конкурирующие интересы:. авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов
Введение Клеточные линии и культуры иммунопреципитация и вестерн-блот SIRT3 вся кДНК синтезировали с использованием RT-PCR с тотальной РНК, выделенной из ГЭС-1 клеток в качестве шаблон (праймеры: 5 'CCGCGGTACCATGGCGTTGTGGGGTTG 3' и 5 'CCGCTCTAGACTATTTGTCTGGTCCATCAAGC 3'). Затем кДНК клонировали в pcDNA3.1 + вектор экспрессии, (Invitrogen). /GFP /Neo-SIRT3-shRNA плазмиду pGPH1 ориентации человека SIRT3 (5 'CTTGCTGCATGTGGTTGAT 3') и управления shRNA плазмиды были получены из GenePharma. Для создания стабильных трансфектантов, АГС и SGC-7901-клетки трансфицировали с использованием Липофектамин 2000 реагента (Invitrogen) и стабильные трансфектантов были отобраны 400ug /мл G418 (Gibco). Измерение глюкозы, лактата и гликоген MnSOD активность туморогенности анализы в голых мышей Лактатдегидрогеназа анализ Человеческий SIRT3 рекомбинантный фермент ( БПС) инкубировали с L-лактатдегидрогеназы из бычьего сердца (Sigma) в реакционном буфере (50 мМ NaCl, 4 мМ MgCl <суб> 2, 10 мМ НАД +, 50 мМ ДТТ, 50 мМ Трис, рН 8,0) с /без ингибитора SIRT3 никотинамида (NAM, 10 мМ) при 37 ° с в течение 1,5 ч, а затем реакции были использованы для анализа активности LDHA описано выше. ПЦР в реальном времени Выражение SIRT3 в клетках рака желудка SIRT3 регулирует гомеостаз в ROS клеток рака желудка SIRT3 деацетилирует и активирует LDHA Обсуждение
<р> Сиртуины, семейство NAD + - зависимые гистондезацетилаз (HDACs) в млекопитающим клетки, которые участвуют в широком диапазоне физических процессов, в том числе и выживание клеток, апоптоз, метаболизм, реакции на стресс, старение и продолжительность жизни [1,2]. Среди семи Sirtuin членов (SIRT1-7), SIRT3 это лучше всего характеризует митохондриальную Sirtuin, функционирование регулировать митохондриальных белков, участвующих в окислительного фосфорилирования, окисления жирных кислот, цикла мочевины и антиоксидантного ответа [2-9]. Несколько исследований выдвинули на первый план роль SIRT3 в процессах метаболизма и гомеостаза в нормальных клетках и выявили новые цели и субстраты для SIRT3-зависимых дезацетилирования [10]. Ким и др сообщили, что SIRT3 является ключевым митохондрии белков, а также отсутствие экспрессии SIRT3 связано с повышенным повреждений митохондриальной ДНК и старение, а также увеличение потенциала в Рас-индуцированной трансформации клеток и SIRT3-опосредованной активации MnSOD, способствующего митохондриального гомеостаза [11,12]. В поддержку, эмбриональные клетки почки человека 293 (НЕК293) клетки проявляют повышенную экспрессию SIRT3 под окислительным стрессом, что приводит к дезацетилирования и активации MnSOD [13]. SIRT3, как полагают, функционирует как ген-супрессор опухолей и играет ключевую роль в усилении гомеостаза клетки от старения и канцерогенеза.
<Р> Тем не менее, некоторые опухолевые клетки демонстрируют экспрессию SIRT3 и потенциальной роли SIRT3 в этих опухолевых клетках , особенно ее потенциал отношение к агрессивному фенотипу, был спорным [14]. SIRT3 выражение ниже, или невозможно обнаружить в массиве раковых заболеваний человека, в том числе рак молочной железы, глиобластомы, рака толстой кишки, и остеосаркомы, предстательной железы и рака яичников [11,15,16]. SIRT3 вызывает остановку роста и апоптоз за счет селективного глушителей Bcl-2 в клетках HCT116 посредством модулирования JNK2 сигнального пути [17]. Кроме того, SIRT3, как сообщается, способствуют повышению чувствительности клеток лейкемии человека к химиотерапии, возможно, через индукцию митохондрия-опосредованному апоптозу [18]. С другой стороны, выражение SIRT3 встречается также быть увеличена в рак полости рта, лимфоузлов рак молочной железы, рак пищевода, и карцином щитовидной железы; и увеличение SIRT3 связано с более высоким злокачественного фенотипа и понижающей регуляции SIRT3 повышает чувствительность опухоли к лечению противораковой [19-23]. Эти результаты предупредить другую роль SIRT3 в конкретных опухолей, которые необходимо выяснить.
