Абстрактный
Фон
<р> Чтобы улучшить исход пациентов, страдающих от рака желудка, A более глубокое понимание основных генетических и эпигенетических событий в этой злокачественной опухоли требуется. Хотя CpG острова methylator фенотип (CIMP) и микросателлитная нестабильность (MSI) было показано, играть центральную роль в патогенезе рака желудка, клиническое значение этих событий на исходы выживаемости у больных раком желудка остается неизвестным.
Результаты Введение Материалы и методы образцы тканей Исследуемая популяция результаты выживаемости у пациентов на основе MLH1 3 ' перекрытием отношения между CIMP и статус метилирования MLH1 3 ' Вклад рассогласования ремонта дефицита и состояния CIMP к выживаемости Связь между MLH1 Многофакторный анализ выживаемости исходов прогностическими Обсуждение
<р> По многофакторного анализа, больше ОС была достоверно коррелировали с более низкой патологической стадии ( P
= 0,0088), более дифференцировки опухоли ( P =
0,0267) и CIMP высокой и метилированный статус MLH1 3 '
( P
= 0,0312). Расслоение статуса CIMP в отношении MLH1
статус метилирования дальнейшего прогнозирования позволило желудочного прогноза рака.
Выводы
<р> CIMP и /или MLH1
статус метилирования может иметь потенциал, чтобы быть прогностические биомаркеры для больных раком желудка
<р> Образец цитирования:. Shigeyasu K, Нагасака T, Мори Y, Йокомичи N, Каваи T, Fuji T, и др. (2015) Клиническое значение MLH1 метилирования и CpG острова Methylator фенотип прогностические маркеры у пациентов с раком желудка. PLoS ONE 10 (6): e0130409. DOI: 10.1371 /journal.pone.0130409
<р> Редактор: Hassan Ashktorab, Университет Говарда, США
<р> Поступило: 18 февраля 2015; Принято: 20 мая 2015 года; Опубликовано: 29 июня 2015
<р> Copyright: © 2015 Shigeyasu и др. Это статья открытого доступа распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются
<р> Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в пределах своих подтверждающей информации, файлов бумаги и
<р> Финансирование:. работа выполнена при поддержке грантов KAKENHI 19390351 и 20590572 для TN и грантов R01 CA72851 и 181572 из Национального института рака, Национальные институты здравоохранения, и средства из научно-исследовательского института Бейлора в AG
<р> конкурирующие интересы:. авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов
<р> Желудочный рак является второй ведущей причиной развития рака. смертей, о связанных с примерно 700 000 подтвержденных случаев гибели ежегодно во всем мире, хотя заболеваемость постепенно снижалась [1-3]. Рак желудка, как правило, диагностируется на продвинутой стадии, которая является основной причиной его плохого прогноза [4]. Для того, чтобы улучшить результат рака желудка, выявление генетических или эпигенетических событий в прогрессировании рака желудка требуется. Наиболее важным эпигенетическое событием в прогрессировании рака является метилирование промотора CpG областей ключевых генов-супрессоров опухолей. CpG острова почти на 1-кб длинные последовательности ДНК с высоким содержанием гуанин-цитозин в промоторных участков [5] генов. В отличие от нормальных клеток, CpG-островки в пределах генов-супрессоров в раковых клетках часто гиперметилированы, что приводит к CpG острова methylator фенотипу (CIMP) [6,7]. Эпигенетическое глушение опухолеассоциированному генов в связи с CpG острова метилирования недавно сообщалось в рак желудка. Ненормальная CpG острова метилирование > 100 роста регуляторных генов при раке желудка до сих пор сообщалось [8-24], однако, клиническое значение CIMP при раке желудка остается неизученным и плохо изучены
<р> В отличие от этого. , несоответствие ремонт (MMR) дефицит при раке желудка также является важным генетическое событие. Геномная нестабильность в пределах количества микросателлитных повторов (или микроспутников) называется микросателлитный нестабильность (MSI). MSI особенность вызвана дефектным системы ДНК MMR. Функциональная инактивация генов MMR, таких как MLH1
или MSH2
, промоутер метилирование отвечает за MSI высокой (MSI-H) фенотипа при раке желудка. В предыдущем исследовании, рак желудка с MSI-H показали более высокую частоту антрального местоположения, кишечной подтипа, более низкой частотой метастазов в лимфатических узлах, а также улучшение выживаемости, по сравнению с микросателлитных стабильной (MSS) или MSI-L рака желудка [17,25 -30]. Тем не менее, клиническое значение дефицита MMR в развитии рака желудка остается неизвестным.
