PLOS ONE: SIRT3 Améliore la glycolyse et la prolifération dans les cellules du cancer gastrique SIRT3-Exprimer

Résumé

SIRT3 est une clé NAD ^{+ - dépendante déacétylase de protéines dans les mitochondries des cellules de mammifères, fonctionnant de façon à empêcher le vieillissement cellulaire et la transformation par la régulation de l'homéostasie métabolique des mitochondries. Cependant, SIRT3 se trouve également à exprimer dans certaines tumeurs humaines; son rôle dans ces cellules tumorales exprimant SIRT3 doit être élucidée. Cette étude a démontré que l'expression de SIRT3 a été élevée dans un groupe de cellules de cancer de l'estomac par rapport à des cellules épithéliales gastriques normales. Bien que les niveaux d'expression SIRT3 ont été augmentés dans les tissus tumoraux gastriques par rapport aux tissus non tumorales adjacentes, les cellules cancéreuses positives SIRT3 ont été plus fréquemment détectée dans les cancers gastriques de type intestinal que les cancers gastriques de type diffus, ce qui indique que SIRT3 est liée à la sous-types de l'estomac cancer. La surexpression de SIRT3 favorisé la prolifération cellulaire et la production accrue de l'ATP, l'absorption du glucose, la formation de glycogène, l'activité de MnSOD et la production de lactate, qui a été inhibée par l'effet de choc SIRT3, ce qui indique que SIRT3 joue un rôle dans la reprogrammation de la bioénergétique dans les cellules tumorales gastriques. Une analyse plus approfondie a révélé que SIRT3 a interagi avec désacétylée et le lactate déshydrogénase A (LDHA), une protéine clé dans la régulation de la glycolyse anaérobie, l'amélioration de l'activité LDHA. Dans la consistance, un groupe de gènes de la glycolyse est associée à une régulation positive dans les cellules tumorales surexprimant SIRT3 gastriques. Ainsi, en plus de l'homéostasie mitochondriale SIRT3 médiation bien documentée dans des cellules normales, SIRT3 peut augmenter la glycolyse et la prolifération cellulaire dans les cellules cancéreuses SIRT3 exprimant}

. Référence: Cui Y, Qin L, Wu J, Qu X, Hou C, Sun W, et al. (2015) SIRT3 Améliore la glycolyse et la prolifération dans les cellules du cancer gastrique SIRT3-Exprimer. PLoS ONE 10 (6): e0129834. doi: 10.1371 /journal.pone.0129834

Editeur: Xianglin Shi, Université du Kentucky, ÉTATS-UNIS

Reçu le 16 Avril 2015; Accepté: 13 mai 2015; Publié le 29 Juin, 2015

Droit d'auteur: © 2015 Cui et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, pourvu que l'auteur et la source originelle sont crédités

Disponibilité des données: Toutes les données pertinentes sont dans le ses fichiers de renseignements à l'appui du papier et

financement:. Cette étude a été partiellement financé par la national science Foundation naturel de la Chine, Programme clé (30930105), 12-5 national de soutien plan du projet du ministère de la science et Technologies de Chine (2012BAH30F03), la national Natural science Foundation de Chine (31070740), le 985 et 211 projets de l'Université Xi'an Jiaotong (JKL), et le national Cancer Institute RO1 subvention CA152313-01-A1 (JJL).

intérêts concurrents:. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

Sirtuins introduction, une famille de NAD ^{+ - histone désacétylases dépendantes (HDAC) dans les mammifères les cellules sont impliquées dans un large éventail de procédés physiques, notamment la survie cellulaire, l'apoptose, le métabolisme, les réponses au stress, le vieillissement et la longévité [1,2]. Parmi les sept membres sirtuines (SIRT1-7), SIRT3 est le meilleur sirtuines mitochondriale caractérisé, fonctionnant de façon à réguler des protéines mitochondriales impliquées dans la phosphorylation oxydative, l'oxydation des acides gras, le cycle de l'urée, et la réponse anti-oxydant [9/2]. Plusieurs études ont mis en évidence le rôle de SIRT3 dans le métabolisme et l'homéostasie dans les cellules normales et a révélé de nouvelles cibles et de substrats pour SIRT3 dépendant désacétylation [10]. Kim et al ont rapporté que SIRT3 est une protéine mitochondriale clé, et l'absence de l'expression de SIRT3 est liée à une augmentation des dommages ADN mitochondrial et au vieillissement, ainsi que le potentiel accru pour la transformation des cellules de Ras-induite et l'activation de la MnSOD SIRT3 médiation contribuant à l'homéostasie mitochondriale [11,12]. À l'appui, embryonnaires cellules rénales 293 humaines (HEK293), les cellules présentent une expression SIRT3 améliorée sous le stress oxydatif, conduisant à désacétylation et l'activation de MnSOD [13]. SIRT3 est censé fonctionner comme un gène suppresseur de tumeur qui joue un rôle clé dans l'amélioration de l'homéostasie des cellules contre le vieillissement et la cancérogenèse.}

