Abstrakt
Baggrund
For at forbedre resultatet af patienter, der lider af mavekræft, en bedre forståelse af de underliggende genetiske og epigenetiske begivenheder i denne malignitet er påkrævet. Selvom CpG ø methylator fænotype (CIMP) og mikrosatellit instabilitet (MSI) har vist sig at spille afgørende roller i mavekræft patogenese, den kliniske betydning af disse begivenheder på overlevelse udfald hos patienter med mavekræft er fortsat ukendt.
Denne undersøgelse omfattede en patient kohorte med patologisk bekræftet mavekræft, som havde kirurgiske resektioner. En kohorte af 68 gastrisk kræft blev analyseret. CIMP og MSI statusser blev bestemt ved at analysere promotor CpG ø methylering status for 28 gener /loci, og genomisk ustabilitet på 10 mikrosatellitmarkører hhv. En Cox 'proportionale farer model blev udført for multivariat analyse, herunder alder, scene, tumor differentiering, KRAS Resultater Ved multivariat analyse blev længere OS signifikant korreleret med lavere patologisk stadium ( P CIMP og /eller MLH1 Henvisning:. Shigeyasu K, Nagasaka T, Mori Y, Yokomichi N, Kawai T, Fuji T, et al. (2015) kliniske betydning af MLH1 Methylering og CpG Island Methylator Fænotype som prognostiske markører i patienter med gastrisk kræft. PLoS ONE 10 (6): e0130409. doi: 10,1371 /journal.pone.0130409 Redaktør: Hassan Ashktorab, Howard University, UNITED STATES Modtaget: Februar 18, 2015; Accepteret: 20 maj 2015; Udgivet: 29 juni 2015 Copyright: © 2015 Shigeyasu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af KAKENHI tilskud 19390351 og 20590572 til TN, og ved tilskud R01 CA72851 og 181.572 fra National Cancer Institute, National Institutes of Health, og midler fra Baylor Research Institute til AG konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser Introduktion Gastrisk kræft er den anden hyppigste årsag til kræft. -relaterede dødsfald, med omkring 700.000 bekræftede dødelighed årligt på verdensplan, selvom forekomsten gradvist er faldet [1-3]. Mavekræft er generelt diagnosticeret på et fremskredent stadium, hvilket er den primære årsag til dens dårlig prognose [4]. At forbedre resultatet af gastrisk cancer, er identifikation af genetiske eller epigenetiske begivenheder i progressionen af mavekræft påkrævet. Den vigtigste epigenetisk begivenhed i progressionen af cancer er methylering af promotorelementer CpG regioner af centrale tumorsuppressorgener. CpG-øer er næsten 1-kb lange sekvenser af DNA med høj guanin-cytosin indhold i promotorregioner af [5] generne. I modsætning til normale celler, er CpG-øer i tumorsuppressorgener i cancerceller ofte hypermethyleret, hvilket fører til et CpG island methylator fænotype (CIMP) [6,7]. Epigenetisk inaktivering af tumor-relaterede gener som følge af CpG ø metylering er for nylig blevet rapporteret i gastrisk cancer. Afvigende CpG ø methylering af > 100 vækst-regulatoriske gener i gastrisk kræft har hidtil været rapporteret [8-24], men den kliniske betydning af CIMP i mavekræft forbliver uudforsket og dårligt forstået I modsætning. , mismatch repair (MMR) mangel i gastrisk cancer er også en vigtig genetisk hændelse. Genomisk instabilitet i antallet af mikrosatellitmarkørerne gentagelser (eller mikrosatellitter) betegnes mikrosatellit instabilitet (MSI). MSI er en funktion, forårsaget af et defekt DNA MMR-system. Funktionel