PLOS ONE: SIRT3 Förbättrar glykolys och spridning i SIRT3 uttryck Gastric Cancer Cells

Abstrakt

SIRT3 är en viktig NAD ^{+ - beroende protein deacetylas i mitokondrierna av däggdjursceller, fungerar för att förhindra cellernas åldrande och omvandling via reglering av mitokondriell metabolisk homeostas. Emellertid är SIRT3 också funnit att uttrycka i vissa humana tumörer; dess roll i dessa SIRT3-uttryckande tumörceller behöver belysas. Denna studie visade att uttrycket av SIRT3 upphöjdes i en grupp av gastriska cancerceller jämfört med normala gastriska epitelceller. Även SIRT3 uttrycksnivåer ökade i magsäckens tumörvävnad jämfört med de angränsande icke-tumörvävnad, SIRT3 positiva cancerceller var oftare upptäcks i tarm typ gastric cancer än de diffusa typ gastric cancer, vilket indikerar att SIRT3 är kopplad med subtyper av gastric cancer. Överexpression av SIRT3 främjade cellproliferation och förbättrade ATP generation, glukosupptag, glykogen bildning, MnSOD-aktivitet och laktatproduktion, som hämmades av SIRT3 knockdown, vilket indikerar att SIRT3 spelar en roll vid omprogrammering av bioenergetik i gastriska tumörceller. Ytterligare analys avslöjade att SIRT3 samverkade med och deacetylerad den laktatdehydrogenas A (LDHA), ett nyckelprotein i regleringen anaerob glykolys, förbättra LDHA aktivitet. I konsistens, var ett kluster av glykolys associerade gener uppregleras i SIRT3-överuttryckande gastriska tumörceller. Således, utöver den väldokumenterade SIRT3 medierad mitokondriell homeostas i normala celler, kan SIRT3 förbättra glykolys och cellproliferation i SIRT3-uttryckande cancerceller}

Citation:. Cui Y, Qin L, Wu J, Qu X, Hou C, sön W, et al. (2015) SIRT3 Förbättrar glykolys och spridning i SIRT3 uttryck Gastric cancerceller. PLoS ONE 10 (6): e0129834. doi: 10.1371 /journal.pone.0129834

Redaktör: Xianglin Shi, University of Kentucky, USA

Mottagna: 16 april 2015, Accepteras: 13 maj 2015; Publicerad: 29 juni 2015

Copyright: © 2015 Cui et al. Detta är en öppen tillgång artikel distribueras enligt villkoren i Creative Commons Attribution License, som tillåter obegränsad användning, distribution och reproduktion i alla medier, förutsatt den ursprungliga författaren och källan kredit

datatillgänglighet: Alla relevanta uppgifter är inom pappers- och dess stödjande information filer

Finansiering:. Denna studie har delvis stöd av National Natural Science Foundation i Kina, Key Program (30930105), National 12-5 stödplan projekt av ministeriet för vetenskap och teknik i Kina (2012BAH30F03), National Natural Science Foundation i Kina (31.070.740), den 985 och 211 projekt av Xi'an Jiaotong University (JKL) och National Cancer Institute RO1 bidrag CA152313-01-A1 (JJL).

konkurrerande intressen. författarna har förklarat att inga konkurrerande intressen finns

Introduktion

Sirtuins, en familj av NAD ^{+ - beroende histondeacetylaser (HDAC) i däggdjur celler, är inblandade i ett brett spektrum av fysiska processer, däribland cellöverlevnad, apoptos, metabolism, stressreaktioner, åldrande och livslängd [1,2]. Bland sju Sirtuin medlemmar (SIRT1-7), är SIRT3 den bäst karakteriserade mitokondriell sirtuin, funktion att reglera mitokondriella proteiner involverade i oxidativ fosforylering, fettsyraoxidation, ureacykeln, och antioxidanten respons [2-9]. Flera studier har visat att det roll SIRT3 i ämnesomsättningen och homeostas i normala celler och avslöjade nya mål och substrat för SIRT3 beroende deacetylering [10]. Kim m.fl. rapporterade att SIRT3 är en nyckel mitokondrier protein, och brist på den SIRT3 expression är kopplad till ökad mitokondriell DNA-skada och åldrande, liksom ökad potential att Ras-inducerad celltransformation och SIRT3 medierad MnSOD-aktivering bidrar till den mitokondriella homeostas [11,12]. Till stöd, humana embryonala njurceller 293 (HEK293) celler uppvisar en förbättrad SIRT3 uttryck under oxidativ stress, vilket leder till deacetylering och aktivering av MnSOD [13]. SIRT3 tros fungera som en tumörsuppressorgen och spelar en viktig roll för att öka cell homeostas mot åldrande och cancer.}