Cependant, certaines cellules tumorales montrent l'expression de SIRT3 et le rôle potentiel de SIRT3 dans ces cellules tumorales , en particulier sa relation potentielle au phénotype agressif, a été controversée [14]. SIRT3 l'expression est plus faible ou indétectable dans un éventail de cancers humains, y compris le cancer du sein, le glioblastome, le cancer du côlon, et l'ostéosarcome, de la prostate et de l'ovaire [11,15,16]. SIRT3 induit un arrêt de croissance et de l'apoptose par inactivation sélective de la protéine Bcl-2 dans les cellules HCT116 par modulation de JNK2 voie de signalisation [17]. En outre, SIRT3 est rapporté contribue à augmenter la sensibilité des cellules de leucémie humaine à la chimiothérapie, éventuellement par l'induction de l'apoptose à médiation par les mitochondries [18]. D'autre part, l'expression de SIRT3 se trouve également être augmentée dans le cancer par voie orale, le cancer du sein avec envahissement ganglionnaire, cancer de l'oesophage, et les carcinomes de la thyroïde; et l'augmentation de SIRT3 est associé à un phénotype et une régulation négative de SIRT3 maligne plus élevée augmente la sensibilité d'une tumeur à un traitement anti-cancéreux [19 à 23]. Ces résultats signalent un rôle différent de SIRT3 dans des tumeurs spécifiques qui doivent être élucidées.

Les cellules cancéreuses sont métaboliquement actives et consomment plus de carburant cellulaire que les cellules normales. Cependant les cellules cancéreuses relais sur principalement sur la synthèse d'ATP par la glycolyse aérobie, une caractéristique connue sous le nom d'effet Warburg [24]. Une telle glycolyse aérobie est censé protéger les cellules cancéreuses forment le stress oxydatif depuis la respiration mitochondriale est la principale source de intracellulaire ROS [25]. Lactate déshydrogénase A (LDHA) est une enzyme contrôlant interconversion entre pyruvate et du L-lactate de façon réversible à la dernière étape de la glycolyse anaérobie [26]. L'inhibition de la LDHA diminue le potentiel tumorigène avec une consommation accrue mitochondriale d'oxygène et une diminution de potentiel de membrane mitochondriale [26] et la production d'ATP cellulaire globale et de la glycolyse [27].

Dans cette étude, nous avons étudié le rôle potentiel de SIRT3 dans l'estomac les cellules cancéreuses qui expriment SIRT3. L'expression de SIRT3 est liée à la croissance agressive, qui a été médiée par SIRT3-désacétylé et activé LDHA, l'amélioration de la glycolyse et de l'expression d'un groupe de gènes de la glycolyse associée. métabolisme glycolyse Ainsi SIRT3-LDHA médiation peut être une cible thérapeutique potentielle pour traiter les cellules cancéreuses qui expriment SIRT3.

Matériel et méthodes

Les lignées cellulaires et culture

cancer gastrique humain des lignées cellulaires MGC-803, HGC-27, SGC-7901 [28] AGS [29] et immortalisée lignée de cellules épithéliales gastriques humaines GES-1 [30] ont été maintenues dans du milieu RPMI-1640 (Invitrogen) supplémenté avec 10% de fœtus bovin sérum et 1% de pénicilline /streptomycine, et cultivées à 37 ° C sous une atmosphère de 5% de CO2.

immunoprécipitation et transfert de western des cellules

sous-confluentes ont été lysées et les lysats ont été mises en incubation avec la protéine A /billes d'agarose G ainsi que la quantité recommandée d'anticorps contre soit SIRT3 (Cell Signaling Technology) ou LDHA (Santa Cruze) à 4 ° C pendant la nuit. Les échantillons ont été centrifugés et séparés par électrophorèse sur gel de SDS-polyacrylamide et un électrotransfert sur des membranes de nitrocellulose. Après le blocage avec 5% de lait écrémé dans du TBST, les membranes ont été incubées avec l'anticorps primaire à 4 ° C pendant une nuit suivie d'une incubation avec un anticorps secondaire pendant 1 heure à température ambiante. Les protéines d'intérêt ont été visualisées par kit de détection ECL (Thermo Fisher).