inaktivering af MMR-gener, såsom MLH1 På baggrund af dette hul i viden, i denne undersøgelse, vi undersøgt betydningen af CIMP og MMR-mangel i mavekræft og bestemt deres bidrag som prognostiske markører hos patienter med mavekræft. Materialer og metoder Vævsprøver Denne undersøgelse omfattede en kohorte af patienter med patologisk bekræftet gastrisk cancer, som havde gennemgået kirurgisk resektion ved Okayama University Hospital (Okayama, Japan) 1998-2004. blev analyseret i alt 68 mavekræft væv og deres matchede normale gastriske slimhinde. Alle normale maveslimhinden væv blev opnået fra steder grænsende til, men mindst 5 cm fra den oprindelige tumor. Alle patienter skal have skriftligt informeret samtykke og undersøgelsen blev godkendt af den etiske komité i Okayama Universitetshospital. Alle patienter skal have skriftligt informeret samtykke til brug af deres data for fremtidige analyser. Alle gastriske cancere og normal gastrisk mucosa var frisk-frosset vævsprøver, hvorfra DNA blev ekstraheret under anvendelse af et QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN). MSI-analyse blev udført ved undersøgelse af 2 mononukleotid gentagelser (BAT25 og BAT26), 12 dinukleotid gentagelser (D17S250, D18S35, D18S58, D18S69, D2S123, D4S1559, D4S2381, D4S470, D5S107, D5S346, og D8S87, TP53), og én tetranukleotid gentagelser, MYCL, som tidligere beskrevet [ ,,,0],31]. Tumorer, der viser allele skift i ≥5 af 15 markører blev klassificeret som MSI-H (herefter kaldet "MSI"), og resten blev klassificeret som mikrosatellit stabil (MSS). Da hyppig hypermethylering af flere gener er en af de karakteristiske træk ved tumorer med CIMP, vi undersøgte status for 28 promoter CpG ø-relaterede loci methylering ( APC Direkte sekventering blev udført for at identificere KRAS JMP software (ver 10,0, SAS Institute Inc .) blev anvendt til statistisk analyse. T-test blev anvendt til sammenligning af kontinuerlige variabler, og Fishers eksakte test blev anvendt til at analysere kategoriske variable. Samlet overlevelse (OS) blev målt fra driften dato dødsdagen. statistik De Kaplan-Meier-metoden og log-rank for forskelle mellem de forskellige prognostiske faktorer blev anvendt til at estimere OS distributioner. Cox proportional hazard modeller blev anvendt til beregning af hazard ratio (HR) med tilsvarende 95% konfidensinterval (CI). Univariate eller multivariat logistisk regressionsanalyse blev udført for at bestemme forskellene i HR mellem hver gruppe. Alle indberettede P studiepopulation I denne undersøgelse undersøgte vi 68 patienter med mavekræft. I promoter CpG'er i MLH1 28 CpG loci herunder APC Overlevelse resultater hos patienter baseret på MLH1 3 ' overlappende forholdet mellem CIMP og MLH1 3 ' Ligeledes 5-årige OS satser blev analyseret for de CIMP-høje og CIMP-lave grupper, og satsen var lidt højere i CIMP høje gruppen end i CIMP-lave gruppe, men forskellen var ikke signifikant ( log-rank P Bidrag af fejlparringsreparationsmangel og CIMP status til overlevelsesraten De 5-årige overlevelsesrater blev analyseret og sammenlignet blandt disse grupper; CIMP-høj / MLH1 3 ' forholdet mellem MLH1 overlappende forhold mellem MLH1 5' multivariat analyse for overlevelse outcome prædiktorer en Cox proportionel risiko model, herunder alder, scene, differentiering, KRAS DNA methylering