP generacije, unos glukoze, stvaranje glikogena, aktivnost MnSOD i laktat proizvodnje, koji se inhibira SIRT3 obaranje, što ukazuje da SIRT3 igra ulogu u reprogramiranje bioenergetiku u želučanom tumorskih stanica. Daljnja analiza pokazala je da SIRT3 interakciji sa i deacetira na laktat dehidrogenaze A (LDHA), ključna proteina u regulaciji anaerobnu glikolizu, pojačavaju aktivnost LDHA. U konzistencije, grozd gena glikolize povezane su reguliran u na SIRT3-ekspresijom želuca tumorskih stanica. Tako, pored dobro dokumentiranog SIRT3 posredovanog mitohondrijske homeostaze u normalnim stanicama, SIRT3 može poboljšati glikolizu i proliferaciju stanica u SIRT3 koje eksprimiraju stanice raka pregled}

Izvor. Cui Y, Qin L, Wu J, Qu X, Hou C Sun W, et al. (2015) SIRT3 Poboljšava glikolize i razmnožavanje u SIRT3-Izražavajući Želučani stanica raka. PLoS ONE 10 (6): e0129834. doi: 10,1371 /journal.pone.0129834 pregled

Urednik: XiangLin Shi, Sveučilište u Kentuckyju, SAD pregled

Primljeno: 16. travnja 2015. godine; Prihvaćeno: 13. svibnja 2015; Objavljeno: 29. lipanj 2015 pregled

Copyright: © 2015 Cui i sur. Ovo je otvoreno pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan pregled

Podaci Dostupnost: sve relevantne podatke su u radu i njegove popratne podatke datoteka pregled

Financiranje:. Ova studija je djelomično podržan od strane Nacionalne zaklade prirodoslovni Kine, ključ program (30930105), Nacionalni 12-5 Podrška plan projekta Ministarstva znanosti i tehnologije Kine (2012BAH30F03), Nacionalna zaklada za znanost Prirodni Kina (31070740) je 985 i 211 Projekti Xi'an Jiaotong (JKL), te u National Cancer Institute Ro1 grant CA152313-01-A1 (JJL).

u konkurenciji interese. autori su izjavili da ne postoje suprotstavljeni interesi pregled

Uvod pregled

Sirtuins, obitelj NAD ^{+ - ovisni histon deacetilaze (HDACs) u sisavaca stanice su uključeni u cijelom nizu fizikalnih procesa, uključujući staničnom preživljavanju, apoptozi, metabolizam odgovora na stres, starenja i dugovječnosti [1,2]. Među sedam članova (sirtuin SIRT1-7), SIRT3 je najbolje karakterizira mitohondrijskog sirtuin, radi reguliranja mitohondrijske proteine ​​uključene oksidativne fosforilacije, oksidaciju masnih kiselina, urea ciklusa, i antioksidanta odgovora [2-9]. Nekoliko studija je naglasio ulogu SIRT3 u metabolizmu i održavanju homeostaze u normalnim stanicama i otkrio nove ciljeve i supstrati za SIRT3 ovisan deacetilacije [10]. Kim i suradnici objavili da SIRT3 ključni mitohondrija protein i nedostatak ekspresije SIRT3 je povezan s povećanim oštećenja mitohondrijske DNA i starenja, kao što je povećani potencijal za Ras inducirane transformacije stanica i SIRT3 posredovane aktivacije MnSOD doprinosi mitohondrija homeostaze [11,12]. Kao potpora, humane embrionalne stanice bubrega 293, (HEK293) stanice pokazuju povećanu ekspresiju SIRT3 oksidacijski stres, što dovodi do deacetilacije i aktivaciju MnSOD [13]. SIRT3 se vjeruje da djeluje kao gen supresor tumora i igra ključnu ulogu u jačanju staničnog homeostazu protiv starenja i karcinogeneze. Pregled}

Međutim, neke tumorske stanice pokazuju ekspresiju SIRT3 i potencijalnu ulogu SIRT3 u tim stanicama tumora , a posebno njegov potencijal odnos s agresivnim fenotipa, bila kontroverzna [14]. SIRT3 izraz niži ili nedetektabilna kod različitih humanih karcinoma, uključujući karcinom dojke, glioblastom, rak debelog crijeva, te osteosarkom, prostate i jajnika [11,15,16]. SIRT3 inducira zaustavljanje rasta i apoptozu selektivnom odsutnost Bcl-2 u HCT116 stanica putem moduliranja JNK2 signalnog puta [17]. Također, SIRT3 je izvijestio da doprinose povećanju osjetljivosti humanih stanica leukemije u kemoterapiji eventualno indukcijom mitohondrija posredovane apoptoze [18]. S druge strane, ekspresija SIRT3 također pronađen povećati oralni karcinom, čvor pozitivnih karcinoma dojke, karcinoma jednjaka, i karcinoma štitnjače; a povećana SIRT3 je povezana s višim maligni fenotip i silazni SIRT3 povećava osjetljivost tumora na liječenje protiv raka [19-23]. Ovi rezultati upozoravaju drugačiju ulogu SIRT3 u pojedinim tumorima koje treba razjasniti. Pregled