<Р> С учетом этого пробела в знаниях, в данном исследовании, мы исследовали значение дефицита CIMP и MMR при раке желудка и определяли их вклад в прогностическим маркеры у больных раком желудка.
<р> Это исследование включало когорту пациентов с патологически подтвержденным раком желудка, перенесшие резекцию в Окаяма университета Больница (Окаяма, Япония) от 1998-2004. В общей сложности 68 желудочных раковых тканей и их совпавших нормальной слизистой оболочки желудка были проанализированы. Все нормальные ткани желудка слизистой оболочки были получены из участков, примыкающих к, но не менее 5 см от, исходной опухоли. Все пациенты дали письменное информированное согласие и исследование было одобрено этическим комитетом больницы Окаяма университета. Все пациенты дали письменное информированное согласие на использование своих данных для будущих анализов. Все рака желудка и нормальной слизистой оболочки желудка были образцы свежезамороженной ткани, из которого ДНК была извлечена с использованием QIAamp ДНК Mini Kit (QIAGEN).
MSI анализ
анализ <р> MSI проводили экспертизы 2 мононуклеотидных повторы (BAT25 и BAT26), 12 динуклеотидные повторы (D17S250, D18S35, D18S58, D18S69, D2S123, D4S1559, D4S2381, D4S470, D5S107, D5S346 и D8S87, TP53), и один тетрануклеотидные повторы, MYCL, как описано ранее [ ,,,0],31]. Опухоли, показывающие аллельные сдвиги в ≥5 из 15 маркеров были классифицированы как MSI-H (на этом упоминается как "MSI"), а остальные были классифицированы как микроспутник стабильной (MSS).
Бисульфит натрия модификации и CIMP анализы
<р> из-за частых гиперметилирование нескольких генов является одной из характерных особенностей опухолей с CIMP, мы исследовали статус метилирования промотора 28 CpG островов, связанных с локусов ( APC
,
, COX2
, DAPK
, DCC
, HPP1
, MGMT-Мр область
, MGMT-Э область
, MINT1
, MINT2
, MINT31
, MLH1 5 '
, MLH1 3 '
, p14
, p16
, RASSF1A
, RASSF2A-REGION1
, RASSF2A-REGION2
, RASSF3
, RASSF5
, RASSF6
, RUNX3
, SFRP2-REGION1
, SFRP2- REGION2
, UNC5C
, 3OST2
, FOXL2
), и соответствующие последовательности праймеров приведены в таблице S1. Геномную ДНК бисульфит модифицированной для преобразования всех неметилированные остатков цитозина в урацила. Короче говоря, 0,5-2,0 мкг ДНК денатурировали в NaOH, обрабатывали бисульфит натрия, и очищают с помощью очистку системы Мастер ДНК (Promega). Статус метилирования каждого локуса CIMP связанного оценивали с помощью комбинированной бисульфита рестрикционным анализом (Кобра). Полимеразная цепная реакция (ПЦР) для КОБРОЙ проводили на матричной ДНК бисульфит-модифицированный в ПЦР-смеси 25 мкл, содержащей 12,5 мкл набора HotStarTaq Master Mix (Qiagen), 0,5 мкмоль /л каждого праймера PCR, и приблизительно 25 нг бисульфит модифицированной ДНК. Продукты ПЦР расщепляли добавлением фермента рестрикции при 37 ° С в течение 12 часов. Гидролизованный ДНК разделяли на 3% агарозном геле в 1 × Трис-ацетат-ЭДТА буфере, и окрашивали бромистым этидием. Человеческой нормальной толстокишечной ДНК обрабатывали SssI метилазой (New England Biolabs) использовали в качестве положительного контроля для метилированных аллелей, и ДНК из нормальных лимфоцитов использовали в качестве контроля для неметилированных аллели. Воду использовали в качестве отрицательного контроля ПЦР для контроля загрязненности ПЦР. CIMP высокой была определена как не менее 10 метилирования этих локусов.