i cancerceller er blevet et emne for intens undersøgelse. Inaktivering af tumorsuppressorgener af CpG-methylering af promotorregioner accelererer carcinogenese grund af afvigende cellecyklusregulering og proliferation [15]. Nogle kandidat afvigende denatureret gener i mavekræft er blevet rapporteret. RASSF1A Samtidig CpG methylering i flere gener er blevet defineret som CIMP i kolorektal cancer (CRC) og gastrisk kræft [15,40,53- 57], og er blevet vist at korrelere med hypermethylering af tumorsuppressorgener. Men beviserne for CIMP i gastrisk cancer er ikke så overbevisende som det er tilfældet for CRC [58,59]. I gastrisk cancer, har CIMP-high blevet beskrevet i 41% [40] og 31% [54] tumorer. Patienter med CIMP-high mavekræft har betydeligt kortere overlevelse end dem med CIMP-lav mavekræft [54,60]. En anden rapport viste, at CIMP var forbundet med bedre overlevelse i gastrisk kræft [54]. Den seneste meta-analyse har fokuseret på den stærke relation CIMP med H. pylori, EBV, og MSI, men CIMP kunne ikke vise en prognostisk potentiale for mavekræft [61]. I modsætning ustabilitet på mikrosatellitter gentagelser inden for forskellige vækstregulerende gener er defineret som MSI. En standard panel, såsom NCI-panelet, anbefales, herunder mononukleotid (BAT26 og BAT25) og dinukleotid (D2S123, D5S346 og D17S250) gentager [62]. Tre niveauer af MSI kan identificeres: højt niveau MSI (MSI-H), lavt niveau MSI (MSI-L), og MSS. MSI-H fænotype i mavekræft blev rapporteret til at tegne sig for 5% -50% MSI positive neoplasmer [17]. MSI er en funktion, forårsaget af et defekt DNA MMR-system. Funktionel inaktivering af MMR-gener, såsom MLH1 Som beskrevet ovenfor CIMP og MMR-mangel status er centrale elementer i mavekræft og kan afspejle overlevelse forskelle i patienter, der lider af denne malignitet. Signifikant sammenhæng mellem CIMP og MSI er blevet rapporteret i GC [61]. Men data vedrørende de synergistiske virkninger af disse parametre er knappe, og er nødvendig multivariat analyse af disse genetiske og epigenetiske parametre. I vores undersøgelse, CACNA1G Men CIMP og MMR-mangel er afhængige af hinanden. MSI-associerede opstår sporadiske CRC'er gennem en proces, der involverer CIMP [66,71]; Derfor bør udføres integreret statistisk analyse af CIMP og MMR-mangel. For eksempel i duodenal adenokarcinomer, CIMP / MLH1 Som konklusion, vores data tyder på, at lagdeling af patienter med CIMP baseret på MLH1
mutation status, og kombineret CIMP / MLH1
methylering status i forhold til samlet overlevelse (OS).
= 0,0088), bedre tumor differentiering ( P
= 0,0267) og CIMP-høj og MLH1 3 '
methylerede status ( P
= 0,0312). Stratificering af CIMP status med hensyn til MLH1
methylering status yderligere aktiveret forudsigelse af mavekræft prognose.
Konklusioner
status methylering kan have et potentiale for at være prognostiske biomarkører for patienter med mavekræft
eller MSH2
ved promotor methylering er ansvarlig for MSI-høj (MSI-H) fænotype i mavekræft. I en tidligere undersøgelse, mavekræft med MSI-H viste en højere frekvens af antral beliggenhed, intestinal subtype, lavere forekomst af lymfeknudemetastase og forbedret overlevelse sammenlignet med mikrosatellit stabil (MSS) eller MSI-L gastriske cancere [17,25 -30]. Men den kliniske betydning af MMR-mangel i mavekræft er fortsat ukendt.