Stanice raka su metabolički aktivne i troše više stanični goriva od normalnih stanica. Međutim stanice raka relej na uglavnom na sintezu ATP aerobnom glikolize, značajka poznat kao Warburg efekt [24]. Takav aerobna glikoliza se vjeruje da štiti stanice raka se formira oksidativnog stresa jer mitohondrijska disanje je glavni izvor intracelularne ROS [25]. Laktatni dehidrogenaze A (LDHA) je enzim kontroliranje interkonverziju između piruvat i L-laktat reverzibilno na završnom koraku anaerobnu glikolizu [26]. Inhibicija LDHA smanjuje tumore potencijal s povećanom potrošnjom kisika mitohondrijske i smanjena mitohondrijsku membranu potencijalnu [26], a ukupna stanična ATP proizvodnje i glikoliza [27]. Pregled

U ovoj studiji ispitivali smo potencijalnu ulogu SIRT3 u želučanom stanice raka koje eksprimiraju SIRT3. Ekspresija SIRT3 je povezan s agresivnim rastom, koji je posredovao SIRT3-deacetilirane i aktivnim LDHA, povećanje glikolizu i izražavanje skupini gena glikolize povezane. Tako SIRT3-LDHA posredovan glikoliza metabolizam može biti potencijalni terapijski cilj za liječenje raka stanice koje izražavaju SIRT3. Pregled

Materijali i metode pregled

Stanične linije i kulture pregled

Ljudski rak želuca stanične linije MGC-803, HGC-27, SGC-7901 [28] i AGS [29] i besmrtna humana stanična linija epitelnih stanica želučane GES-1 [30] održavane su u RPMI-1640 mediju (Invitrogen), nadopunjenim s 10% fetalnog goveđeg serum i 1% penicilin /streptomicina, i uzgajane pri 37 ° C, u atmosferi 5% CO2. pregled

Imunoprecipitacija i western blot pregled

Podsrasli stanice su lizirane i lizati su inkubirani s proteinom a /G zrnca plus preporučena količina antitijela protiv bilo SIRT3 (Cell Signaling Technology) ili LDHA (Santa Cruze) na 4 ° C preko noći. Uzorci su centrifugirani i razdvojeni pomoću SDS poliakrilamid gel elektroforezom i elektroblotiran na nitroceluloznim membranama. Nakon blokiranja sa 5% bezmasnim mlijekom u TBST, membrane su bile inkubirane s primarnim antitijelom na 4 ° C preko noći, nakon čega je uslijedila inkubacija sa sekundarnim protutijelom tijekom 1 sata na sobnoj temperaturi. Proteini od interesa su vizualizirani ECL detekciju kit (Thermo Fisher). Pregled

Imunohistokemijska analiza pregled

Patološke stakalca raka želuca sa susjednim normalnim tkivima su analizirani su imunohistokemijski ispitivanju su izvedeni u skladu s uputama proizvođača. Polimer Detection Kit za analizu imunohistokemijske je kupljen od Zhongshan Golden Bridge biotehnologiju. Ukratko, parafinske sekcije su odvoštiti i re-hidrat u etanolu (100%, 90% i 75%). Sekcije su inkubirane s 3% H _{2O 2 na sobnoj temperaturi 10 minuta, a zatim blokirane s neimunim kozjim serumom na sobnoj temperaturi 15 minuta. Sekcije su zatim inkubirane s primarnim protutijelom na SIRT3 (Cell Signaling Technology) tijekom 2 sata na sobnoj temperaturi, nakon čega slijedi inkubacija anti-kunić sekundarnim antitijelom tijekom 15 minuta na sobnoj temperaturi. Sekcije su zatim inkubirane s DAB reagens za otkrivanje 2 minute svaki, negativno hematoksilinom i dehydraded u etanolu (90% do 100%). Rezovi su montirani i analizirana je i bojenje pod mikroskopom.}