Крас
мутация анализирует
<р> Прямое секвенирование было проведено с целью определить KRAS <бр> экзон 2 (кодон 12/13) мутации. ПЦР для Крас
гена проводили в ПЦР-смеси 25 мкл, содержащей 12,5 мкл HotStarTaq Master Mix комплект с использованием праймеров. Набора для очистки ПЦР QIAquick использовали для очистки продуктов ПЦР, и они были непосредственно секвенированы на ABI 310 секвенатора ДНК [32].
Статистический анализ
<р> Программное обеспечение JMP (Ver 10.0, SAS Institute Inc .) был использован для выполнения статистического анализа. Т-тест Стьюдента используется для сравнения непрерывных переменных, а точный критерий Фишера использовали для анализа категориальные переменные. Общая выживаемость (OS) была измерена с даты операции до даты смерти. Статистика метод Каплана-Мейера и лог-ранговый различия между различными прогностическими факторами были использованы для оценки распределения ОС. модели пропорционального риска Кокса использовали для расчета отношения рисков (ОР) с соответствующими 95% доверительный интервал (ДИ). Одномерный или многомерный логистический регрессионный анализ проводился для определения различий в HR между каждой группой. Все приведенные значения P
являются двусторонними, и P
&л; 0,05 рассматривалось как для обозначения статистической значимости.
Результаты
<р> В данном исследовании мы исследовали 68 пациентов с раком желудка. В промоторных CpGs элемента был определен MLH1
ген, распространению CpG метилирования в пределах своей области '3 является критическим для экспрессии MLH1 [33]. Описание когорты пациентов и различных клинико-патологических особенностей в зависимости от пола, возраста, стадии дифференцировки опухоли, MSI статуса, Крас
мутации, и метилирование MLH1 3 '
показано в таблице 1. Эти статусы сравнивали между CIMP высотой и CIMP-групп с низким уровнем. Из этих параметров, состояния MSI и MLH1 3 '
статуса метилирования показали замечательные различия между 2 группами (таблица 1).
статус метилирования
<р> 28 CpG локусы включая APC
, CACNA1G
, CHFR
, COX2
, DAPK
, DCC
, HPP1
, MGMT-Мр область
, MGMT-Э область
, MINT1
, MINT2
, MINT31
, MLH1 5 '
, MLH1 3'
, p14
, p16
, RASSF1A
, RASSF2A-REGION1
, RASSF2A-REGION2
, RASSF3
, RASSF5
, RASSF6
, RUNX3
, SFRP2 -region1
, SFRP2-REGION2
, UNC5C
, 3OST2
и FOXL2
были проанализированы для определения статуса CIMP каждого рака желудка , Метилирование спектр этих локусов показан на карте плитки (рис 1а). В этих локусов, CACNA1G
, CHFR
, DCC
, HPP1
, MINT1
, MINT2 <бр>, MINT31
, MLH1 5 '
, MLH1 3'
, p16
, RASSF2A-REGION1
, RASSF2A-REGION2
, RUNX3
, SFRP2-REGION2
, UNC5C
, 3OST2
и FOXL2
были значительно метилируется в CIMP-группе высокой (таблица 2).