MSI analyse
Natriumbisulfit modifikation og CIMP analyser
, CACNA1G
, CHFR
, COX2
, DAPK
, DCC
, HPP1
, MGMT-Mp region
, MGMT-Eh omegn, MINT1
, MINT2
, MINT31
, MLH1 5 '
, MLH1 3 '
, P14
, p16
, RASSF1A
, RASSF2A-regionen1
, RASSF2A-region2
, RASSF3
, RASSF5
, RASSF6
, RUNX3
, SFRP2-regionen1
, SFRP2- region2
, UNC5C
, 3OST2
, FOXL2
), og de tilsvarende primersekvenserne er anført i S1 tabel. Genomisk DNA blev bisulfit modificeret til at konvertere alle ikke-methylerede cytosinrester til uraciler. Kort fortalt 0,5-2,0 pg DNA blev denatureret i NaOH, behandlet med natriumbisulfit, og oprenset ved anvendelse af Wizard DNA Clean-up system (Promega). status methylering af hver CIMP-relateret locus blev evalueret ved kombineret bisulfit restriktionsanalyse (COBRA). Polymerasekædereaktion (PCR) for COBRA blev udført på et bisulfit-modificerede template-DNA i et 25-pi PCR-blanding indeholdende 12,5 pi HotStarTaq Master Mix (Qiagen), 0,5 mmol /l af hver PCR-primer, og ca. 25 ng bisulfit-modificeret DNA. PCR-produkter blev fordøjet ved tilsætning af restriktionsenzym ved 37 ° C i 12 timer. Det spaltede DNA blev separeret på 3% agarosegeler i 1 × Tris-acetat-EDTA-buffer og farvet med ethidiumbromid. Humant normalt colon-DNA behandlet med SSSI methylase (New England Biolabs) blev anvendt som en positiv kontrol for methylerede alleler, og DNA fra normale lymfocytter blev anvendt som en kontrol for ikke-methylerede alleler. Vand blev anvendt som en negativ PCR-kontrol til overvågning PCR kontaminering. CIMP-high blev defineret som mindst 10 af methylering af disse loci.
KRAS
mutation analyser
exon 2 (codon 12/13) mutationer. PCR for KRAS
genet blev udført i en 25-pi PCR-blanding indeholdende 12,5 pi HotStarTaq Master Mix kit med primere. QIAquick PCR Purification kit blev anvendt til at oprense PCR-produkter, og de blev direkte sekventeret på en ABI 310 DNA sequencer [32].
Statistiske analyser
værdier er tosidet, og P
< 0,05 blev anset for at indikere statistisk signifikans.
Resultater
gen, spredning af CpG methylering inden sin 3'-regionen blev bestemt til at være en kritisk for MLH1 udtryk [33]. En beskrivelse af patientens kohorte og forskellige klinisk-patologiske funktioner baseret på køn, alder, scene, tumor differentiering, MSI-status, KRAS
mutation, og MLH1 3 '
methylering er vist i tabel 1. Disse statusser blev sammenlignet mellem CIMP-høje og CIMP-lave grupper. Af disse parametre, MSI status og MLH1 3 '
methylering status viste bemærkelsesværdige forskelle mellem de 2 grupper (tabel 1).
Methylering status
, CACNA1G
, CHFR
, COX2
, DAPK
, DCC
, HPP1
, MGMT-Mp omegn, MGMT-Eh omegn, MINT1
, MINT2
, MINT31
, MLH1 5 '
, MLH1 3'
, P14
, p16
, RASSF1A
, RASSF2A-regionen1
, RASSF2A-region2
, RASSF3
, RASSF5
, RASSF6
, RUNX3
, SFRP2 -region1
, SFRP2-region2
, UNC5C
, 3OST2
FOXL2
blev analyseret for at bestemme CIMP status for hver mavekræft . Methylering spektrum af disse loci er vist i flise kort (figur 1a). I disse loci, CACNA1G
, CHFR
, DCC
, HPP1
, MINT1
, MINT2
, MINT31
, MLH1 5 '
, MLH1 3'
, p16
, RASSF2A-regionen1
, RASSF2A-region2
, RUNX3
, SFRP2-region2
, UNC5C
, 3OST2
, og FOXL2
var signifikant methylerede i CIMP høje gruppe (tabel 2).