plazmida građevinske i stanica transfekcije

SIRT3 cijela dužina cDNA sintetizirani primjenom RT-PCR ukupne RNA ekstrahirane iz GES-1 stanice su predloška (primeri: 5 'CCGCGGTACCATGGCGTTGTGGGGTTG 3' i 5 'CCGCTCTAGACTATTTGTCTGGTCCATCAAGC 3'). CDNA je zatim kloniran u pcDNA3.1 + ekspresijski vektor (Invitrogen). PGPH1 /GFP /neo-SIRT3-shRNA plazmid ciljanje humani SIRT3 (5 'CTTGCTGCATGTGGTTGAT 3') i da upravljački shRNA plazmid dobiveni su od GenePharma. Za dobivanje stabilnih transfektanata, AGS i SGC-7901 stanice su transfektirane pomoću reagens lipofektamin 2000 (Invitrogen) i Stabilni transfektanti su odabrani od 400 u.g /ml G418 (Gibco). Pregled

Stanična proliferacija i clonogenicity test pregled

proliferacije test, stanice su stavljene na ploču s 6 jažica je na 2 x 10 ^{4 stanica /jažici. proliferacija stanica je izračunata u dane 2, 4, 6 i 8 nakon nanošenja na ploču. Za clonogenicity test, stanice su stavljene na ploču s 6 jažica s različitim broj stanica i uzgojene na 14 dana i kolonije su zatim obojeni s kristal violetom, a broj kolonija (> 50 stanica /kolonija) zbrojena slijedeći poznate metode [31]. pregled}

mjerenje glukoze, laktata i glikogen pregled

bez fenol-crvenog medij korišten je da se stanice uzgajaju na ploču s 6 jažica 24 sata, a razine unosa glukoze i laktata generacije mjereni su pomoću testa za glukozu Kit i mliječne kiseline Kit (Jiancheng inžinjering Institute). Relativne vrijednosti su normalizirani na broj stanica u svaku jažicu. Stanična razina glikogena su detektirani pomoću glikogen pribora za ispitivanje (Biovision). Ukratko, 1 × 10 ^{6 stanice su homogenizirane u 200 ul vode na ledu, i homogenati kuha 5 minuta inaktivirati enzime i centrifugira na 13.000 okretaja u minuti tijekom 5 minuta na 4 ° C da bi se uklonio netopljivi materijal. Proizvodnja glikogen izmjerena je vrijednost OD na 570 nm. Pregled}

Mjerenje proizvodnje ATP
mjereni su

Cellular ATP i ROS razine kao što je prethodno opisano [32]. Stanice uzgojene u 6 jažica nakon različitih tretmana, su lizirane i stanični se mjeri ATP nivo s ATP bioluminiscencija Assay Kit (Sigma). Za mjerenje glikolizu posredovanu proizvodnju ATP, stanice su tretirane s 2 uM rotenon 24 sata prije mjerenja. Pregled

Mjerenje ROS generacije pregled

Stanična ROS generacije je analiziran s 5- (i 6) karboksi-2 ', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetat (DCFDA) koja koristi mikroploče spektrometra (Thermo Fisher) na 488 nm /530 nm valne duljine, pregled

MnSOD aktivnost

Stanice uzgojene u 6 jažica ploča se lizira i MnSOD aktivnost određena je WST-8 načina korištenja MnSOD test kit (Beyotime) prema uputama proizvođača. pregled

torn smjeru testovi na miševe pregled

SGC7901 stanice (7.5 x 10 ^{6) SIRT3 prekomjernom ekspresijom ili obaranje su suspendirane u 0.1 ml PBS i inokulirani u obje slabine 5 tjedana starih muških Balb /c atimičnih golih miševa, a 28 og dana nakon inokulacije, kada je maksimalni volumen tumora (~ 1.500 mm 3) postignut je u kontrolnoj skupini, eksperimenti su ukinuti i sve tumora iz svake skupine su izrezani i izvagani. Eksperimentalni postupak koji uključuje testove na životinjama provedena je u skladu s institucionalnim smjernicama; brigu i upotrebu odbor institucionalni životinja (IACUC) na Xian Jiao Tong University posebno odobreni ovu studiju (Protokolx181). pregled}

laktat dehidrogenaze Test pregled

laktat dehidrogenaze aktivnost je određena nakon utvrđenog protokola mjerenjem brzine smanjivanja apsorbancije na valnoj duljini od 340 nm dobivenog s oksidacijom NADH [27]. Ukratko, stanice su uzgojene u posudama od 10 cm i homogenizirane u PBS na ledu. Homogenati su dodani u puferu koji sadrži 6.6 mM NADH, 30 mM natrij piruvata i 0.2 M Tris-HCl, pH 7.3 i miješano. Inkubirajte smjesu za 5 minuta kako bi se postigla temperatura izjednačavanje i zatim snimiti na smanjenje stope apsorpcije na 340 nm.