<Р> Раковые клетки являются метаболически активными и потребляют больше топлива, чем клеточное нормальных клеток. Однако раковые клетки передают в основном на синтез АТФ путем аэробного гликолиза, особенность, известный как эффект Варбурга [24]. Такой аэробного гликолиза, как полагают, защищают раковые клетки формируют оксидативный стресс, так как митохондриального дыхания является основным источником внутриклеточной ROS [25]. Лактатдегидрогеназы А (LDHA) представляет собой фермент, контролируя взаимное превращение пирувата и L-лактат обратимо на конечной стадии анаэробного гликолиза [26]. Ингибирование LDHA уменьшает онкогенного потенциала с увеличением митохондриальной потребления кислорода и снижение митохондриального мембранного потенциала [26] и в целом сотовой связи АТФ производства и гликолиза [27].
<Р> В этом исследовании мы изучали потенциальную роль SIRT3 в желудочном раковые клетки, которые выражают SIRT3. Выражение SIRT3 был связан с агрессивным ростом, который опосредуется через SIRT3 дезацетилирующий и активированного LDHA, усиливая гликолиз и экспрессию группы гликолиза-ассоциированных генов. Таким образом, SIRT3-LDHA-опосредованной гликолиза метаболизм может быть потенциальной терапевтической мишени для лечения раковых клеток, которые выражают SIRT3.
Материалы и методы
<р> Человеческий рак желудка клеточные линии МГЦ-803, ТЖК-27, СГК-7901 [28] и АГС [29] и иммортализованные желудка линии эпителиальных клеток человека ГЭС-1 [30] поддерживали в среде RPMI-1640 (Invitrogen), дополненной 10% эмбриональной бычьей сыворотки и 1% пенициллина /стрептомицина, и культивировали при 37 ° с в атмосфере 5% СО2.
<р> Субконфлюэнтные клетки лизируют и лизаты инкубировали с белком а, /G агарозном бусин плюс рекомендуемое количество антител против либо SIRT3 (Cell Signaling Technology), или LDHA (Санта-Крьюз) при 4 ° С в течение ночи. Образцы центрифугировали и разделяли с помощью электрофореза в SDS-полиакриламидном геле и электроблоттингу на нитроцеллюлозные мембраны. После блокирования с помощью 5% молока обезжиренного в TBST, мембраны инкубировали с первичным антителом при 4 ° С в течение ночи с последующей инкубацией с вторичными антителами в течение 1 часа при комнатной температуре. Белки, представляющие интерес, визуализировали с помощью комплекта обнаружения ECL (Thermo Fisher).
Immunohistochemistry анализ
<р> Патологические горок рака желудка с соседними нормальными тканями были проанализированы с помощью иммуногистохимического анализа были выполнены в соответствии с инструкциями изготовителя. Комплект обнаружения Полимер для анализа иммуногистохимии был приобретен у Чжуншань Golden Bridge биотехнологии. В кратком изложении, Парафиновые срезы были депарафинизации и повторной гидратации в этаноле (100%, 90% и 75%). Срезы инкубировали с 3% H <суб> 2O <суб> 2 при комнатной температуре в течение 10 минут, а затем блокировали неиммунного козьей сывороткой при комнатной температуре в течение 15 минут. Срезы затем инкубировали с первичным антителом к SIRT3 (Cell Signaling Technology) в течение 2-х часов при комнатной температуре, после чего анти-кроличьего вторичной инкубации антител в течение 15 минут при комнатной температуре. Затем срезы инкубировали с реагентом для обнаружения DAB в течение 2-х минут каждый, контрастному окрашиванию гематоксилином и dehydraded в этаноле (90% и 100%). Секции были установлены, и окрашивающий анализировали под микроскопом.