Men vissa tumörceller visar uttrycket av SIRT3 och potentiella roll SIRT3 i dessa tumörceller , särskilt dess potential gentemot den aggressiva fenotypen, har varit kontroversiell [14]. SIRT3 uttryck är lägre eller odetekterbar i en array av humana cancerformer, inklusive bröstcancer, glioblastom, cancer i tjocktarmen, och osteosarkom, prostata- och äggstockscancer [11,15,16]. SIRT3 inducerar tillväxthämning och apoptos genom selektiv tysta Bcl-2 i HCT116 celler genom att modulera JNK2 signalväg [17]. Dessutom är SIRT3 rapporterats att bidra till ökad känslighet av humana leukemiceller till kemoterapi möjligen genom induktion av mitokondrier-medierad apoptos [18]. Å andra sidan, SIRT3 uttryck återfinns även ökas vid oral cancer, nod-positiv bröstcancer, matstrupscancer, och sköldkörtel karcinom; och den ökade SIRT3 är förknippad med högre maligna fenotypen och nedreglering av SIRT3 ökar tumör känslighet för anticancerbehandling [19-23]. Dessa resultat uppmärksamma en annan roll SIRT3 i specifika tumörer som måste belysas.

Cancerceller är metaboliskt aktiva och konsumerar mer cellulär bränsle än normala celler. Men cancerceller förlita sig på främst på ATP-syntesen genom aerob glykolys, en funktion som kallas Warburg effekt [24]. En sådan aerob glykolys tros skydda cancerceller bildar oxidativ stress eftersom mitokondrie andning är den viktigaste källan till intracellulära ROS [25]. Den laktatdehydrogenas A (LDHA) är ett enzym styra omvandling mellan pyruvat och L-laktat reversibelt vid det sista steget av anaerob glykolys [26]. Hämning av LDHA minskar tumörframkallande potential med ökad mitokondriell syreförbrukning och minskad mitokondriell membranpotential [26] och övergripande cellulär ATP-produktion och glykolysen [27].

I denna studie undersökte vi den potentiella roll som SIRT3 i magsäcken cancerceller som uttrycker SIRT3. Uttryck av SIRT3 var kopplad med den aggressiva tillväxt, som förmedlades via SIRT3-deacetylerad och aktiverade LDHA, förbättra glykolys och uttryck för en grupp av glykolys associerade gener. Således SIRT3-LDHA-medierad glykolys metabolism kan vara ett potentiellt terapeutiskt mål för behandling av cancerceller som uttrycker SIRT3.

Material och metoder

Cellinjer och kultur

Human magcancer cellinjer MGC-803, HGC-27, SGC-7901 [28] och AGS [29] och immortaliserad human gastrisk epitelcellinje GES-1 [30] hölls i RPMI-1640-medium (Invitrogen) kompletterat med 10% fetalt bovint serum och 1% penicillin /streptomycin, och odlades vid 37 ° C under en atmosfär av 5% CO2.

Immunoutfällning och western blot

Subkonfluenta celler lyserades och lysaten inkuberades med protein A /G agarospärlor plus den rekommenderade mängden av antikroppar mot antingen SIRT3 (Cell Signaling Technology) eller LDHA (Santa Cruze) vid 4 ° C över natten. Proven centrifugerades och separerades genom SDS polyakrylamidgelelektrofores och elektroblottades på nitrocellulosamembran. Efter blockering med 5% fettfri mjölk i TBST, inkuberades membranen med primär antikropp vid 4 ° C över natt följt av inkubering med sekundär antikropp under 1 timme vid rumstemperatur. Proteiner av intresse visualiserades genom ECL detektionskit (Thermo Fisher).