метилирования и статус CIMP в рака желудка
анализировали. 10 пациентов были в CIMP высокой / MLH1 3 '
метилированный, 1 пациент был в CIMP низким / MLH1 3'
метилированный, 20 пациентов были в высоких CIMP / MLH1 3 '
без метилированной и 37 пациентов были в CIMP низкой / MLH1 3'
без метилированных групп (рис 1b). Кривые выживаемости Каплана-Мейера были получены в соответствии с
статуса метилирования MLH1 3 '. В 5-летние показатели ОС были определены для метилированных и не метилированных групп MLH1 3 '
. В 5-летние показатели ОС были значительно выше в группе
денатурированного MLH1 3 'по сравнению с не-метилируется группы. (Лог-ранга P
= 0,0257; рис 1c)
<р> Аналогично, 5-летние показатели ОС были проанализированы для CIMP-высоких и CIMP-групп с низким, и скорость была в CIMP-высокой группе несколько выше, чем в CIMP-низкой группе, но разница не была значимой ( лог-ранга P
= 0,0688;. рис 1d)
<р> Частота 5-летней выживаемости были проанализированы и сравнены среди этих групп; CIMP-высокий / MLH1 3 '
метилированный, CIMP низким / MLH1 3'
метилированный, CIMP высокий / MLH1 3 '
без метилированной и CIMP низким / не-метилированные группы MLH1 3 '
. Мы отметили, что общие показатели выживаемости были выше в комбинированном CIMP высокой / MLH1 3 '
метилированный группы, по сравнению с другими группами, где различия не были статистически значимыми (лог-ранга P <бр> = 0,0706;. рис 1е)
метилирование и MSI
<р> перекрытие отношения между MLH1 5 '
метилирование и было проанализировано 3 '
статус метилирования. 10 пациентов были классифицированы как MLH1 5 '
метилируется / 3'
метилированный, 8 пациентов, как MLH1 5 '
метилируется / 3'
не- метилированный, 1 пациент, как MLH1 5 '
без метилируется / 3'
метилированных, и 49 пациентов, как 5 '
без метилируется / 3'
не-метилированных (рис 2а). В денатурированного группы MLH1 3 '
, более 80% пациентов показали MSI. В отличие от этого, в , не-метилированных группы MLH1 3 '
, почти во всех случаях показал MSS (фиг.2В). Кривые выживаемости Каплана-Мейера были получены в соответствии с
статуса метилирования MLH1 5 '. Показатели 5-летней выживаемости были проанализированы для MLH1 5 '
метилированных и не метилированных групп, а скорость была в MLH1 5 немного выше'
денатурированного группе, чем в не- метилированный группа, но различия не были значимыми (лог-ранговый P
= 0,1009; рис 2в). Кривые выживаемости Каплана-Мейера были получены в соответствии со статусом MSI. Показатели 5-летней выживаемости были проанализированы для групп MSI и ПСС, а скорость была в группе MSI немного выше, чем в группе ПСС, но эти различия не были значимыми (лог-ранговый P
= 0,1316; Рисунок 2d).
<р> модель пропорционального риска Кокса, в том числе возраст, стадии, дифференциации, Крас
мутационный статус, и CIMP /
статус метилирования MLH1 3 'по отношению к ОС была использована для выполнения многомерного анализа (таблица 3). Только этап ( P
= 0,0088), дифференциация ( P
= 0,0267), и CIMP / MLH1
статус метилирования ( P
= 0,0312) были статистически значимыми прогностическими ОС. Коэффициент опасности был значительно ниже в CIMP высокой / метилированный группа MLH1 3 '
.