строительство Плазмидная и трансфекции клеток
Пролиферация клеток и clonogenicity анализ
<р> Для анализа пролиферации клетки высевают в 6-луночный планшет при 2 х 10 4 клеток /лунку. пролиферации клеток рассчитывали в дни 2, 4, 6, 8 и после нанесения покрытия. Для clonogenicity анализа клетки высевают в 6-луночный планшет с различными количествами клеток и культивировали в течение 14 дней и колонии затем окрашивали кристаллическим фиолетовым, и число колоний (> 50 клеток /колоний) подсчитывали в соответствии с установленными методами [31].
<р> фенол красный свободный среду использовали для культивирования клеток в 6-луночный планшет в течение 24 часов и уровни усвоения глюкозы и лактата поколения измеряли с использованием набора Глюкоза Assay и молочной кислоты Kit (Jiancheng биоинженерии институт). Относительные величины нормированы на число клеток в каждую лунку. Клеточные уровень гликогена были обнаружены с использованием набора для анализа Гликоген (BioVision). Вкратце, 1 × 10 6 клеток гомогенизируют в 200 мкл воды на льду, а гомогенаты кипятили в течение 5 минут, чтобы инактивировать ферменты, и центрифугировали при 13000 оборотах в минуту в течение 5 минут при 4 ° С для удаления нерастворимого материала. Производство гликоген измеряли значения оптической плотности при длине волны 570 нм.
Измерение производства АТФ
уровней <р> Сотовые АТФ и ROS измеряли, как описано ранее [32]. Клетки культивировали в 6-луночный планшет, после различных обработок, лизируют и клеточные уровни АТФ измеряли с АТФ биолюминесценции набора для анализа (Sigma). Для измерения гликолиз-опосредованного производства АТФ, клетки обрабатывали 2 мкМ ротенону в течение 24 часов до измерений.
Измерение генерации активных форм кислорода
<р> поколения сотовой РОС анализировали с 5- (и 6-) карбокси-2 ', 7'-dichlorodihydrofluorescein диацетат (DCFDA) метод с использованием микропланшет-спектрометра (Thermo Fisher) при 488 нм /530 нм.
<р> Клетки культивировали в 6-луночных пластины были лизировали и активность MnSOD определяли с помощью WST-8 методами с использованием набора MnSOD анализа (Beyotime) в соответствии с инструкциями изготовителя.
<р> SGC7901 клетки (7,5 х 10 6) с SIRT3 избыточной экспрессии или нокдауна суспендировали в 0,1 мл PBS и инокулировали в фланг 5-недельных самцов мышей BALB /C бестимусных голых мышей, и на 28 й день после посева, когда объем максимальной опухоли (~ 1500 мм 3) достигается в контрольной группе, опыты были прекращены, и все опухолей из каждой группы были вырезаны и взвешены. Методика эксперимента с участием испытаний на животных было проведено в соответствии с ведомственным руководящим принципам; по уходу и использованию животных Институциональный комитет (IACUC) в Сиане Jiao Tong University специально одобрил это исследование (протоколx181).
<р> Лактат определяли активность дегидрогеназы в установленном протоколе путем измерения скорости уменьшения оптической плотности при длине волны 340 нм в результате окисления NADH [27]. В кратком изложении, клетки культивировали в 10-см чашки и гомогенизируют в PBS на льду. Гомогенаты были добавлены в буфере, содержащем 6,6 мМ НАДН, 30 мМ пирувата натрия и 0,2 М Трис-HCl, рН 7,3, и перемешивают. Выдержите смесь в течение 5 минут для достижения уравновешивания температуры, а затем записать снижение скорости поглощения при длине волны 340 нм.
SIRT3 в пробирке
деацетилирования анализ
<р> Общую РНК выделяли с использованием тризола реагента (Invitrogen) с последующей обработкой смесью фенол /хлороформ и осаждения с помощью 2-пропанола. Общую РНК осадок затем промывали 75% -ным этанолом и ресуспендировали в воде. РНК подвергали обратной транскрипции с PrimeScript RT-PCR Kit (Takara) и количественный ПЦР в реальном времени анализа интересующих генов проводили с использованием SYBR PremixExTaq II комплект (Takara) в соответствии с инструкциями изготовителя. Данные были нормализованы к уровню гамма-тубулина.