SIRT3 in vitro pregled deacetiliranja test

Ljudski SIRT3 rekombinantni enzim ( BPS) se inkubira sa L-laktat-dehidrogenaze iz goveđeg srca (Sigma) u reakcijskom puferu (50 mM NaCl, 4 mM MgCl _{2, 10 mM NAD ^{+, 50 mM DTT, 50 mM Tris, pH 8.0) sa /bez inhibitora SIRT3 nikotinamid (Nam, 10 mM) na 37 ° C u trajanju od 1,5 sata, a onda su reakcije koji se koriste za analizu aktivnosti LDHA kao gore opisani. pregled}}

real-time PCR pregled

ukupna RNA izolirana je pomoću Trizol reagensa (Invitrogen), nakon čega slijedi tretiranje s fenol /kloroformom i taloženjem s 2-propanol. Ukupna RNA Talog se zatim ispere s 75% etanola i suspendira u vodi. RNA je podvrgnuta reverzna transkripcija s PrimeScript RT-PCR (Takara) i kvantitativne real-time PCR analize gena od interesa provedena SYBR PremixExTaq II kit (Takara) prema uputama proizvođača. Podaci su normalizirani na razinu y-tubulina. Pregled

Imunofluorescencija pregled

AGS sjemenskih stanica na stakalce u 6 jažica su fiksirane u 4% paraformaldehidu tokom 10 minuta i blokirane u 1% BSA tijekom 1 sata na sobnoj temperaturi. Inkubirati stanice sa primarnim antitijelima protiv SIRT3 i LDHA na 4 ° C preko noći, nakon čega slijedi inkubacija sa fluorescencijom konjugiranih sekundarnih antitijela tijekom 1 sata na sobnoj temperaturi. Counterstaining provodi s pomoću DAPI imunofluorescencije priborom (Beyotime). Stanice su montirana i snimio laserskog skeniranja konfokalne mikroskopom. Pregled

Statistička analiza pregled

Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SE iz najmanje tri neovisna pokusa. Statistička analiza je izvršena sa nespareni dvokrakog Studentovim t testom ukoliko nije drugačije naznačeno. P izvoznici < 0.05 je smatrana značajnom. Pregled

Rezultati pregled

SIRT3 izraz u želučanim stanicama raka pregled

SIRT3 je dobro definirano u reguliranju mitohondrijsku homeostazi u protiv starenja i anti-transformacije. Nedavno, različiti rezultati su prikazani u odnosu na inhibiciju stanične SIRT3 posredovane i proliferaciju, dovodeći do spora njegovih uloga u karcinomima [19,20]. Odrediti potencijalnu ulogu SIRT3 karcinoma želuca, ekspresija SIRT3 otkriven je u 4 želučanim stanične linije raka AGS, SGC-7901, MGC-803, HGC-27 i skupinu želučanih tumora raka tkiva. Otkrili smo da SIRT3 razina proteina je povišena u sva 4 staničnim linijama karcinoma želuca u odnosu na besmrtnih želučanog epitela GES-1 stanice (AGS, 1,9-puta; SGC-7901, 1,5 puta, MGC-803, 2,0 puta, a HGC -27, 1,8 puta u odnosu na GES-1 stanice) (slika 1A). U skladu, razine mRNA SIRT3 u tim staničnim linijama također povećana (AGS, 2,6-struko, SGC-7901, 1,7 puta, MGC-803, 2,5-struko, HGC-27 2,2 puta) u odnosu na GES- 1 stanice (Slika 1B). pregled

Imunohistokemijska analiza u tkivu tumora te susjednim ne-tumorskih normalnog tkiva iz skupine pacijenata s karcinomom želuca pokazali da SIRT3-pozitivne stanice bile su često otkriva u tumorskim tkivima, nego da u normalnim tkivima. Rezultati su pokazali da je 55.1% u tumorskim tkivima (7% od normalnog tkiva) pokazao je visoku razinu (snažan pozitivan), 41.4% tumorskih tkiva (28% od normalnog tkiva) pokazuju srednju visoku razinu (slabo pozitivan), a 3,5% tumora tkiva i 64% normalnog tkiva bio negativan u izrazu SIRT3 (slika 1C i 1D, S1A sl). Zanimljivo, SIRT3 ekspresija u crijevnom tipa tumorskih tkiva (15 slučajeva, 93,3% jaki pozitivni i 6,6% slabo pozitivan) bio je značajno veći nego u difuznom tipa tumorskih tkiva (14 slučajeva, 14,3% jaka pozitivna, 78,6% slabo pozitivnih i 7.1 % negativno) (slika 1C i 1E, S1B sl). Ovi rezultati ukazuju na to da SIRT3 izraz je povećan u nekim tumorima u usporedbi sa srodnim normalnim tkivima i SIRT3 ekspresija može biti razlikuju u pojedinim tumorima, što bi trebalo dodatno istražiti. Pregled