immunohistochimie test

diapositives pathologiques du cancer de l'estomac avec des tissus normaux adjacents ont été analysés par test d'immunohistochimie ont été réalisées en suivant les instructions du fabricant. Le kit de détection de polymère pour l'analyse immunohistochimique a été acheté à Zhongshan Golden Bridge Biotechnology. En bref, des sections de paraffine ont été déparaffinées et réhydratées dans de l'éthanol (100%, 90% et 75%). Les coupes ont été mises en incubation avec 3% de H _{2 O 2 à température ambiante pendant 10 minutes, puis bloquées avec du sérum de chèvre non immun à température ambiante pendant 15 minutes. Les sections ont ensuite été incubées avec l'anticorps primaire à SIRT3 (Cell Signaling Technology) pendant 2 heures à la température ambiante suivie d'anti-lapin secondaire incubation avec l'anticorps pendant 15 minutes à la température ambiante. Les sections ont ensuite été incubées avec le DAB réactif de détection pendant 2 minutes à chaque fois, contre-colorées avec de l'hématoxyline et dehydraded dans l'éthanol (90% et 100%). Les sections ont été montées et la coloration a été analysée sous le microscope.}

Construction de plasmides et de transfection de cellules

SIRT3 toute la longueur d'ADNc a été synthétisé en utilisant la RT-PCR avec de l'ARN total extrait de cellules GES-1 comme gabarit (amorces: 5 'CCGCGGTACCATGGCGTTGTGGGGTTG 3' et 5 'CCGCTCTAGACTATTTGTCTGGTCCATCAAGC 3'). L'ADNc a été ensuite clone dans pcDNA3.1 + vecteur d'expression (Invitrogen). Le pGPH1 /GFP /Neo-SIRT3-shRNA plasmidique ciblage SIRT3 humaine (5 'CTTGCTGCATGTGGTTGAT 3') et le contrôle shRNA plasmidique ont été obtenus à partir de GenePharma. Pour générer des transfectants stables, les cellules AGS et CGS-7901 ont été transfectées en utilisant la lipofectamine 2000 réactif (Invitrogen) et les transfectants stables ont été sélectionnés par 400ug /ml de G418 (Gibco).

prolifération cellulaire et essai de clonogénicité

Pour le dosage de prolifération, les cellules ont été étalées dans une plaque à 6 puits à 2 x 10 ^{4 cellules /puits. La prolifération cellulaire a été calculée en jours 2, 4, 6 et 8 après l'étalement. Pour le dosage de clonogénicité, les cellules ont été étalées dans une plaque à 6 puits avec un nombre de cellules variées et mises en culture pendant 14 jours et les colonies ont ensuite été colorées avec du cristal violet, et le nombre de colonies (> 50 cellules /colonie) ont été comptés suivant les modes opératoires établis [31].}

mesure du glucose, le lactate et le glycogène

Le rouge de phénol milieu exempt a été utilisé pour les cellules de culture dans 6 puits plaque pendant 24 heures et les niveaux d'absorption du glucose et de la production de lactate ont été mesurées en utilisant le kit de dosage du glucose et Kit acide lactique (Jiancheng Bioengineering Institute). Les valeurs ont été normalisées par rapport au nombre de cellules de chaque puits. les niveaux de glycogène cellulaires ont été détectés en utilisant le kit d'analyse de glycogène (Biovision). En bref, 1 x 10 ^{6 cellules ont été homogénéisées dans de l'eau 200 pi sur de la glace, et les homogénats ont été bouillis pendant 5 minutes pour inactiver les enzymes et on centrifuge à 13 000 tours par minute pendant 5 minutes à 4 ° C pour éliminer la matière insoluble. La production de glycogène a été mesurée avec la valeur de DO à 570 nm.}

Mesure de la production d'ATP
niveaux

Cellular ATP et ROS ont été mesurées comme décrit précédemment [32]. Les cellules cultivées dans une plaque à 6 puits après divers traitements ont été lysées et les taux d'ATP cellulaire ont été mesurés avec l'ATP Assay Kit bioluminescence (Sigma). Pour la mesure de la production d'ATP à médiation par la glycolyse, les cellules ont été traitées avec 2 pM roténone pendant 24 heures avant les mesures.

Mesure de la production d'ERO

génération cellulaire ERO a été dosée avec de la 5- (et 6-) carboxy-2 ', 7'-dichlorodihydrofluoresceine diacétate (DCFDA) méthode utilisant un spectromètre de microplaques (Thermo Fisher) à 488 nm /530 nm de longueur d'onde.

L'activité MnSOD

cellules cultivées dans un puits 6 plaque ont été lysées et l'activité MnSOD a été déterminée par WST-8 méthodes utilisant le kit de dosage de MnSOD (Beyotime) suivant les instructions du fabricant.

tests de tumorigénicité chez la souris nude

SGC7901 cellules (7,5 x 10 ^{6) avec SIRT3 surexpression ou knockdown ont été mis en suspension dans 0,1 ml de PBS et inoculées dans les deux flancs de 5 semaines vieux mâle BALB /c athymiques souris nues, et à la 28 e jour après l'inoculation lorsque le volume de la tumeur maximale (~ 1500 mm 3) a atteint dans le groupe témoin, les expériences ont été terminées et toutes les tumeurs de chaque groupe ont été excisées et pesées. La procédure expérimentale impliquant des tests animaux a été réalisée en conformité avec les directives institutionnelles; Comité soin et l'utilisation institutionnelle des animaux (IACUC) à Xian Jiao Tong University spécifiquement approuvé cette étude (Protocolex181).}