Иммунофлуоресценции
<р> AGS клетки высевали на покровное в 6-луночный планшет фиксировали в 4% параформальдегида в течение 10 минут и блокировали в 1% БСА в течение 1 часа при комнатной температуре. Инкубируйте клетки с первичными антителами против SIRT3 и LDHA при 4 ° C в течение ночи с последующей инкубацией с флуоресцентно-конъюгированным вторичным антителом в течение 1 часа при комнатной температуре. Counterstaining проводили с использованием DAPI комплекта иммунофлюоресценции (Beyotime). Клетки были установлены и отображены с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии.
Статистический анализ
<р> Данные представлены как среднее ± SE, по меньшей мере, трех независимых экспериментов. Статистический анализ проводили с т тест непарный двух Стьюдента, если не указано иное. P
&л; 0,05 считалась значимой.
Результаты
<р> SIRT3 корректно определена в регуляции митохондриального гомеостаза в анти-старения и анти-трансформации. В последнее время различные результаты представлены в отношении к SIRT3-опосредованных ингибированием и пролиферации клеток, что приводит к полемике его роли в раковых заболеваний [19,20]. Для того, чтобы определить потенциальную роль SIRT3 при раке желудка, экспрессия SIRT3 была обнаружена в 4-желудочных линиях раковых клеток AGS, SGC-7901, MGC-803, ГГК-27 и группа желудка опухолевых тканей рака. Мы обнаружили, что уровни белка SIRT3 были повышены во всех 4-желудочных линии раковых клеток по сравнению с увековечены желудочных эпителиальных GES-1 клеток (AGS, в 1,9 раза; SGC-7901, в 1,5 раза; MGC-803, 2,0-кратные и ТЖК -27, в 1,8 раза по сравнению с ГЭС-1 клеток) (рис 1А). В соответствии, уровни мРНК SIRT3 в этих клеточных линий были также повышены (AGS, в 2,6 раза; СГК-7901, в 1,7 раза; MGC-803, 2,5-кратный; ТЖК-27, в 2,2 раза) по сравнению с GES- 1 клеток (фиг.1В).
<р> анализ Иммуногистохимия в опухоли и прилегающих к нему неопухолевых нормальных тканей от группы больных раком желудка показало, что SIRT3-положительные клетки чаще обнаруживаются в опухолевых тканях, чем в нормальных тканях. Результаты показали, что 55,1% опухолевых тканей (7% нормальных тканей) выставлены высокий уровень (сильный положительный), 41,4% опухолевых тканей (28% нормальных тканей) выставленный средний высокий уровень (слабый положительный), в то время как 3,5% от опухоли ткани и 64% нормальных тканей был отрицательным в выражении SIRT3 (рис 1C и 1D, S1A рис). Интересно, что SIRT3 выражение в кишечном типа опухолевых тканей (15 случаев, 93,3% сильная положительная и 6,6% слабый положительный) был значительно выше, чем при диффузной типа опухолевых тканей (14 случаев; 14,3% сильная положительная, 78,6% слабая положительная и 7,1 % отрицательных) (рис 1C и 1Е, S1B рис). Эти результаты свидетельствуют о том, что экспрессия SIRT3 увеличивается в некоторых опухолей по сравнению с соответствующими нормальными тканями и SIRT3 экспрессия может быть меняться в отдельные опухоли, которые нуждаются в дальнейшем исследовании.
Уровни SIRT3 связаны с клеточной пролиферации
<р> Затем мы установили SIRT3 гиперэкспрессия и нокдаун клеточных линий с использованием AGS и SGC-7901 клетки. Выражение SIRT3 в стабильных трансфектантов была подтверждена с помощью Вестерн-блоттинга. Сверхэкспрессия SIRT3 увеличился рост клеток, в то время как SIRT3 нокдаун ингибирует рост клеток обоих желудочных линий раковых клеток (рис 2А). Кроме того, избыточная экспрессия SIRT3 вызвало больше образования колоний чем у контрольных трансфицированных клеток, что было в отличие от только меньшим количеством колоний, образованных в SIRT3 нокдаун клеток (рис 2В).