Immunohistokemi assay

Patologiska diabilder av magcancer med intilliggande normala vävnader analyserades genom immunhistokemi analys utfördes enligt tillverkarens instruktioner. Polymer Detection kit för immunohistokemi analys köptes från Zhongshan Golden Bridge bioteknik. I korthet framställdes paraffinsnitt avvaxades och åter hydratiseras i etanol (100%, 90% och 75%). Sektionerna inkuberades med 3% H _{2O 2 vid RT under 10 min och blockerades sedan med icke-immunt getserum vid RT under 15 minuter. Sektionerna inkuberades sedan med primär antikropp till SIRT3 (Cell Signa Technology) under 2 timmar vid RT, följt av anti-kanin sekundär antikropp inkubation under 15 min vid RT. Sektionerna inkuberades sedan med DAB detektionsreagens under 2 minuter vardera, motfärgades med hematoxylin och dehydraded i etanol (90% och 100%). Sektionerna monterades och färgningen analyserades under mikroskopi.}

plasmidkonstruktion och cell transfektion

SIRT3 hela längd cDNA syntetiseras med användning av RT-PCR med totalt RNA extraherat från GES-1-celler som mall (primrar: 5 'CCGCGGTACCATGGCGTTGTGGGGTTG 3' och 5 'CCGCTCTAGACTATTTGTCTGGTCCATCAAGC 3'). CDNA klonades sedan in pcDNA3.1 + expressionsvektor (Invitrogen). Den pGPH1 /GFP /Neo-SIRT3-shRNA plasmid targeting human SIRT3 (5 'CTTGCTGCATGTGGTTGAT 3') och styr shRNA plasmiden erhölls från GenePharma. För att generera stabila transfektanter var AGS och SGC-7901 celler transfekterade med hjälp av Lipofectamine 2000 reagens (Invitrogen) och stabila transfektanter valdes med 400ug /ml G418 (Gibco).

Celltillväxt och klonogenicitet analys

För proliferationsanalysen ströks celler ut i en 6-brunnars platta vid 2 x 10 ^{4 celler /brunn. Cellproliferation beräknades på dag 2, 4, 6, och 8 efter utstrykning. För klonogenicitet analys ströks celler ut i en 6-brunnsplatta med varierande cellantal och odlades under 14 dagar och kolonierna färgades sedan med kristallviolett, och antalet kolonier (mer än 50 celler /koloni) räknades efter de etablerade metoder [31].}

Mätning av glukos, laktat och glykogen

fenolrött fria mediet användes för att odla celler i 6-brunnar i 24 timmar och nivåerna av glukosupptag och laktat generation mättes med användning av Glucose Assay Kit och mjölksyra Kit (Jiancheng Bioengineering Institute). De relativa värdena normaliserades till cellantalet för varje brunn. Cellular glykogennivåer detekterades med hjälp av glykogen Assay Kit (BioVision). I korthet, 1 x 10 ^{6-celler homogeniserades i 200 pl vatten på is, och homogenaten kokades under 5 minuter för att inaktivera enzymer och centrifugerades vid 13000 rpm under 5 minuter vid 4 ° C för att avlägsna olösligt material. Glykogenproduktion mättes med OD-värdet vid 570 nm.}

Mätning av ATP-produktion

Cellulär ATP och ROS-nivåer mättes såsom beskrivits tidigare [32]. Celler odlade i en 6-brunnsplatta efter olika behandlingar, lyserades och cellulära ATP-nivåer mättes med ATP Bioluminescence Assay Kit (Sigma). För mätning av glykolysen-förmedlad ATP-produktion, behandlades celler med 2 | iM rotenon i 24 timmar innan mätningar.

Mätning av ROS generation

Cellular ROS generation analyserades med 5- (och -6) karboxi-2 ', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetat (DCFDA) metod med användning av mikroplatt spektrometer (Thermo Fisher) vid 488 nm /530 nm våglängd.

MnSOD-aktivitet

Celler odlade i en 6-brunnars plattan lyserades och MnSOD aktivitet bestämdes genom WST-8 metoder med användning av MnSOD analyskitet (Beyotime) genom att följa tillverkarens instruktioner.

tumorigenicitet analyser i nakna möss

SGC7901-celler (7,5 x 10 ^{6) med SIRT3 överuttryck eller knockdown suspenderades i 0,1 ml PBS och ympades i antingen flanken av 5 veckor gamla BALB /c-atymiska nakna möss, och vid den 28 e dagen efter ympningen, när den maximala tumörvolym (~ 1500 mm 3) nådde i kontrollgruppen, var experimenten avslut och alla tumörer från varje grupp skars ut och vägdes. Den experimentella förfarande som inbegriper djurförsök genomfördes i enlighet med de institutionella riktlinjerna; Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) vid Xian Jiao Tong University uttryckligen godkänt denna studie (protokollx181).}