Lactate déshydrogénase test

Le lactate déshydrogénase a été déterminée selon le protocole établi en mesurant le taux de réduction de l'absorbance à la longueur d'onde de 340 nm résultant de l'oxydation du NADH [27]. En bref, les cellules ont été cultivées dans des boîtes de 10 cm et on les homogénéise dans du PBS sur de la glace. Les homogénats ont été ajoutés dans un tampon contenant 6,6 mM de NADH, du pyruvate de sodium 30 mM et 0,2 M de Tris-HCl, pH 7,3 et on mélange. Incuber le mélange pendant 5 minutes pour atteindre l'équilibre de température, puis enregistrer le taux d'absorption de diminution à 340 nm.

SIRT3 in vitro
désacétylation test

SIRT3 humain enzyme recombinante ( BSP) a été mis en incubation avec de la L-lactique déshydrogénase de coeur de boeuf (Sigma) dans un tampon de réaction (50 mM de NaCl, 4 mM MgCl _{2 mM de NAD 10 ^{+ DTT 50 mM, Tris 50 mM, pH 8,0) avec /sans inhibiteur de SIRT3 nicotinamide (NAM, 10 mM) à 37 ° C pendant 1,5 heure, puis les réactions ont été utilisées pour le dosage de l'activité LDHA décrit ci-dessus.}}

en temps réel
PCR

L'ARN total a été isolé en utilisant le réactif Trizol (Invitrogen), suivi par un traitement avec du phénol /chloroforme et précipitation avec du 2-propanol. Totale culot d'ARN a ensuite été lavé avec de l'éthanol à 75% et remis en suspension dans l'eau. L'ARN a été soumis à une transcription inverse avec le kit PrimeScript RT-PCR (Takara) et l'analyse quantitative PCR en temps réel de gènes d'intérêt a été réalisée en utilisant le kit SYBR PremixExTaq II (Takara) suivant les instructions du fabricant. Les données ont été normalisées par rapport au niveau de la γ-tubuline.

Immunofluorescence

cellules AGS semés sur la lamelle dans une plaque à 6 puits ont été fixées dans du paraformaldehyde à 4% pendant 10 minutes et bloquées dans 1% BSA pendant 1 heure à température ambiante. Incuber les cellules avec des anticorps primaires contre SIRT3 et LDHA à 4 ° C pendant une nuit, suivie d'une incubation avec un anticorps secondaire conjugué à la fluorescence pendant 1 heure à température ambiante. Contre-coloration a été réalisée avec du DAPI en utilisant le kit d'immunofluorescence (Beyotime). Les cellules ont été montées et imagées par balayage laser microscope confocal.

L'analyse statistique

Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SE à partir d'au moins trois expériences indépendantes. L'analyse statistique a été réalisée avec le test t de apparié bilatéral étudiant, sauf indication contraire. P
< 0,05 a été considérée comme significative.

Résultats

expression SIRT3 dans les cellules cancéreuses gastriques

SIRT3 est bien défini dans la régulation de l'homéostasie mitochondriale dans la lutte anti-vieillissement et anti-transformation. Récemment, différents résultats sont rapportés en ce qui concerne l'inhibition de la prolifération cellulaire induite par SIRT3, conduisant à la controverse de son rôle dans les cancers [19,20]. Pour déterminer le rôle potentiel de SIRT3 dans le cancer gastrique, l'expression de SIRT3 a été détecté dans 4 gastriques cellules cancéreuses lignes AGS, SGC-7901, MGC-803, HGC-27 et un groupe de tissus tumoraux de cancer gastrique. Nous avons constaté que les taux de protéine SIRT3 ont été élevés dans les 4 lignées cellulaires de cancer gastrique par rapport aux GES-1 epitheliales gastriques des cellules immortalisées (AGS, 1,9 fois, CGS-7901, 1,5 fois, MGC-803, 2,0 fois, et HGC -27, 1,8 fois par rapport aux cellules de GES-1) (Fig 1A). Conformément, les taux d'ARNm de SIRT3 dans ces lignées cellulaires ont également été augmentés (AGS, 2,6 fois; SGC-7901, 1,7 fois, MGC-803, 2,5 fois; HGC-27, 2,2 fois) par rapport à Ges- 1 des cellules (figure 1B).