<Р> Для дальнейшего определения роли SIRT3 в опухоли способности образования, мы вводили SIRT3 избыточную экспрессию и нокдаун СГК-7901 клетки в бока безволосых мышей и рост опухоли оставляли в течение 28 дней после инокуляции клеток (S2 рис). Средний вес опухолей, полученных из SIRT3 избыточно экспрессирующих клеток была 0.7079g, значительно больше, чем средний вес опухоли контрольной (NC), <ЕМ> р
= 0,015, (рис 2С, левая панель). В противоположность этому, средний вес опухолей, полученных из SIRT3 нокдаун клеток был 0.0588g, значительно меньше, чем из клеток скремблирования управления shRNA (СКЛ) (0.2033g; р
= 0,009) (рис 2С, правая панель) , Средний объем опухолей, полученных из клеток SIRT3 с гиперэкспрессией была увеличена, чем от контрольных клеток (NC) (рис 2С, левую панель вверх правый угол). Наоборот, средний объем опухолей, растущих из SIRT3 нокдаун клеток была значительно меньше по сравнению с контрольными клетками (СКЛ) (рис 2С, правая панель вверх правый угол).
Enhanced гликолиза в SIRT3 выражая рак желудка клетки
<р> Нам тогда интересно, как сотовая биоэнергетика может быть изменен в SIRT3-гиперэкспрессией клеток рака желудка. SIRT3 избыточная экспрессия резко возросло потребление глюкозы (в 1,4 раза в AGS и в 1,9 раза в SGC-7901), в то время как SIRT3 нокдаун уменьшилось потребление глюкозы (около 40% в обоих AGS и SGC-7901) (рис 3A и 3B). В соответствии с рисунком использования глюкозы, SIRT3 сверхэкспрессией клетки имели повышенный уровень лактата секреции (в 1,2 раза в AGS и в 1,3 раза в SGC-7901), в то время как SIRT3 нокдаун клетки уменьшились уровни лактата секреции (55% в AGS и 45 % в SGC-7901) (рис 3C и 3D). Мы также обнаружили, что формирование гликоген была значительно увеличена путем SIRT3 избыточной экспрессии (в 1,5 раза в AGS и в 1,3 раза в SGC-7901), функция быстрого роста опухолевых клеток [33], в то время как уменьшается SIRT3 нокдауна (40% в AGS и 70% в СГК-7901) (рис 3E и 3F).
<р> SIRT3 было доказано участие в деацетилировании глобальных ферментов метаболизма и поддержания базальных уровней АТФ в клетках, как в нормальном состоянии, и при заболеваниях [1 , 2]. Общее производство клеточного АТФ и гликолиза АТФ были обнаружены в AGS и SGC-7901 клеток либо с SIRT3 экспрессией или SIRT3 нокдаун. Суммарные клеточные уровни АТФ были увеличены в SIRT3 избыточно экспрессирующих клеток (около 1,3 раза в обеих клеточных линиях), но снизились в SIRT3 нокдаун клеток (около 75% в обеих клеточных линиях) по сравнению с контрольными клетками, NC или Scr (рис 4A и 4B) , Затем мы обрабатывали клетки с ротенону для ингибирования окислительного фосфорилирования и тестируют АТФ поколение от гликолиза. Как показано на рис 4C и 4D, SIRT3 избыточная экспрессия привело к увеличению производства гликолиза АТФ (в 1,4 раза в AGS и в 1,6 раза в SGC-7901), в то время как SIRT3 нокдаун привело к значительному сокращению производства гликолиза АТФ (20% в AGS и 40% в SGC-7901) по сравнению с NC или Scr управления.
<р> Совокупность доказательств, что поддерживает повышенный уровень РОС является Главная характеристика в раковых клетках, которые делают раковые клетки более чувствительными к дополнительному ROS стресса [34]. Здесь мы обнаружили, что избыточная экспрессия SIRT3 сниженные уровни ROS до 70% и 80% в AGS и СГК-7901 клеток, в то время как ингибирование экспрессии SIRT3 повышенные уровни ROS (в 1,4 раза в AGS клетках и в 1,6 раза в СГК-7901 клеток), соответственно, (рис 5А и 5В). В соответствии с литературными данными, показывающая SIRT3 деацетилирует и активирует MnSOD (11, 12), в желудочном раковых клеток, активность MnSOD усиливалось SIRT3 сверхэкспрессией (в 1,4 раза в AGS клетках и в 1,2 раза в СГК-7901 клеток), но уменьшается SIRT3 нокдаун (50% в клетках AGS и 65% в SGC-7901 клеток) (рис 5C и 5D), предполагая, что SIRT3 может защитить клетки от окислительного повреждения вызванного стрессом путем восстановления баланса внутриклеточного ROS за счет повышения активности MnSOD в желудочном раковых клеток.