Laktatdehydrogenas analys

laktatdehydrogenas-aktiviteten bestämdes efter det etablerade protokoll genom att mäta reduktionshastigheten av absorbansen vid våglängden av 340 nm är resultatet av oxidationen av NADH [27]. Kortfattat odlades cellerna i 10 cm skålar och homogeniserades i PBS på is. Homogenaten läggs in i buffert innehållande 6,6 mM NADH, 30 mM natriumpyruvat och 0,2 M Tris-HCl, pH 7,3 och blandades. Inkubera blandningen i 5 minuter för att uppnå temperatur jämvikt och sedan spela minskningen hastigheten absorbans vid 340 nm.

SIRT3 In vitro
deacetylering analys

Human SIRT3 rekombinant enzym ( BPS) inkuberades med L-laktatdehydrogenas från bovin hjärt (Sigma) i reaktionsbuffert (50 mM NaCl, 4 mM MgCb _{2, 10 mM NAD ^{+, 50 mM DTT, 50 mM Tris, pH 8,0) med /utan SIRT3 inhibitor nikotinamid (NAM, 10 mM) vid 37 ° C under 1,5 timmar, och sedan reaktionerna användes för LDHA aktivitetsanalysen beskriven enligt ovan.}}

Realtids tids~~POS=HEADCOMP-PCR

totalt RNA isolerades med användning av TRIZOL Reagent (Invitrogen), följt av behandling med fenol /kloroform och utfällning med 2-propanol. Totala RNA-pelleten tvättades sedan med 75% etanol och återsuspenderades i vatten. RNA utsattes för omvänd transkription med PrimeScript RT-PCR-Kit (Takara) och kvantitativ realtids-PCR-analys av gener av intresse genomfördes med användning SYBR PremixExTaq II kit (Takara) genom att följa tillverkarens instruktioner. Data normaliserades till den nivå av γ-tubulin.

Immunofluorescens

AGS celler sådda på täckglas i en platta med 6 brunnar fixerades i 4% paraformaldehyd under 10 min och blockerades i 1% BSA under en timme vid rumstemperatur. Inkubera cellerna med primära antikroppar mot SIRT3 och LDHA vid 4 ° C över natten, följt av inkubering med fluorescens-konjugerad sekundär antikropp under 1 timme vid rumstemperatur. Motfärgning utfördes med DAPI använder immunofluorescens kit (Beyotime). Cellerna monterades och avbildas av laserskanning konfokalmikroskop.

Statistisk analys

Data presenteras som medelvärde ± SE från åtminstone tre oberoende experiment. Statistisk analys utfördes med oparade två-tailed Students t-test såvida inte annat anges. P Hotel < 0,05 ansågs signifikant.

Resultat

SIRT3 uttryck i gastric cancerceller

SIRT3 är väldefinierad i regleringen av mitokondrie homeostas i anti-aging och anti-transformation. Nyligen har olika resultat rapporteras om till SIRT3-medierad cellhämning och spridning, vilket leder till kontroverser av sina roller i cancer [19,20]. För att bestämma den potentiella rollen för SIRT3 i magcancer, var uttryck av SIRT3 upptäcktes i 4 magcancer cellinjer AGS, SGC-7901, MGC-803, HGC-27 och en grupp av magcancer tumörvävnader. Vi fann att SIRT3 proteinnivåer var förhöjda i alla 4 gastric cancercellinjer jämfört med förevigade gastric epithelial GES-1-celler (AGS, 1,9-faldigt, SGC-7901, 1,5-faldigt, MGC-803, 2,0-faldiga och HGC -27, 1,8-faldigt jämfört med GES-1-celler) (figur 1A). I enlighet ades mRNA-nivåer av SIRT3 i dessa cellinjer också ökat (AGS, 2,6 gånger, SGC-7901, 1,7-faldigt, MGC-803, 2,5-faldigt, HGC-27, 2,2-faldig) jämfört med GES- 1-celler (Fig 1b).