razina SIRT3 su povezane sa staničnom proliferacijom pregled

Nakon toga smo osnovali SIRT3 ekspresiju i obaranje stanične linije pomoću AGS i SGC-7901 stanica. Ekspresija SIRT3 u stabilnim transfektanta je potvrđeno Western blot. Pojačanom ekspresijom SIRT3 povećava rast stanica, a SIRT3 obaranje inhibira rast stanica obaju staničnih linija raka želuca (Slika 2A). Nadalje, pojačanom ekspresijom SIRT3 pokreću više nastanak kolonija od kontrolnih transficirana stanica koja je bila u suprotnosti sa samo manjim kolonijama formirana u SIRT3 obaranje stanica (Slika 2b). Pregled

Kako bi se dodatno utvrditi ulogu SIRT3 u tumorske tvorbe sposobnosti, mi ubrizgava SIRT3 ekspresiju i obaranje SGC-7901 stanica u bokovima golim miševima i rast tumora je dozvoljeno 28 dana nakon inokulacije stanicama (S2 sl). Prosječna težina tumora dobivenih od SIRT3 ekspresijom stanica bila 0.7079g, znatno veći od prosječne težine tumora kontrole (NC), p pregled = 0,015, (Slika 2C, lijevi prikaz). Za razliku od toga, prosječna težina tumora dobivenih od SIRT3 obaranje stanica je 0.0588g, znatno manja od one iz otimati stanica shRNA kontrole (SCR) (0.2033g; p pregled = 0,009) (Slika 2C, donji dio) , Prosječni volumen tumora dobivenih od SIRT3 ekspresijom stanica je povećan od one iz kontrolnih stanica (NC) (Slika 2C, lijevi panel gore desnom kutu). Naprotiv, kad je volumen tumora raste iz SIRT3 obaranje stanica je dramatično malen u usporedbi s onom iz kontrolnih stanica (SCR) (slika 2c, desna ploča gore desni kut). Pregled

Poboljšana glikoliza u SIRT3 izražavanja raka želuca stanice

zatim su pitali kako stanični bioenergetika može se mijenjati u želučanim stanicama raka SIRT3-ekspresijom. SIRT3 prekomjerna ekspresija dramatično povećan unos glukoze (1,4-puta u AGS i 1.9 puta u SGC-7901), dok je SIRT3 obaranje smanjen unos glukoze (oko 40% u oba AGS i SGC-7901) (Sl 3A i 3B). U skladu sa uzorkom korištenja glukoze, SIRT3 s prekomjernom ekspresijom stanice je povećana razina laktata lučenjem (1.2 puta u AGS i 1,3 puta u SGC-7901), dok SIRT3 obaranje stanice je smanjena razina laktata lučenja (55% u AGS i 45 % u sGC 7901) (slika 3C i 3D). Također smo otkrili da je formiranje glikogena se znatno povećati SIRT3 prekomjernom ekspresijom (1,5 puta u AGS i 1,3 puta u SGC-7901), značajka brzog rasta tumorskih stanica [33], dok je smanjen za SIRT3 obaranje (40% u AGS i 70% u SGC-7901) (Sl 3E i 3F). pregled

SIRT3 je dokazano uključen u deacetilacije globalnih metabolizma enzima i održavanje bazalne razine ATP u stanicama i u normalnim uvjetima, a kod bolesti [1 , 2]. Ukupna stanična ATP i glikoliza ATP generacije otkrivene su u AGS i SGC-7901 ćelije samo s SIRT3 prekomjernom ekspresijom ili SIRT3 obaranje. Ukupna stanična ATP razine su povećani u SIRT3 ekspresijom stanicama (oko 1,3 puta u obje stanične linije), ali je smanjen u SIRT3 obaranje stanicama (oko 75% u obje stanične linije) u odnosu na NC ili SCR kontrolnim stanicama (Slika 4a i 4b) , Onda smo tretirani stanica s rotenon da inhibira oksidativnu fosforilaciju, a testirani ATP energije iz glikolize. Kao što je prikazano na Slici 4C i 4D, SIRT3 hiperekspresija dovelo do povećanja proizvodnje glikolize ATP (1,4-puta u AGS i 1,6 puta u sGC 7901), dok je SIRT3 obaranje dovela do značajnog smanjenja u proizvodnji glikolize ATP (20% u AGS i 40% u SGC-7901) u odnosu na NC ili SCR kontrolom. pregled