<р> метилирования ДНК в раковых клетках, стала темой интенсивных исследований. Инактивация генов-супрессоров опухолей путем CpG метилирования промоторных областей ускоряет канцерогенез из-за регулирования аномальным клеточного цикла и пролиферации [15]. Некоторые из кандидатов аберрантно метилированных генов при раке желудка было зарегистрировано. RASSF1A
, p14ARF
и MGMT
[34-38]; CHRNA3
, Dok1
и GNMT
[39]; p16
, hMLH1
, MINT1
, MINT2
, MINT12
, MINT25
, и MINT31
[40]; APC
, CDH1
, MHL1
, CDKN2A
, CDKN2B
и RUNX3
[17 ]; CDH1
[41]; DKK3
[42]; PTEN
[43]; MGMT
[44]; TFPI2
[22]; CACNA2D3
[45]; PCDH10
[46]; SOX2
[47]; MAL
[48]; и COX2
[49] были ранее сообщалось, гиперметилированы при раке желудка. Метилирование p16
промоторных CpG островков является маркером злокачественного потенциала дисплазии в желудке [50]. Метилирование MGMT
ассоциируется с продвинутой стадией и плохим прогнозом [44]. Ненормальная метилирование ДНК в этих генах может способствовать развитию рака желудка. Тем не менее, точные цели генов вируса гиперметилированием для канцерогенеза остаются неизвестными [51,52].
<Р> Параллельное CpG метилирование в нескольких генов было определено как CIMP в колоректального рака (КПР) и рака желудка [15,40,53- 57], и было показано, коррелирует с гиперметилированием генов-супрессоров опухолей. Тем не менее, доказательства CIMP при раке желудка не так убедительно, как и в случае CRC [58,59]. При раке желудка, CIMP высокой была описана в 41% [40] и 31% [54] опухолей. Пациенты с CIMP-высоким раком желудка имеют значительно меньшую выживаемость, чем те, с CIMP-низким раком желудка [54,60]. Другой отчет показал, что CIMP было связано с лучшей выживаемостью при раке желудка [54]. Недавний мета-анализ было сосредоточено на сильном отношении CIMP с H. Pylori, EBV и MSI, но CIMP не смог показать прогностический потенциал для рака желудка [61].
<Р> В отличие от этого, нестабильность на микросателлиты повторы в рамках различных генов регулирующих рост определяется как MSI. Стандартная панель, такие как панели NCI, рекомендуется, в том числе мононуклеотида (BAT26 и BAT25) и динуклеотиде (D2S123, D5S346 и D17S250) повторяет [62]. Три уровня MSI можно выделить: высокого уровня MSI (MSI-H), низкого уровня MSI (MSI-L), и MSS. MSI-H фенотип при раке желудка было сообщено составляют 5% -50% от MSI положительных новообразований [17]. MSI особенность вызвана дефектным системы ДНК MMR. Функциональная инактивация генов MMR, таких как MLH1
или MSH2
, по мутационной инактивации и метилирования промотора отвечает за фенотип MSI-H при раке желудка. В частности, подобный КПР, метилирования MLH1
ассоциируется с MSI-H фенотипа [15,40,63,64], потому что MLH1
метилирование предшествует потере экспрессии белка. Лейте M и др. Сообщается, что MLH1
промотор гиперметилирование наблюдалась в 78,7% (70/89) анализируемых случаев MSI [65]. Метилирование 3'-области из MLH1
промотор, который близок к его начальной транскрипции сайта (TSS), необходим для молчанием генов. 5'-конец промотора также склонны к метилирование, но это не является функционально важным, если метилирование не распространяется на критической 3 'области [66,67]. Статус MSI отвечает за мутации генов, регулирующих клеточный цикл и апоптический сигнализации, в том числе TGFβRII
, IGFIIR
, Tcf4
, РИЗ
, БАКСА
, CASPASE5
, ФАС
, BCL10
и apaf1
[17,25] и гены поддержания целостности генома , в том числе MSH6
, MSH3
, MED1
, Rad50
, BLM
, ATR
, и MRE11
[17,68]. Рака желудка с MSI-H показывают более высокую частоту антрального местоположения, кишечной подтипа, более низкую частоту метастазов в лимфатических узлах, а также улучшение выживаемости по отношению к тем, желудочного рака с MSS или MSI-L [17,25-30].