Immunohistokemi analys i tumören och intilliggande icke-tumör normala vävnader från en grupp av patienter med ventrikelcancer visade att SIRT3-positiva celler var mer frekvent detekterbar i tumörvävnader än i normala vävnader. Resultaten visade att 55,1% av tumörvävnader (7% av normala vävnader) uppvisade hög nivå (starkt positivt), 41,4% av tumörvävnader (28% av normala vävnader) uppvisade medelhög nivå (svagt positiv), medan 3,5% av tumör vävnader och 64% av normala vävnader var negativa i SIRT3 uttryck (Fig 1C och 1D, S1A Fig). Intressant SIRT3 uttryck i intestinal typ av tumörvävnad (15 fall, 93,3% stark positiv och 6,6% svagt positiv) var betydligt högre än i diffus typ av tumörvävnad (14 fall, 14,3% starkt positiv, 78,6% svagt positiv och 7,1 % negativa) (Fig 1C och 1E, S1B Fig). Dessa resultat tyder på att SIRT3 uttryck ökar i vissa tumörer jämfört med tillhörande normala vävnader och SIRT3 uttryck kan vara variera i enskilda tumörer, som behöver utredas ytterligare.

SIRT3 nivåer är kopplade till celltillväxt

Sedan har vi etablerat SIRT3 uttryck och knockdown cellinjer med hjälp av AGS och SGC-7901 celler. Uttrycket av SIRT3 i stabila transfektanter bekräftades genom western blöt. Överuttryck av SIRT3 ökad celltillväxt, medan SIRT3 knockdown hämmade celltillväxt både gastriska cancercellinjer (fig 2A). Vidare, överuttryck av SIRT3 utlöste mer kolonibildning än kontroll transfekterade celler som var i motsats till bara färre kolonier som bildats i SIRT3 knockdown celler (Fig 2B).

För att ytterligare bestämma roll SIRT3 i tumörbildning förmåga, vi injicerade SIRT3 uttryck och knockdown SGC-7901 celler i flankerna av nakna möss och tumörtillväxt fick 28 dagar efter cell ympning (S2 Fig). Den genomsnittliga vikten av tumörerna härledda från SIRT3 överuttryckande celler var 0.7079g, betydligt större än den genomsnittliga tumörvikten av kontroll (NC), p
= 0,015, (fig 2C, vänstra panelen). Däremot var den genomsnittliga vikten av tumörer som härrör från SIRT3 knockdown celler 0.0588g, betydligt mindre än den från scramble shRNA kontrollceller (SCR) (0.2033g; p
= 0,009) (Fig 2C, högra panelen) . Medelvolymen av tumörer som härrör från SIRT3 överuttryckande celler ökades än från kontrollceller (NC) (Fig 2C, vänster panel upp till höger). Tvärtom, den genomsnittliga volymen av tumörer som växer från SIRT3 knockdown celler var dramatiskt liten jämfört med den från kontrollceller (SCR) (Fig 2C, högra panelen upp höger).

Förbättrad glykolys i SIRT3 uttrycker magcancer celler

Vi var sedan undrar hur mobil bioenergetik skulle kunna ändras i SIRT3-överuttryckande gastriska cancerceller. SIRT3 uttryck dramatiskt ökad glukosupptag (1,4-faldigt i AGS och 1,9-faldig i SGC-7901), medan SIRT3 knockdown minskade glukosupptag (cirka 40% i båda AGS och SGC-7901) (figur 3A och 3B). Överensstämmer med mönstret av glukosanvändning, hade SIRT3 överuttryckande celler ökade nivåer av laktat sekretion (1,2-faldig i AGS och 1,3-faldigt i SGC-7901), medan SIRT3 knockdown-celler hade minskade nivåer av laktat sekretion (55% i AGS och 45 % i SGC-7901) (Fig 3C och 3D). Vi fann också att glykogen bildningen signifikant ökade med SIRT3 uttryck (1,5-faldigt i AGS och 1,3-faldig i SGC-7901), en funktion av snabb tillväxt av tumörceller [33], medan minskat med SIRT3 knockdown (40% i AGS och 70% i SGC-7901) (figur 3E och 3F).

SIRT3 har visat involverad i deacetylering av globala ämnesomsättning enzymer och underhåll av basala ATP-nivåer i celler både i normalt skick och i sjukdomar [1 , 2]. Totalt cellulärt ATP och glykolys ATP generation upptäcktes i AGS och SGC-7901 celler med antingen SIRT3 uttryck eller SIRT3 knockdown. De totala cellulära ATP-nivåer höjdes i SIRT3 överuttryckande celler (cirka 1,3-faldigt i båda cellinjerna), men minskade i SIRT3 knockdown-celler (cirka 75% i båda cellinjer) jämfört med NC eller Scr kontrollceller (fig 4A och 4B) . Då vi behandlade celler med rotenon att hämma oxidativ fosforylering, och testade ATP generation från glykolysen. Såsom visas i fig 4C och 4D, ledde SIRT3 överuttryck till en ökning i glykolys ATP-produktion (1,4-faldig i AGS och 1,6-faldigt i SGC-7901), medan SIRT3 knockdown ledde till en signifikant minskning av glykolysen ATP-produktion (20% i AGS och 40% i SGC-7901) jämfört med NC eller Scr kontroll.