analyse immunohistochimique en tumoral et non tumoral tissus normaux adjacents à partir d'un groupe de patients atteints de cancer gastrique ont démontré que les cellules SIRT3 positives étaient plus fréquemment détectée dans les tissus de la tumeur que celle dans les tissus normaux. Les résultats ont montré que 55,1% des tissus tumoraux (7% des tissus normaux) présentait de haut niveau (fortement positif), 41,4% des tissus tumoraux (28% des tissus normaux) présentait le niveau moyen élevé (faiblement positif), tandis que 3,5% de la tumeur tissus et 64% des tissus normaux a été négative dans l'expression de SIRT3 (figure 1C et 1D, S1A Fig). Fait intéressant, SIRT3 expression dans le type intestinal des tissus tumoraux (15 cas; 93,3% positif fort et 6,6% faiblement positif) était significativement plus élevée que dans le type diffus de tissus tumoraux (14 cas; 14,3% fortement positif, 78,6% faiblement positif et 7.1 % négative) (figure 1C et 1E, S1B Fig). Ces résultats suggèrent que l'expression de SIRT3 est augmentée dans certaines tumeurs par rapport aux tissus normaux connexes et SIRT3 expression peut être varient dans les tumeurs individuelles, qui doivent encore être étudiées.

niveaux de SIRT3 sont liés à la prolifération cellulaire

Ensuite, nous avons établi SIRT3 surexpression et des lignées de cellules knockdown utilisant AGS et des cellules SGC-7901. L'expression de la SIRT3 dans des transfectants stables a été confirmée par Western Blot. SIRT3 a augmenté la surexpression de la croissance cellulaire, alors que SIRT3 knockdown inhibe la croissance cellulaire des deux lignées cellulaires de cancer gastrique (figure 2A). En outre, la surexpression de SIRT3 déclenché plus la formation de colonies de cellules témoins transfectées qui était en contraste avec seulement moins de colonies formées dans les SIRT3 knockdown cellules (figure 2B).

Afin de déterminer davantage le rôle de SIRT3 dans la tumeur capacité de formation, nous avons injecté SIRT3 surexpression et cellules SGC-7901 knockdown dans les flancs de souris nues et la croissance tumorale a été autorisée pendant 28 jours après l'inoculation des cellules (S2 Fig). Le poids moyen des tumeurs dérivées de cellules surexprimant SIRT3 était 0.7079g, beaucoup plus grande que le poids moyen de la tumeur du contrôle (NC), p = 0,015
, (figure 2C, panneau de gauche). En revanche, le poids moyen des tumeurs dérivées de cellules knockdown de SIRT3 est 0.0588g, nettement inférieur à celui de brouillage des cellules de contrôle shRNA (SCR) (0.2033g; p
= 0,009) (figure 2C, panneau de droite) . Le volume moyen des tumeurs dérivées de cellules surexprimant SIRT3 a été augmentée que celle des cellules de contrôle (NC) (figure 2C, panneau de gauche jusqu'à coin droit). Au contraire, le volume moyen des tumeurs à croissance des cellules knockdown de SIRT3 était considérablement faible par rapport à celle des cellules de contrôle (Scr) (figure 2C, panneau de droite coin en haut à droite).

glycolyse renforcée dans SIRT3 exprime le cancer gastrique cellules

On se demandait alors comment bioénergétique cellulaire pourrait être modifiée dans les cellules cancéreuses gastriques SIRT3 surexprimant. SIRT3 surexpression augmente considérablement l'absorption de glucose (1,4 fois en AGS et 1,9 fois dans SGC-7901), tandis que SIRT3 knockdown a diminué l'absorption du glucose (environ 40% dans les deux AGS et SGC-7901) (figure 3A et 3B). Conformément à la tendance de l'utilisation du glucose, les cellules surexprimant SIRT3 ont augmenté les niveaux de sécrétion de lactate (1,2 fois en AGS et 1,3 fois en SGC-7901), tandis que les cellules knockdown SIRT3 avaient diminué les niveaux de sécrétion de lactate (55% en AGS et 45 % en SGC-7901) (figure 3C et 3D). Nous avons également constaté que la formation du glycogène a été significativement augmentée par SIRT3 surexpression (1,5 fois en AGS et 1,3 fois en SGC-7901), une caractéristique de la croissance rapide des cellules tumorales [33], tandis que réduite par SIRT3 knockdown (40% en AGS et 70% dans SGC-7901) (figure 3E et 3F).