SIRT3 regulira homeostazu ROS u želučanih stanica raka pregled

više dokaza podupire da je povećana ROS razina je kritična karakteristika u stanicama raka, koje čine stanice raka osjetljivije na dodatni ROS stresom [34]. Ovdje smo otkrili da je prekomjerna ekspresija SIRT3 smanjena razina Ros 70% i 80% u AGS i SGC-7901 stanice, dok inhibicija SIRT3 ekspresije povećana razina ROS (1,4-puta u AGS stanicama i 1,6 puta u SGC-7901 stanica), respektivno (Slika 5A i 5B). U dogovoru s literaturi pokazuje SIRT3 Deacetilati i aktivira MnSOD (11, 12), u želučanim stanicama raka, MnSOD aktivnost je pojačana SIRT3 prekomjernom ekspresijom (1,4 puta u AGS stanicama i 1.2 puta u SGC-7901 stanica), ali je smanjen za SIRT3 obaranje (50% u AGS stanica, a 65% u SGC-7901 stanice) (Slika 5c i 5d), što upućuje da SIRT3 štiti stanice od oksidativnog oštećenja stresom inducirane rebalans unutarstaničnog ROS kroz povećanje aktivnosti MnSOD u želučanim stanice raka.

SIRT3 deacetilati i aktivira LDHA pregled

LDHA igra ključnu ulogu u pokretanju tumora, održavanje i napredovanje. Inhibicija LDHA aktivnosti blokovi torn smjeru i progresiju tumora [26,27] i aktivnosti LDHA može regulirati acetiliranje /deacetiliranja modifikacije [35]. Pitali smo se da li SIRT3 je uključen u regulaciju aktivnosti LDHA. Otkrili smo da, u želučanim stanicama raka, LDHA aktivnost bila je značajno povećana u SIRT3 ekspresijom stanica, dok je smanjena u SIRT3 obaranje stanica u odnosu na NC ili Scr kontrolnih stanica zasebno bez mjerljivim promjenama LDHA razine proteina u stabilnih transformanti (Slika 6a). Imunobojanje Rezultati su pokazali da LDHA i SIRT3 su lokalizirani u citoplazmi (slika 6b), te ko-IP analiza s bilo LDHA ili SIRT3 antitijela pokazala je da SIRT3 je u stanju komunicirati s LDHA (Slika 6c). Osim toga, razina LDHA acetilacije smanjena u SIRT3 ekspresijom stanicama, ali su porasli u SIRT3 obaranje stanicama (Slika 6D). Nadalje, in vitro pregled LDHA ispitivanje aktivnosti provedena koristeći komercijalni humanog rekombinantnog SIRT3 i goveđeg srca L-laktat-dehidrogenaze naznačeno da LDHA aktivnost povećana uz prisustvo SIRT3 u reakciji, koja je reverzibilna na dodatak inhibitora SIRT3 , nikotinamid (Slika 6E). Kako prepoznati potencijalnog SIRT3 deacetilaciju stranice (e) na LDHA, tražili smo bazu podataka i otkrili da K5, K14, K57, K81, K118, K126, K222 i K318 su potencijalni acetilacije nalazišta LDHA, kao i prethodna studija je izvijestio da K5 acetilacija /deacetiliranja je uključen u regulaciju LDHA aktivnosti [35]. Onda mi je LDHA ispitivanje aktivnosti pomoću lizin 5 i lizin 318 acetilacijski oponaša (K5Q /K318Q) ili deacetilaciju imitacija (K5R /K318R) mutant LDHA, i utvrdili da ni K5, niti K318 je potreban za SIRT3 posredovan aktivacijom LDHA (S3 sl). Daljnja identifikacija SIRT3 posredovane LDHA deacetilacije je u potrebi. Pregled