SIRT3 reglerar homeostas ROS i gastric cancerceller

en mängd bevis stöder att ökad ROS-nivå är en kritisk egenskap i cancerceller, som gör cancerceller mer känsliga för ytterligare ROS påfrestning [34]. Här visade det sig att överuttryck av SIRT3 minskade ROS nivåer för att 70% och 80% i AGS och SGC-7901-celler, medan hämning av SIRT3 expression ökade ROS nivåer (1,4-faldigt i AGS-celler och 1,6-faldigt i SGC-7901-celler) respektive (figur 5A och 5B). I samförstånd med litteraturen visar SIRT3 deacetylates och aktiverar MnSOD (11, 12), i magcancer celler, MnSOD aktivitet förbättras genom SIRT3 uttryck (1,4-faldig i AGS celler och 1,2-faldig i SGC-7901 celler), men minskas med SIRT3 knockdown (50% i AGS-celler och 65% i SGC-7901 celler) (Fig 5C och 5D), vilket tyder på att SIRT3 kan skydda celler från oxidativ stress-inducerad skada genom omfördelning intracellulära ROS genom att öka MnSOD aktivitet i mag cancerceller.

SIRT3 deacetylates och aktiverar LDHA

LDHA spelar en nyckelroll i tumör initiering, underhåll och utveckling. Inhibering av LDHA aktivitetsblock tumorigenicitet och tumörprogression [26,27] och LDHA aktivitet kan regleras genom acetylering /deacetylering modifiering [35]. Vi undrade om SIRT3 är involverat i regleringen av LDHA aktivitet. Vi fann att, i gastriska cancerceller, var LDHA aktiviteten signifikant förhöjd i SIRT3-överuttryckande celler, medan minskade i SIRT3 knockdown celler jämfört med NC eller Scr kontrollceller separat utan detekterbar förändring i LDHA proteinnivån i de stabila transfektanter (fig 6A). Immunfärgning Resultaten visade att LDHA och SIRT3 var samlokaliserade i cytoplasman (fig 6B), och co-IP-analys med antingen LDHA eller SIRT3 antikropp avslöjade att SIRT3 är i stånd att interagera med LDHA (fig 6C). Dessutom var nivån av LDHA acetylering minskade i SIRT3 överuttryckande celler, men ökade i SIRT3 knockdown-celler (fig 6D). Vidare, in vitro
LDHA aktivitetsanalys utfördes med användning av kommersiellt humant rekombinant SIRT3 och bovint hjärta L-laktatdehydrogenas indikerade att LDHA aktivitet ökade med närvaron av SIRT3 i reaktionen, som reverserades genom tillsats av SIRT3 inhibitor , nikotinamid (Fig 6E). För att identifiera potentiella SIRT3 deacetylering webbplats (s) på LDHA, sökte vi databas och fann att K5, K14, K57, K81, K118, K126, K222 och K318 är potentiella acetylering platser i LDHA, och tidigare studie rapporterade att K5 acetylering /deacetylering var inblandad i regleringen av LDHA aktivitet [35]. Sedan gjorde vi LDHA aktivitetsanalys med hjälp av lysin 5 och lysin 318 acetylering härma (K5Q /K318Q) eller deacetylering härma (K5R /K318R) mutant LDHA, och fann att varken K5 eller K318 krävdes för SIRT3 medierad LDHA aktivering (S3 Fig). Ytterligare identifiering av SIRT3-medierad LDHA deacetylering är i nöd.