<р> LDHA играет ключевую роль в инициации опухоли, поддержания и прогрессирования. Ингибирование активности блоков туморогенности и опухолевой прогрессии LDHA [26,27] и активность LDHA может регулироваться ацетилирования /деацетилирования модификации [35]. Нам было интересно, является ли SIRT3 участвует в регуляции активности LDHA. Мы обнаружили, что, в клеток рака желудка, активность LDHA была значительно увеличена в SIRT3 гиперэкспрессией клеток, в то время как уменьшились в SIRT3 нокдаун клеток по сравнению с контрольными NC или Scr клеток отдельно без обнаруживаемых изменений в уровне белка LDHA в стабильных трансфектантов (Фиг.6А). Иммунное окрашивание результаты показали, что LDHA и SIRT3 были колокализуются в цитоплазме (фиг.6В), и анализ со-IP-либо LDHA или SIRT3 антителом показало, что SIRT3 способен взаимодействовать с LDHA (фиг.6С). Кроме того, уровень LDHA Ацетилирование уменьшился в SIRT3 избыточно экспрессирующих клетках, но увеличилась в SIRT3 нокдаун клеток (рис 6d). Кроме того, в пробирке
LDHA анализ активности проводили с использованием коммерческого рекомбинантного человеческого SIRT3 и бычьего сердца L-лактатдегидрогеназы показало, что активность LDHA была увеличена с наличием SIRT3 в реакции, которое было отменено путем добавления ингибитора SIRT3 , никотинамид (рис 6E). Для того, чтобы определить потенциальный сайт (ы) SIRT3 деацетилирования на LDHA, мы искали базу данных и обнаружили, что K5, K14, K57, K81, K118, K126, K222 и K318 являются потенциальными местами ацетилирование LDHA, и предыдущее исследование показало, что K5 ацетилирования /деацетилирования было участвует в регуляции активности LDHA [35]. Затем мы сделали анализ активности LDHA с использованием лизина 5 и лизина 318 ацетилирования Mimic (K5Q /K318Q) или дезацетилирования имитируют (K5R /K318R) мутант LDHA, и обнаружили, что ни K5, ни K318 требовалось для SIRT3-опосредованной активации LDHA (S3 рис). Дальнейшая идентификация SIRT3-опосредованной LDHA дезацетилирования нуждается.
SIRT3 активирует гены, вовлеченные в клеточный метаболизм
<р> Чтобы охарактеризовать молекулярную подпись SIRT3-LDHA опосредованных биоэнергетики в желудочном раковых клеток, мы измерили экспрессия генов, связанных с транспортировкой и гликолиза глюкозы. Данные на фиг 7A и 7B показано, что избыточная экспрессия SIRT3 в AGS или СГК-7901 индуцирует экспрессию HK2 (1,47 раза в AGS клетках, в 1,3 раза в СГК-7901 клеток), MCT4 (в 2,3 раза в AGS клетках, 1,34 -кратно в СГК-7901 клетки) и GLUT1 (1,55-кратном в AGS клетках, 1,38-кратном в SGC-7901 клеток) на уровне мРНК, испытанной ПЦР в реальном времени. Напротив, SIRT3 нокдаун снижал экспрессию гена HK2 до 76%, MCT4 до 73% и GLUT1 до 62% в AGS клетках, в то время как HK2 до 80%, MCT4 до 62% и GLUT1 до 74% в СГК-7901 клеток. Кроме того, когда SIRT3 был избыточно экспрессируется, уровень MCT1 мРНК был увеличен в AGS клетках в 1,6 раза, но не в СГК-7901 клеток, и когда SIRT3 был нокдаун, MCT1 была снижена до 59% в AGS и 65% в СГК-7901 клеток соответственно.