SIRT3 regulira povišenje gene koji su uključeni u stanični metabolizam Netlogu

Kako bi okarakterizirali molekularni potpis posreduju bioenergetici SIRT3-LDHA u želučanih stanica raka, mjerili smo ekspresija gena povezanih s prijevozom glukoze i glikolize. Podaci na slici 7A i 7B su pokazali da prekomjerna ekspresija SIRT3 u AGS ili SGC-7901 inducira ekspresiju HK2 (1.47-puta u AGS stanica, 1,3-puta u SGC-7901 stanica), MCT4 (2,3 puta u AGS stanicama, 1.34 strukoj u SGC-7901 stanica) i Glut1 (1.55-puta u AGS stanicama, 1.38-puta u SGC-7901 stanice) na razini mRNA testirana pomoću real-time PCR. Naprotiv, SIRT3 obaranje smanjio ekspresiju gena HK2 76%, MCT4 do 73%, a Glut1 do 62% u AGS stanicama, dok HK2 80% MCT4 do 62%, a Glut1 do 74% u SGC-7901 stanice. Osim toga, kada SIRT3 je prekomjerno izražen, MCT1 mRNA razini je povećan u AGS stanicama za 1,6 puta, ali ne u SGC-7901 stanica, a kada SIRT3 je obaranje, MCT1 je smanjen na 59% u AGS i 65% u SGC-7901 stanica , respektivno. pregled

Rasprava pregled

Ova studija daje dokaze iz kojih proizlazi da je SIRT3 izražen u nekim stanicama raka, kao što su želučani stanica raka, može biti povezana s pojačanom agresivnošću po SIRT3 posredovane bioenergetici preko deacetilacije i aktiviranje LADH. Iako gomilaju dokazi pokazuju da SIRT3 igra ključnu ulogu u zaštiti normalnih stanica protiv starenja i maligne transformacije, njegova funkcija u već transformiranih stanica kao što su tumorske stanice koje izražavaju SIRT3 treba istražiti [19]. Nedostatak SIRT3 u MEFs dovodi do genomske nestabilnosti i visoke frekvencije transformacije stanica posredstvom Ras s povećanom stopom od nastajanja tumora i starenja, sugerirajući da SIRT3 je nužno u prevenciji staničnog starenja i karcinogeneze [11,15]. Osim toga, nedostatka ili niža ekspresija SIRT3 je otkriven u nekoliko humanih karcinoma, a razina SIRT3 povezana s osjetljivošću stanica raka na kemo- i radioterapiju [11,15,16]. Međutim, SIRT3 je također prikazan biti izraženo u ljudskim karcinoma i povezane s otpornošću terapije [19,21,36]. Ovi rezultati ukazuju na to da SIRT3 mogu ciljati različite proteine ​​između normalnih stanica i stanica raka, te da SIRT3 izraz može varirati u različitim vrsta raka, kao što su trenutni rezultati ukazuju da je crijevna vrsta karcinoma želuca izražava višu razinu SIRT3 nego difuzne vrsta raka želuca. pregled

to je općenito prihvaćeno da tumorske stanice troše više stanične energije kako bi podržao brzi rast i proliferaciju od normalnih stanica koje koriste glukozu kao glavni izvor ATP generacije umjesto oksidativne fosforilacije [24] , U ovom istraživanju, pokazali smo da je, u stanicama raka želuca, SIRT3 interakciju i Deacetilati LDHA uzrokujući povećanu aktivnost LDHA; i SIRT3 pretjerana ekspresija dovodi do povećanja staničnih proizvodnju ATP i aktivnost MnSOD paralelno sa smanjenim staničnoj razini ROS, što ukazuje na povećanu oksidativni smetlar sposobnost SIRT3 eventualno preko deacetiliranja posredovan aktivacijom MnSOD enzima. Povećanje dokazi pokazuju da SIRT3 je potrebno za održavanje stanične i mitohondrija homeostazu kroz regulaciju mitohondrija metabolizam i sustav balansa stanični redoks, štiti stanice od oksidativnog stresa putem reguliranja ROS generacije, kritičan mehanizam u starenja, raka i bolesti srca [1,2, 37]. SIRT3 može deacetylate grupu mitohondriji ciljeva upleten u regulaciji oba glikoliza i staničnog oksidativnog stresa. Nedavno, SIRT3 pronađena moći deacetylate i povećati aktivnost piruvat dehidrogenaze u stanicama raka, što može povećati i mitohondrijski bioenergetici i glikolizu [38]. U dogovoru, struja studija pokazuje da SIRT3 može deacetylate i aktivirati LDHA koji se može koristiti i za mitohondrija disanja i glikolize. S druge strane, može SIRT3 deacetylate i potom aktiviraju ostale mitohondrijima supstrate, kao što su MnSOD [11,12], Foxo3 [39] i IDH2 [9] da se ukloni ROS proizveden oksidativne fosforilacije, štiti stanice od oksidativnog oštećenja [40] , Također, u skladu s tim nalazima, u ovom istraživanju, otkrili smo da prekomjerna ekspresija SIRT3 povećava MnSOD aktivnosti, što bi mogao biti jedan od razloga smanjenja staničnoj razini ROS pod pojačanom stanični metabolizam stanju. Pregled