SIRT3 uppreglerar gener som är involverade i cellulär metabolism

För att karakterisera den molekylära signatur av SIRT3-LDHA förmedlade bioenergetik i gastric cancerceller, vi mätte uttryck av gener förknippade med glukos transport och glykolys. Data i Fig 7A och 7B visade att överuttryck av SIRT3 i AGS eller SGC-7901 inducerade uttrycket av HK2 (1,47-faldigt i AGS celler, 1,3-faldig i SGC-7901 celler), MCT4 (2,3-faldig i AGS celler, 1,34 -faldigt i SGC-7901-celler) och glut1 (1,55-faldigt i AGS-celler, 1,38-faldigt i SGC-7901-celler) vid mRNA-nivån testas genom realtids-PCR. Tvärtom SIRT3 knockdown minskade uttrycket av genen HK2 till 76%, MCT4 till 73% och glut1 till 62% i AGS-celler, medan HK2 till 80%, MCT4 till 62% och glut1 till 74% i SGC-7901-celler. Dessutom, när SIRT3 överuttrycktes ades MCT1 mRNA-nivån ökade i AGS-celler genom 1,6-faldigt, men inte i SGC-7901-celler, och när SIRT3 ades knockdown, var MCT1 minskade till 59% i AGS och 65% i SGC-7901-celler , respektive.

Diskussion

Denna studie ger belägg som tyder på att SIRT3 uttrycks i vissa cancerceller, såsom gastriska cancerceller, kan kopplas med den förbättrade aggressivitet genom SIRT3 medierad bioenergetik via deacetylering och aktivering av LADH. Även ackumulera bevis tyder på att SIRT3 spelar en nyckelroll i skydd av normala celler mot åldrande och malign transformation, dess funktion i redan transformerade celler såsom tumörceller som uttrycker SIRT3 behöver utredas [19]. Brist på SIRT3 i MEF leder till genomisk instabilitet och en hög frekvens av celltransformation medierad av Ras med en ökad frekvens av tumörbildning och åldrande, vilket tyder på att SIRT3 är nödvändigt att förebygga cellulära åldrandet och cancer [11,15]. Dessutom är bristen på eller lägre uttryck av SIRT3 upptäckts i flera humana cancrar och SIRT3 nivå är förknippad med känsligheten hos cancerceller att kemo- och radioterapi [11,15,16]. Men SIRT3 visas också vara överuttryckt i humana cancrar och i samband med behandling motstånd [19,21,36]. Dessa resultat tyder på att SIRT3 kan rikta olika proteiner mellan normala celler och cancerceller, och att SIRT3 uttryck kan varieras på olika typer av cancer, såsom de aktuella resultat som indikerar att den intestinala typen av magcancer uttrycker en högre nivå av SIRT3 än det diffusa typ av magcancer.

det har varit allmänt accepterat att tumörceller förbrukar mer cellernas energi för att stödja den snabba tillväxten och proliferation än de normala cellerna använder glykolys som den viktigaste källan till ATP generationen i stället för oxidativ fosforylering [24] . I föreliggande studie visade vi att, i gastriska cancerceller, SIRT3 interagerar med och deacetylates LDHA, vilket orsakar ökad LDHA aktivitet; och SIRT3 uttryck leder till ökad cellulär ATP-produktion och MnSOD aktivitet parallellt med minskad cell ROS nivå, vilket tyder på en ökad oxidativ renhållare förmåga SIRT3 eventuellt via deacetylering-medierad MnSOD enzymaktivering. Ökande bevis visar att SIRT3 krävs för upprätthållande av cellulära och mitokondrier homeostas genom reglering av mitokondrier metabolism och cellulära redox balanssystemet, skyddar cellerna mot oxidativ stress genom att reglera ROS generation, en kritisk mekanism åldrande, cancer och hjärtsjukdomar [1,2, 37]. SIRT3 kan deacetylera en grupp av mitokondrier mål inblandade i regleringen av både glykolys och cellulär oxidativ stress. Nyligen har SIRT3 funnit kunna deacetylera och öka pyruvatdehydrogenas aktivitet i cancerceller, vilket kan öka både mitokondriella bioenergetik och glykolysen [38]. Efter överenskommelse, visar den aktuella studien att SIRT3 kan deacetylera och aktivera LDHA som kan användas för både mitokondriell andning och glykolys. Å andra sidan, kan SIRT3 deacetylera och därefter aktivera andra mitochondria substrat, såsom MnSOD [11,12], Foxo3 [39] och IDH2 [9] för att scavenge ROS produceras av oxidativ fosforylering, skyddar celler från oxidativ skada [40] . Också i linje med dessa resultat i denna studie fann vi att överuttryck av SIRT3 ökar MnSOD aktivitet, vilket kan vara en orsak av minskad cell ROS nivå under förstärkt cellulär metabolism tillstånd.