<р> Это исследование дает доказательства того, что SIRT3 выраженное в некоторых раковых клетках, таких как желудочные раковые клетки, могут быть связаны с повышенной агрессивностью по SIRT3 опосредованной биоэнергетики через дезацетилирования и активация LADH. Несмотря на то, накапливая свидетельства указывает на то, что SIRT3 играет ключевую роль в защите нормальных клеток от старения и злокачественной трансформации, его функции в уже трансформированных клеток, таких как опухолевые клетки, которые экспрессируют SIRT3 должна быть исследована [19]. Отсутствие SIRT3 в MEFs приводит к нестабильности генома и высокой частоты трансформации клеток, опосредованной Ras с увеличением скорости образования опухолей и старению, предполагая, что SIRT3 необходим в профилактике клеточного старения и канцерогенеза [11,15]. Кроме того, отсутствие или низкая экспрессия SIRT3 обнаруживается в нескольких раковых заболеваний человека и уровень SIRT3 связан с чувствительностью раковых клеток к химио- и лучевой терапией [11,15,16]. Однако SIRT3 показано также быть избыточно экспрессируется в злокачественных опухолях человека и связана с устойчивостью к терапии [19,21,36]. Эти результаты свидетельствуют о том, что SIRT3 могут быть ориентированы на различные белки между нормальными и раковыми клетками, и что экспрессия SIRT3 можно варьировать в различных видах рака, такие как текущие результаты, свидетельствующие о том, что кишечный тип рака желудка выражает более высокий уровень SIRT3 чем диффузной тип рака желудка.
<р> было принято считать, что опухолевые клетки потребляют больше клеточной энергии для поддержки быстрого роста и пролиферации, чем нормальные клетки с использованием гликолиз в качестве основного источника АТФ поколения вместо окислительного фосфорилирования [24] , В настоящем исследовании мы показали, что в клетках рака желудка, SIRT3 взаимодействует и деацетилирует LDHA, вызывая повышенную активность LDHA; и SIRT3 избыточная экспрессия приводит к увеличению клеточного производства АТФ и активность MnSOD параллельно со снижением клеточного уровня РОС, что указывает на повышенную окислительный мусорщика способность SIRT3 возможно через активацию фермента MnSOD дезацетилирования-опосредованной. Все больше доказательств показывает, что SIRT3 требуется для поддержания клеточного и митохондрии гомеостаза через регулирующий метаболизм митохондрий и систему баланса клеточного окислительно-восстановительного, защищая клетки от окислительного стресса посредством регулирования генерации активных форм кислорода, критический механизм в процессе старения, рака и сердечных заболеваний [1,2, 37]. SIRT3 может deacetylate группу митохондрии мишеней участвует в регуляции обоих гликолиза и клеточного окислительного стресса. В последнее время, SIRT3 встречается возможность deacetylate и увеличивать активность дегидрогеназы пирувата в раковых клетках, которые могут увеличить как митохондриальные биоэнергетику и гликолиза [38]. В соглашении, данное исследование указывает на то, что SIRT3 может deacetylate и активировать LDHA, которые могут быть использованы как для митохондриального дыхания и гликолиза. С другой стороны, SIRT3 может deacetylate и затем активируют другие митохондрии субстраты, такие как MnSOD [11,12], Foxo3 [39] и IDH2 [9], чтобы удалять отработанный ROS производимого окислительного фосфорилирования, защищая клетки от окислительного повреждения [40] , Кроме того, в соответствии с этими выводами, в данном исследовании мы обнаружили, что избыточная экспрессия SIRT3 увеличивает MnSOD активность, которая может быть одной из причин пониженного клеточного уровня РОС при повышенной клеточного метаболизма состояния.
<Р> LDHA, как член семьи лактата дегидрогеназы (ЛДГ), обнаруживается существовала в гликолитических клетках и локализованы в митохондриях, в дополнение к цитозоль [41], и, главным образом, катализирующий интер-превращение пирувата и лактата [42]. LDHA показан играть ключевую роль в аэробного гликолиза и туморогенности в злокачественных клетках [26,27]. В раковых клетках, LDHA быстро потребляет пируват производимого гликолиза, что приводит к увеличению аэробной производства лактата [26]. Ингибирование LDHA индуцирует продукцию ROS, уменьшает клеточных уровней АТФ и ингибирует гликолиз, поэтому ингибирует рост клеток и вызывает гибель клеток при раке [27]. Состоя с этими отчетами, мы обнаружили, что SIRT3 могут взаимодействовать и активировать LDHA. В SIRT3 гиперэкспрессией клетки, LDHA ацетилирование уменьшалась с увеличением активности фермента LDHA. Хотя точный механизм, вызывающий SIRT3-опосредованной регуляции LDHA нуждается в дальнейшем исследовании, эти результаты показывают, что LDHA контролируется гликолиза путь, который ускоряет опухоль биоэнергетика может влиять уровни экспрессии SIRT3.