methylering og CIMP status i gastrisk kræft
methylering status blev analyseret. 10 patienter var i CIMP-høj / MLH1 3 '
methylerede, 1 patient var i CIMP-lav / MLH1 3'
methylerede, 20 patienter var i CIMP høj / MLH1 3 '
ikke-methylerede og 37 patienter var i CIMP-lav / MLH1 3'
ikke-methylerede grupper (figur 1b). Kaplan-Meier-overlevelseskurver blev genereret i overensstemmelse med den MLH1 3 '
methylering status. De 5-årige OS satser blev bestemt for MLH1 3 '
methylerede og ikke-methylerede grupper. De 5-årige OS satser var signifikant højere i MLH1 3 '
denatureret gruppe sammenlignet med den ikke-methylerede gruppe. (Log-rank P
= 0,0257, Fig 1c)
= 0,0688;. figur 1d)
methylerede, CIMP-lav / MLH1 3'
methylerede, CIMP høj / MLH1 3 '
ikke-methylerede og CIMP-lav / MLH1 3 '
ikke-methylerede grupper. Vi bemærkede, at den samlede overlevelsesrate var højere i den kombinerede CIMP-høj / MLH1 3 '
denatureret gruppe, sammenlignet med de andre grupper, hvor forskellene ikke var statistisk signifikant (log-rank P
= 0,0706;. figur 1e)
methylering og MSI
methylering og 3 '
methylering status blev analyseret. 10 patienter blev klassificeret som MLH1 5'
methylerede / 3 '
methylerede, 8 patienter som MLH1 5'
methylerede / 3'
ikke- methylerede, en patient som MLH1 5'
ikke-methylerede / 3 '
denatureret, og 49 patienter, som 5'
non-methylerede / 3 '
ikke-methyleret (figur 2a). I MLH1 3 '
methylerede gruppe, viste mere end 80% af patienterne MSI. I modsætning hertil i MLH1 3 '
non-methylerede gruppe, viste næsten alle tilfælde MSS (figur 2b). Kaplan-Meier-overlevelseskurver blev genereret i henhold til MLH1 5'
methylering status. De 5-årige overlevelsesrater blev analyseret for MLH1 5 '
methylerede og ikke-methylerede grupper, og satsen var lidt højere i MLH1 5'
methyleret gruppe end i den ikke- methylerede gruppe, men forskellene var ikke signifikante (log-rank P
= 0,1009, fig 2c). Kaplan-Meier-overlevelseskurver blev frembragt ifølge MSI status. De 5-årige overlevelsesrater blev analyseret for MSI og MSS-grupper, og satsen var lidt højere i MSI-gruppen end i MSS gruppen, men forskellene var ikke signifikante (log-rank P
= 0,1316; figur 2d).
mutation status, og CIMP / MLH1 3 '
methylering status i forhold til OS blev anvendt til at udføre multivariat analyse (tabel 3). Kun fase ( P
= 0,0088), differentiering ( P
= 0,0267), og CIMP / MLH1
methylering status ( P
= 0,0312) var statistisk signifikante prædiktorer for OS. Hazard ratio var signifikant lavere i CIMP-høj / MLH1 3 '
methylerede gruppe.
Diskussion
, p14ARF
, og MGMT
[34-38]; CHRNA3
, DOK1
, og GNMT
[39]; p16
, hMLH1
, MINT1
, MINT2
, MINT12
, MINT25
, og MINT31
[40]; APC
, CDH1
, MHL1
, CDKN2A
, CDKN2B
, og RUNX3
[17 ]; CDH1
[41]; DKK3
[42]; PTEN
[43]; MGMT
[44]; TFPI2
[22]; CACNA2D3
[45]; PCDH10
[46]; SOX2
[47]; MAL
[48]; og COX2
[49] blev tidligere rapporteret at være hypermethyleret i mavekræft. Methylering af p16
promotor- CpG-øer er en markør for malignt potentiale dysplasi i maven [50]. Methylering af MGMT
er forbundet med fremskreden og dårlig prognose [44]. Afvigende DNA methylering i disse gener kan fremme udviklingen af mavekræft. Men præcise gen mål for hypermethylering for carcinogenese forbliver ukendte [51,52].