LDHA, som en familjemedlem till laktat (LDH), påträffas existerade i glykolytiska celler och lokaliserade i mitokondrier i tillägg till cytosolen [41], och i huvudsak katalysera inter omvandlingen av pyruvat och laktat [42]. LDHA har visat sig spela en nyckelroll i aerob glykolys och tumörbildning i maligna celler [26,27]. I cancerceller, LDHA förbrukar snabbt pyruvat producerad av glykolytiska vägen, vilket leder till ökad aerob laktat produktion [26]. Inhibering av LDHA inducerar ROS-produktionen minskar cellulära ATP-nivåer och hämmar glykolys, därför hämmar celltillväxt och utlöser celldöd i cancer [27]. Bestående med dessa rapporter, fann vi att SIRT3 kan interagera och aktivera LDHA. I SIRT3 överuttryckande celler, var LDHA acetylering minskade med en ökad LDHA enzymaktivitet. Även exakta mekanismen som orsakar SIRT3-medierad LDHA reglering behöver utredas ytterligare, visar dessa resultat att LDHA kontrollerade glykolys väg som accelererar tumör bioenergetik kan påverkas av SIRT3 expressionsnivåer.

Vår studie visade också att uttrycket av en grupp av gener, såsom MCT1, MCT4, HK2 och glut1, känd som viktiga regulatorer av energiomsättningen i cancer är också ökat i SIRT3-överuttryckande gastriska cancerceller, vilket visar en potentiell roll SIRT3 i att öka glykolysen i tumörceller. HK2 katalyserar fosforylering av glukos till glukos-6-fosfat vid det initiala steget av glykolys [43]. Glukostransportör (GLUT) styr transporten av glukos över plasmamembranet, som fungerar som den första hastighetsbegränsande steget för glukosmetabolism [44]. MCT1 och MCT4, medlemmar av monokarboxylater (såsom laktat och pyruvat) transportör familj, är också involverade i tillväxten av glykolys beroende tumörer [45]. Tillsammans utgör dessa resultat tyder på en potentiell samspel mellan SIRT3 och en grupp av glykolys associerade gener i signaltumör aggressiv tillväxt, som måste utredas vidare.

Sammanfattningsvis, även om SIRT3 är väl kännetecknat av mitokondrie homeostas mot cell åldrande och transformation, är uttrycket av SIRT3 i tumörceller kopplade med förbättrad spridning och aggressiv tillväxt av gastric cancerceller. SIRT3 samverkar och aktiverar LDHA, vilket leder till ökad glykolys och ATP-produktion, som tillsammans med ökad mitokondrie antioxidant MnSOD aktivitet och minskad intracellulär ROS nivå (en hypotetisk modell föreslås i figur 7C). Således tillväxtstimulerande funktion SIRT3 visar ett potentiellt mål för behandling av tumörer med SIRT3 uttryck.

Bakgrundsinformation
S1 Fig. Representativa patologiska bilder för att bestämma SIRT3 uttryck i humana magcancer exemplar.
A, paraffininbäddade human magcancer och parade intilliggande patologiskt normala vävnadsprover utsattes för immunohistokemi färgning med SIRT3 antikropp (brun), följt av kärnor Motfärga med hematoxylin ( blå, varje tumör visades med närliggande normala vävnader i en rad med 20 × och 40 ×). B, representativa bilder av SIRT3 uttryck i tarm och diffusa typer av magcancer. Skala bar, 50 um
doi:. 10,1371 /journal.pone.0129834.s001
(TIF) Review S2 Fig. Överexpression av SIRT3 främjas tumörbörda in vivo.
SGC-7901 celler med SIRT3 överuttryck (A) eller knockdown (B) injicerades subkutant in i högra flanken av nakenmöss med de relativa kontrollceller (NC eller SCR) in i vänster flank. Xenograft tumörer skars ut och vägdes vid 28: e dagen efter cellympning. Bilder av högra panelen visade xenograft tumörer in vivo vid slutet av experimentet. Bilder visade tumörtillväxt i möss
doi:. 10,1371 /journal.pone.0129834.s002
(TIF) Review S3 Fig.

• PLOS ONE: Lymph Node metastaser, en unik oberoende prognostisk faktor i tidig ventrikelcancer
• PLOS ONE: Identifiering och karakterisering av CXCR4-positiv Gastric cancerstamceller