<Р> Наше текущее исследование также показало, что выражение группа генов, таких как MCT1, MCT4, HK2 и GLUT1, известный как ключевых регуляторов энергетического обмена при раке также увеличены в SIRT3 сверхэкспрессией клеток рака желудка, демонстрируя потенциальную роль SIRT3 в усилении гликолиза в опухолевых клетках. НК2 катализирует фосфорилирование глюкозы в глюкозо-6-фосфата на начальной стадии гликолиза [43]. Глюкоза Транспортер (GLUT) контролирует транспорт глюкозы через плазматическую мембрану, функционирующий в качестве первого шага ограничивает скорость метаболизма глюкозы [44]. MCT1 и MCT4, члены монокарбоксилатов (например, лактата и пирувата) переносчика семьи, также участвуют в росте гликолиза-зависимых опухолей [45]. В совокупности эти результаты указывают на потенциальное взаимодействие между SIRT3 и группой гликолиза-ассоциированных генов в сигнальных опухоли агрессивный рост, который нуждается в дальнейшем исследовании.
<Р> В заключение, хотя SIRT3 хорошо характеризуется в митохондриальной гомеостаза против клетки старение и трансформация, экспрессия SIRT3 в опухолевых клетках связано с усиленной пролиферации и агрессивного роста клеток рака желудка. SIRT3 взаимодействует и активирует LDHA, что приводит к увеличению гликолиза и АТФ, которые вместе с усилением митохондриального антиоксиданта MnSOD активностью и пониженной внутриклеточный уровень активных форм кислорода (гипотетическая модель предлагается на рис 7С). Таким образом, функция роста стимулирования SIRT3 демонстрирует потенциальную цель для лечения опухолей с выражением SIRT3.
Поддержка Информация
S1 Рис. Типичные патологические горок для определения экспрессии SIRT3 в желудочном образцов рака человека.
A, парафин рака желудка человека и спаренные соседние образцы патологически нормальной ткани были подвергнуты иммуногистохимического окрашивания с SIRT3 антителом (коричневый) с последующим ядрами контрастирующая с гематоксилином ( синий, каждая опухоль была показана с соседними нормальными тканями в одном ряду на 20 × и 40 ×). B, репрезентативные образы выражения SIRT3 в кишечных и диффузных типов рака желудка. Шкала бар, 50 мкм
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0129834.s001
(TIF)
S2 Рис. Сверхэкспрессия SIRT3 способствует опухолевой в естественных условиях.
SGC-7901 клетки с SIRT3 оверэкспрессии (А) или нокдаун (B) вводили подкожно в правый фланг голых мышей с относительными контрольными клетками (NC или ИКВ) в левый бочка. Ксенотрансплантата опухоли вырезали и взвешивали на 28-й день после инокуляции клеток. Изображения правой панели показано опухолей ксенотрансплантатов в естественных условиях в конце эксперимента. Изображения показали рост опухоли у мышей
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0129834.s002
(TIF)
S3 Рис.
Чистящие средства могут повысить риск детской астмы - результаты исследования
Микробиом кишечника также присутствует в жизни плода.
Передача SARS-CoV-2 от матери ребенку во время беременности возможна, но редко,
Микробиом легких предсказывает тяжесть заболевания COVID-19
Исследователи нашли новый способ защиты от болезней в модели рассеянного склероза.
Слизь в лейке для душа может содержать опасные легочные бактерии - исследование
Исследования показывают, что пробиотики помогают бороться с тревогой и депрессией.
Предыдущие исследования связали проблемы психического здоровья и нарушения развития со здоровьем кишечника. Теперь, группа британских ученых показала, что продукты, расширяющие профиль полезных бактер
Тяжелые осложнения COVID-19, связанные с нарушением кишечного барьера
Основное внимание в исследованиях нынешней пандемии коронавирусного заболевания 2019 (COVID-19) было направлено на необходимость понимания действующих механизмов, вызывающих различные проявления и осл
Бактериофаги могут лечить кишечную палочку, не повреждая кишечник,
новое исследование говорит Исследователи из США разработали новую терапию, в которой для лечения инфекций, вызванных кишечной палочкой, используется уникальный бактериофаг. Было обнаружено, что бактер