SIRT3 a été prouvé impliqué dans la désacétylation des enzymes du métabolisme global et le maintien de niveaux d'ATP dans les cellules basales à la fois dans un état normal et dans les maladies [1 , 2]. ATP et ATP glycolyse génération cellulaire total ont été détectés dans AGS et les cellules SGC-7901 avec soit SIRT3 surexpression ou SIRT3 knockdown. Le total des niveaux ATP cellulaires ont été augmentés dans les cellules surexprimant SIRT3 (environ 1,3 fois dans les deux lignées cellulaires), mais une diminution dans les cellules SIRT3 knockdown (environ 75% dans les deux lignées cellulaires) par rapport aux cellules témoins CN ou SCR (Figure 4A et 4B) . Ensuite, nous avons traité les cellules avec la roténone pour inhiber la phosphorylation oxydative, et testé la génération d'ATP de la glycolyse. Comme cela est représenté sur la figure 4C et 4D, SIRT3 surexpression conduit à une augmentation de la production glycolyse ATP (1,4 fois en AGS et de 1,6 fois dans le SGC-7901), tandis que SIRT3 effet de choc a entraîné une diminution significative de la production glycolyse ATP (20% AGS et 40% en SGC-7901) par rapport à NC ou Scr contrôle.

SIRT3 régule l'homéostasie de ROS dans les cellules cancéreuses gastriques

un ensemble de preuves soutient que l'augmentation de niveau ROS est un caractéristique critique dans les cellules cancéreuses, ce qui rend les cellules cancéreuses plus sensibles à la contrainte supplémentaire ROS [34]. Ici, nous avons découvert que la surexpression de SIRT3 a diminué les taux de ROS à 70% et 80% dans les cellules AGS et CGS-7901, alors que l'inhibition de l'expression de SIRT3 augmentation des niveaux de ROS (1,4 fois dans les cellules AGS et 1,6 fois dans des cellules CGT-7901), respectivement, (figure 5A et 5B). En accord avec la littérature montrant désacétyle de SIRT3 et active MnSOD (11, 12), dans des cellules de cancer gastrique, l'activité MnSOD a été renforcée par SIRT3 surexpression (1,4 fois dans les cellules AGS et 1,2 fois dans des cellules SGC-7901), mais réduit par SIRT3 knockdown (50% dans les cellules AGS et 65% dans les cellules SGC-7901) (figure 5C et 5D), ce qui suggère que SIRT3 peut protéger les cellules des dommages oxydatifs induits par le stress en rééquilibrant intracellulaire ROS par le renforcement de l'activité MnSOD dans les cellules de cancer gastrique.

désacétyle de SIRT3 et active LDHA

LDHA joue un rôle clé dans l'initiation de la tumeur, la maintenance et la progression. L'inhibition de l'activité LDHA blocs de tumorigénicité et la progression tumorale [26,27] et l'activité LDHA peut être régulée par modification acétylation /désacétylation [35]. Nous nous demandions si SIRT3 est impliqué dans la régulation de l'activité LDHA. Nous avons constaté que, dans les cellules de cancer gastrique, une activité LDHA était significativement augmentée dans SIRT3 cellules surexprimant, tandis que la diminution dans les cellules SIRT3 knockdown par rapport à commande numérique ou de commande Scr cellules séparément sans changement détectable LDHA niveau de protéines dans les transfectants stables (figure 6A). immunocoloration résultats ont montré que LDHA et SIRT3 ont été co-localisés dans le cytoplasme (figure 6B), et l'analyse de co-IP avec soit un anticorps ou LDHA SIRT3 ont révélé que SIRT3 est capable d'interagir avec LDHA (figure 6C). En outre, le niveau d'acétylation LDHA a été diminuée dans les cellules surexprimant SIRT3, mais a augmenté dans les cellules SIRT3 knockdown (figure 6D). En outre, in vitro
LDHA test d'activité effectué en utilisant SIRT3 humaine recombinante commerciale et de coeur de boeuf L-Lactic Dehydrogenase a indiqué que l'activité LDHA a été augmentée par la présence de SIRT3 dans la réaction, qui a été inversée par l'addition d'un inhibiteur de SIRT3 nicotinamide (figure 6E). Pour identifier le potentiel site (s) SIRT3 désacétylation sur LDHA, nous avons cherché base de données et a constaté que K5, K14, K57, K81, K118, K126, K222 et K318 sont des sites d'acétylation potentiels de LDHA, et l'étude précédente rapporté que K5 acétylation /désacétylation était impliquée dans la régulation de l'activité LDHA [35]. Puis nous avons fait LDHA dosage de l'activité en utilisant la lysine 5 et lysine 318 acétylation mimétique (K5Q /K318Q) ou désacétylation mimétique (K5R /K318R) LDHA mutant, et constaté que ni K5 ni K318 a été requis pour LDHA activation de SIRT3 médiée (S3 Fig). En outre l'identification des SIRT3 médiée LDHA désacétylation est dans le besoin.