<р> Как было описано выше, CIMP и статус MMR-дефицитной являются ключевые особенности рака желудка и могут отражать различия в выживаемости пациентов, страдающих от этой злокачественной опухоли. Значимая корреляция между CIMP и MSI сообщили в GC [61]. Тем не менее, данные о синергетические эффекты этих параметров не хватает, и многомерный анализ этих генетических и эпигенетических параметров требуется. В нашем исследовании, CACNA1G
, CHFR
, DCC
, HPP1
, MINT1
, MINT2 <бр>, MINT31
, MLH1 5 '
, MLH1 3'
, p16
, RASSF2A-REGION1
, RASSF2A-REGION2
, RUNX3
, SFRP2-REGION2
, UNC5C
, 3OST2
и FOXL2
были значительно метилируется в CIMP-группе высокой. В частности, мы сообщали промотор метилирование FOXL2
при раке желудка. FOXL2
представляет собой ген, кодирующий фактор транскрипции Forkhead и имеет важное значение для функции яичников [69]. FOXL2
регулирует клеточный цикл путем индукции G1 ареста и защищает клетки от окислительного повреждения путем содействия окисленный репарации ДНК и за счет увеличения количества антиоксиданта агента глутатиона [69]. FOXL2
подавляет пролиферацию, инвазию и стимулирует апоптоз цервикальных раковых клеток [70]. Промотор метилирование FOXL2
может иметь значительную роль в онкогенеза при раке желудка. В отличие от этого,
метилирование MLH1 3 'был необходим для дефицита MMR и показал MSI. MLH1 3 '
метилирование группа имела тенденцию к хорошим прогнозом в оценке по выживаемости Каплана-Мейера.
<Р> Однако CIMP и дефицит MMR зависят друг от друга. MSI-ассоциированной спорадические ЗПК возникают через процесс, который включает CIMP [66,71]; Таким образом, комплексный статистический анализ дефицита CIMP и MMR должны быть выполнены. Например, в двенадцатиперстной аденокарциномы, CIMP / MLH1
статус метилирования показал существенное прогностическое значение в обеих ОС и времени до рецидива (TTR) в многомерном анализе [72]. Пациенты с CIMP высокой / MLH1
-unmethylated опухоли имели худший ОС и TTR [72]. В нашем многомерном анализе пациентов с раком желудка, только CIMP-высокий / метилированный группа MLH1 3 '
был хороший прогноз. Причиной хорошего прогноза в CIMP высокой / метилированный группа MLH1 3 '
остается неизвестным. Это явление может быть из-за синергического инактивации жизненно важных генов вследствие мутации и метилирования промотора. Для дальнейшего подтверждения наших выводов, мы провели независимую проверку наших результатов от пациента в данных, представленных в базе данных Атлас генома рака (TCGA). [73-75] CIMP-высокий / MLH1
гипер-метилированных группа показала более частое метастазирование узлов лимфы (р = 0,0009), стадия поздних стадиях заболевания (р = 0,0078; S1 файла), и немного лучше выживаемость без болезней (S2 File). С другой стороны, статус CIMP /MSI не может показать существенное значение в качестве прогностического маркера (таблица S2). Этот результат показывает, что MLH1
имеет наиболее важную роль среди MMR генов в канцерогенезе ГК. Необходимы дальнейшие исследования для выяснения отношений между CIMP статусом и дефицитом MMR. Такой подход приведет к новой стратегии для лечения рака желудка.
<Р> В заключение, наши данные свидетельствуют о том, что стратификация пациентов с CIMP на основе MLH1
статус метилирования может дать прогноз рака желудка прогноз. CIMP-высокий / метилированный группа MLH1 3 '
имели хороший прогноз, но и другие группы могут потребовать интенсивного лечения для улучшения выживаемости, которое должно быть подтверждено в будущих исследованиях.
Поддержка Информация
S1 файла. Отношения между CIMP и MLH1
метилирование больных раком желудка в базе данных TCGA.
Мы исследовали статус метилирования промотора 17 CpG островов, связанных с локусов ( APC
,
, DAPK
, DCC
, MGMT
, MINT
, MLH1
, p16
, RASSF1
, RASSF2