eller MSH2
ved mutations inaktivering og promotor methylering er ansvarlig for MSI-H fænotype i mavekræft. Især ligner CRC, methylering af MLH1
er forbundet med MSI-H fænotype [15,40,63,64] fordi MLH1
methylering forud for tab af protein-ekspression. Leite M et al. rapporterede, at MLH1
promotor hypermethylering blev observeret i 78,7% (70/89) af de analyserede MSI sager [65]. Methylering af 3'-regionen af MLH1
promotor, hvilket er tæt på sin transkriptionelle startsted (TSS), er nødvendig for gendæmpning. 5'-enden af promotoren er også tilbøjelige til methylering, men dette er ikke funktionelt vigtigt medmindre methylering strækker sig til den kritiske 3'-region [66,67]. MSI status er ansvarlig for mutation af gener, der regulerer celle-cyklus og apoptotisk signalering, herunder TGFβRII
, IGFIIR
, TCF4
, RIZ
, BAX
, CASPASE5
, FAS
, BCL10
, og APAF1
[17,25] og gener opretholde genomisk integritet , herunder MSH6
, MSH3-
, MED1
, RAD50
, BLM
, ATR
, og MRE11
[17,68]. Gastriske cancere med MSI-H viser en højere frekvens af antral beliggenhed, intestinal subtype, lavere forekomst af lymfeknudemetastase og forbedret overlevelse i forhold til dem af mavekræft med MSS eller MSI-L [17,25-30].
, CHFR
, DCC
, HPP1
, MINT1
, MINT2
, MINT31
, MLH1 5 '
, MLH1 3'
, p16
, RASSF2A-regionen1
, RASSF2A-region2
, RUNX3
, SFRP2-region2
, UNC5C
, 3OST2
, og FOXL2
var signifikant methylerede i CIMP høje gruppe. Især rapporterede vi promotor methylering af FOXL2
gastrisk kræft. FOXL2
er et gen, der koder en forkhead transskriptionsfaktor og er afgørende for ovariefunktion [69]. FOXL2
regulerer cellecyklus ved at inducere G1 anholdelse og beskytter celler fra oxidative skader ved at fremme oxideret DNA-reparation og ved at øge mængden af anti-oxidant agent glutathion [69]. FOXL2
undertrykker proliferation, invasion og fremmer apoptose af livmoderhalskræft celler [70]. Promotor methylering af FOXL2
kan have en væsentlig rolle i tumorigenese i mavekræft. I modsætning hertil MLH1 3 '
methylering var påkrævet for MMR-mangel og viste MSI. MLH1 3 '
methylering gruppe havde en tendens til en god prognose i Kaplan-Meier overlevelse skøn.
methylering status viste en signifikant prognostisk værdi i både OS og time-to-recidiv (TTR) i multivariat analyse [72]. Patienter med CIMP-høj / MLH1
-unmethylated tumorer havde den værste OS og TTR [72]. I vores multivariat analyse af patienter med gastrisk cancer, er det kun CIMP-høj / MLH1 3 '
methyleret gruppe havde en god prognose. Årsagen til god prognose i CIMP-høj / MLH1 3 '
methylerede gruppe fortsat ukendt. Dette fænomen kan være på grund af synergistisk inaktivering af vitale gener på grund af mutation og promotor-methylering. For yderligere at bekræfte vores resultater, vi udførte en uafhængig validering af vores resultater fra i patientdata indsendt til The Cancer Genome Atlas database (TCGA). [73-75] CIMP-høj / MLH1
hyper-methylerede gruppe viste hyppigere lymfeknude metastaser (p = 0,0009), fremskreden sygdom etape (p = 0,0078, S1 File), og lidt bedre sygdomsfri overlevelse (S2 File). På den anden side, kan CIMP /MSI-status ikke vise signifikant værdi som prognostisk markør (S2 tabel). Dette resultat viser, MLH1
har den vigtigste rolle blandt MMR gener i carcinogenese af GC. Yderligere undersøgelser er påkrævet for at belyse forholdet mellem CIMP status og MMR-mangel. Denne tilgang vil føre til en ny strategi for behandling af mavekræft.
methylering status kan muliggøre forudsigelse af mavekræft prognose. Den CIMP-høj / MLH1 3 '
methylerede gruppe havde god prognose, men andre grupper kan kræve intensiv behandling til forbedringer af overlevelse, som skal valideres i fremtidige studier.
Støtte Information
S1 fil. Forholdet mellem CIMP og MLH1
methylering i Gastric kræftpatienter i TCGA database.
Vi undersøgte status 17 promoter CpG ø-relaterede loci methylering ( APC
, CACNA1G
, CHFR
, DAPK
, DCC
, MGMT
, MINT