SIRT3 upregulates gènes impliqués dans le métabolisme cellulaire

Pour caractériser la signature moléculaire de SIRT3-LDHA bioénergétique médiation dans les cellules de cancer gastrique, nous avons mesuré la l'expression de gènes associés au transport du glucose et la glycolyse. Les données de la figure 7A et 7B ont montré que la surexpression de SIRT3 dans AGS ou SGC-7901 induit l'expression de HK2 (1,47 fois dans des cellules AGS, 1,3 fois dans les cellules SGC-7901), MCT4 (2,3 fois dans les cellules AGS, 1,34 -fold dans les cellules SGC-7901) et Glut1 (1,55 fois dans des cellules AGS, 1,38 fois dans des cellules SGC-7901) au niveau de l'ARNm testé par PCR en temps réel. Au contraire, SIRT3 effet de choc a diminué l'expression de HK2 gène à 76%, MCT4 à 73% et Glut1 à 62% dans les cellules AGS, tandis que HK2 à 80%, MCT4 à 62% et Glut1 à 74% dans les cellules CGT-7901. En outre, lorsque SIRT3 est surexprimé, le niveau MCT1 ARNm a été augmentée dans les cellules AGS de 1,6 fois, mais pas dans les cellules CGS-7901, et quand SIRT3 a knockdown, MCT1 a été diminuée à 59% en AGS et 65% dans les cellules CGT-7901 , respectivement.

Discussion

Cette étude fournit la preuve indiquant que SIRT3 exprimée dans certaines cellules cancéreuses, comme les cellules de cancer gastrique, peuvent être liés à l'agressivité renforcée par bioénergétique SIRT3 médiée par désacétylation et l'activation de la LADH. Bien que l'accumulation de preuves indique que SIRT3 joue un rôle essentiel dans la protection des cellules normales contre le vieillissement et la transformation maligne, sa fonction dans des cellules déjà transformées telles que des cellules tumorales qui expriment SIRT3 doit être étudiée [19]. Le manque de SIRT3 dans MEFs conduit à une instabilité génomique et une haute fréquence de transformation cellulaire médiée par Ras avec un taux accru de formation de tumeur et au vieillissement, ce qui suggère que SIRT3 est nécessaire dans la prévention du vieillissement cellulaire et la carcinogenèse [11,15]. En outre, le manque d'expression ou moins de SIRT3 est détectée dans plusieurs cancers humains et le niveau de SIRT3 est associée à la sensibilité de cellules cancéreuses à la chimiothérapie et à la radiothérapie [11,15,16]. Cependant, SIRT3 est également montré être surexprimé dans les cancers humains et associée à la résistance à la thérapie [19,21,36]. Ces résultats suggèrent que SIRT3 peut cibler des protéines différentes entre les cellules normales et cancéreuses, et que l'expression de SIRT3 peut faire varier dans différents types de cancer, tels que les résultats actuels indiquent que le type intestinal du cancer gastrique exprime un niveau de SIRT3 plus élevé que le rayonnement diffus type de cancer de l'estomac.

Il a été généralement admis que les cellules tumorales consomment de l'énergie cellulaire plus pour soutenir la croissance rapide et la prolifération que les cellules normales en utilisant la glycolyse comme la principale source de production d'ATP à la place de la phosphorylation oxydative [24] . Dans l'étude actuelle, nous avons démontré que, dans les cellules de cancer gastrique, SIRT3 interagit avec et désacétyle LDHA, provoquant une activité accrue de LDHA; et SIRT3 surexpression entraîne une augmentation de la production d'ATP cellulaire et l'activité MnSOD parallèle avec une réduction du niveau de ROS cellulaire, ce qui indique une augmentation de la capacité oxydante de piégeur de SIRT3 éventuellement via l'activation MnSOD enzyme désacétylation médiation. Des preuves croissantes montrent que SIRT3 est nécessaire pour le maintien de l'homéostasie cellulaire et des mitochondries en régulant les mitochondries du métabolisme et du système d'équilibre redox cellulaire, la protection des cellules contre le stress oxydatif par l'intermédiaire de la régulation de la génération de ROS, un mécanisme crucial dans les maladies vieillissement, le cancer et le coeur [1,2, 37]. SIRT3 peut désacétyler un groupe de cibles mitochondries impliquée dans la régulation des deux glycolyse et le stress oxydatif cellulaire. Récemment, SIRT3 se trouve être en mesure de désacétyler et augmenter l'activité pyruvate déshydrogénase dans les cellules cancéreuses, ce qui peut augmenter à la fois la bioénergétique mitochondrial et glycolyse [38]. En accord, l'étude indique que SIRT3 peut désacétyler et activer LDHA qui peut être utilisé aussi bien pour la respiration mitochondriale et de la glycolyse. D'autre part, SIRT3 peut désacétyler et activer par la suite d'autres substrats mitochondriales telles que la MnSOD [11,12], FOXO3 [39] et IDH2 [9] pour piéger les ROS produites par la phosphorylation oxydative, protégeant les cellules contre les dommages oxydatifs [40] . Toujours en accord avec ces conclusions, dans cette étude, nous avons constaté que la surexpression de SIRT3 augmente l'activité MnSOD, qui pourrait être l'une des raisons de la réduction du niveau de ROS cellulaire sous amélioré l'état du métabolisme cellulaire.