LDHA, kao član obitelji laktata dehidrogenaze (LDH), nalazi postojao glikolitičkih stanice i lokaliziran u mitohondrijima, osim u citosol [41], i uglavnom katalizirati obostrano pretvaranje piruvata i laktata [42]. LDHA je pokazala da igra ključnu ulogu u aerobne glikolize i torn smjeru u malignim stanicama [26,27]. U stanicama raka, LDHA brzo troši piruvata proizveden od glikolize puta, što dovodi do povećane aerobne proizvodnje laktata [26]. Inhibicija LDHA potiče ROS proizvodnju, smanjuje razine staničnog ATP i inhibira glikolizu, stoga inhibira rast stanica i potiče smrt stanica kod raka [27]. Sastoji se s tim izvješćima, otkrili smo da SIRT3 mogu komunicirati i aktivirati LDHA. U SIRT3 s povećanom ekspresijom stanice, LDHA acetiliranje je smanjena s povećanim aktivnost enzima LDHA. Iako točan mehanizam uzrokuje SIRT3 posredovane regulacije LDHA treba dodatno istražiti, ovi rezultati pokazuju da LDHA kontrolom putanje glikolize koji ubrzava tumora bioenergetici može utjecati razinama SIRT3 ekspresije. Pregled

Naš trenutni Studija je također pokazala da je izraz skupina gena, kao što su, MCT1 MCT4, HK2 i Glut1, poznat kao ključni regulatori energetski metabolizam kod raka također povećana u stanicama raka želuca SIRT3-ekspresijom, pokazujući potencijalnu ulogu SIRT3 u jačanju glikolizu u tumorskim stanicama. HK2 katalizira fosforilaciju glukoze u glukoza-6-fosfata u početnom stupnju glikolize [43]. Glukoza transporter (zasićenost) kontrolira transport glukoze preko plazma membrane, funkcionira kao prvi korak određuje brzinu metabolizma glukoze [44]. MCT1 i MCT4 članovi monokarboksilate (kao što su laktat i piruvata) transportni obitelji su također uključeni u rast glikolize-ovisnih tumora [45]. Zajedno, ovi rezultati ukazuju na moguću interakciju između SIRT3 i skupina gena glikolize povezane u signalizaciju tumora agresivnog rasta, koje treba dodatno istražiti. Pregled

Na kraju, iako SIRT3 dobro naznačen time mitohondrijske homeostaze protiv stanici starenje i transformacija, izraz SIRT3 u stanicama tumora povezana s poboljšanom proliferaciju i agresivnog rasta želučanih stanica raka. SIRT3 interakciju i aktivira LDHA, što dovodi do povećanog glikoliza i ATP proizvodnje, koji je zajedno s povećanom mitohondrijske antioksidativnim MnSOD aktivnosti i smanjenog intracelularne razine ROS (a hipotetsko model predložen na slici 7c). Dakle, funkcija rasta stimulaciju od SIRT3 pokazuje potencijalnu metu za liječenje tumora s SIRT3 izražavanja. Pregled

popratne podatke
S1 Sl. Reprezentativni patološke tobogani za određivanje ekspresije SIRT3 u ljudskim uzorcima raka želuca.
A, parafin-ugrađen ljudski rak želuca i upareni susjedne patološki normalne Uzorci tkiva su bili podvrgnuti imunohistokemijske bojom s SIRT3 antitijela (smeđa), nakon čega slijedi jezgre counterstain hematoksilinom ( plava, svaki tumor je prikazan sa susjednim normalnim tkivima u jednom redu po 20 × 40 × i). B, reprezentativni slike SIRT3 izražavanja u probavnom i difuznih oblika raka želuca. Skala, 50 um pregled doi:. 10,1371 /journal.pone.0129834.s001 pregled (TIF) pregled S2 Sl. Prekomjerna ekspresija SIRT3 promovira tumora teret in vivo.
SGC-7901 stanica sa SIRT3 ekspresijom (A) ili obaranje (B) su potkožno ubrizgavaju u desni bok od golih miševa s relativnim kontrolnim stanicama (NC ili SCR) u lijevo bok. Ksenografta tumori su bili odstranjeni i izvagani na 28. dan nakon inokulacije stanica. Slike desnoj ploči pokazali ksenograftima tumora in vivo na kraju pokusa. Slike prikazuju rast tumora u miševa
doi:. 10,1371 /journal.pone.0129834.s002
(TIF)
S3 Sl.

• PLoS ONE: limfnog čvora metastaziranje, a Jedinstveni Samostalni prognostički čimbenik u ranom raka želuca
• PLoS ONE: Identifikacija i karakterizacija CXCR4-pozitivnog raka želuca matičnih stanica