LDHA, en tant que membre de la famille de lactate déshydrogénase (LDH), se trouve dans des cellules existe glycolytiques et localisé dans les mitochondries, en plus du cytosol [41] et catalysant principalement l'inter-conversion du pyruvate et de lactate [42]. LDHA est montré à jouer un rôle clé dans la glycolyse aérobie et tumorigénicité dans les cellules malignes [26,27]. Dans les cellules cancéreuses, consomme rapidement LDHA pyruvate produit par glycolyse, conduisant à une augmentation de la production de lactate aérobie [26]. L'inhibition de la production de radicaux libres LDHA induit, une diminution des niveaux d'ATP cellulaire et inhibe la glycolyse, par conséquent, inhibe la croissance des cellules et provoque la mort cellulaire dans le cancer [27]. Composée de ces rapports, nous avons constaté que SIRT3 peut interagir et activer LDHA. Dans la SIRT3 cellules surexprimant, LDHA acétylation a été diminuée avec une activité enzymatique LDHA accrue. Bien que le mécanisme exact provoquant la régulation de LDHA SIRT3 médiation doit encore être étudiée, ces résultats démontrent que LDHA contrôlée voie de la glycolyse qui accélère la bioénergétique de tumeur peut être affectée par des niveaux d'expression de SIRT3.

Notre étude a également révélé que l'expression de un groupe de gènes, tels que MCT1, MCT4, CC2 et Glut1, connu comme régulateurs clés du métabolisme énergétique dans le cancer sont également augmenté dans les cellules de cancer gastrique SIRT3 surexprimant, ce qui démontre le rôle potentiel de SIRT3 dans l'amélioration de la glycolyse dans les cellules tumorales. HK2 catalyse la phosphorylation du glucose en glucose-6-phosphate à la première étape de la glycolyse [43]. transporteur de glucose (GLUT) commande le transport du glucose à travers la membrane plasmique, fonctionnant en tant que première étape limitant la vitesse pour le métabolisme du glucose [44]. MCT1 et MCT4, les membres de monocarboxylates (tels que le lactate et pyruvate) famille des transporteurs, sont également impliqués dans la croissance de la glycolyse dépendante des tumeurs [45]. Ensemble, ces résultats suggèrent une interaction potentielle entre SIRT3 et un groupe de gènes de la glycolyse associée à la signalisation croissance agressive de la tumeur, qui doit encore être étudiée.

En conclusion, bien que SIRT3 est bien caractérisée dans l'homéostasie mitochondriale contre cellule le vieillissement et la transformation, l'expression de SIRT3 dans les cellules tumorales est liée à une meilleure prolifération et la croissance agressive des cellules cancéreuses gastriques. interagit SIRT3 et active LDHA, ce qui conduit à une augmentation de la glycolyse et la production d'ATP, qui, conjointement avec une augmentation de l'activité anti-oxydante MnSOD mitochondriale et une diminution du niveau de ROS intracellulaire (un modèle hypothétique est proposé sur la figure 7C). Ainsi, la fonction de SIRT3 stimulant la croissance démontre une cible potentielle pour traiter les tumeurs avec l'expression de SIRT3.

Informations complémentaires
S1 Fig. Représentatifs diapositives pathologiques pour déterminer l'expression de SIRT3 dans des échantillons de cancer de l'estomac humain.
A, cancer de l'estomac humain paraffine et d'échantillons appariés de tissus pathologiquement normaux adjacents ont été soumis à l'immunohistochimie coloration avec un anticorps SIRT3 (brun), suivie par les noyaux Counterstain avec hématoxyline ( bleu, chaque tumeur a été montré avec les tissus normaux adjacents dans une rangée de 20 × et 40 ×). B, des images représentatives de l'expression de SIRT3 dans les types intestinaux et diffuses de cancer gastrique. Barre d'échelle, 50 um
doi:. 10.1371 /journal.pone.0129834.s001
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S2 Fig. La surexpression de SIRT3 promu la charge tumorale in vivo.
Cellules SGC-7901 avec SIRT3 surexpression (A) ou knockdown (B) ont été injection sous-cutanée dans le flanc droit de la souris nude avec les cellules de contrôle relatives (NF ou Scr) dans la gauche flanc. tumeurs de xénogreffe ont été excisés et pesés au 28e jour après l'inoculation des cellules. Images de panneau de droite ont montré des tumeurs de xénogreffe in vivo à la fin de l'expérience. Images ont montré la croissance tumorale chez la souris
doi:. 10.1371 /journal.pone.0129834.s002
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S3 Fig.

• PLOS ONE: métastase ganglionnaire, un facteur pronostique indépendant unique dans Early Gastric Cancer
• PLOS ONE: Identification et caractérisation de CXCR4-positive cancer gastrique souches Cells