Abstrakt
Evaluering HER2 Henvisning:. Matsusaka K, Ishikawa S, Nakayama A, Ushiku T, Nishimoto A, Urabe M, et al. (2016) Tumor Content Chart-Assisted HER2 / Redaktør: Yves St-Pierre, INRS, CANADA Modtaget: November 7, 2015; Accepteret: 13. april, 2016 Udgivet: 27 April, 2016 Copyright: © 2016 Matsusaka et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer Finansiering:. Dette arbejde blev udført som en del af BioBank Japan Project (http://www.src.riken.jp/english/project/person/), der blev støttet af Ministeriet for Undervisning, Kultur, Sport, Videnskab og Teknologi (http://www.mext.go.jp/english/), Japan agentur for medicinsk forskning og udvikling (http: //www.amed.go .jp /da /), og tilskud-in-Støtte til videnskabelig forskning (KAKENHI) fra Japan Society for fremme af Science (https://www.jsps.go.jp/english/e-grants/). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser Introduktion mavekræft er en af de mest almindelige ondartede tumorer og den tredje hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald i hele verden [1]. Avancerede tilfælde uden operative indgreb har dårlig prognose og nødvendiggør tværfaglige behandlingsmetoder. HER2 er en 185-kDa transmembrane glycoprotein, er et medlem af den epidermale vækstfaktor-receptorfamilien og fungerer som en tyrosinkinasereceptor [2, 3]. I normale celler, HER2 protein fungerer som et signal transducer under celleproliferation eller -differentiering [4]; men det har onkogene egenskaber ved overekspression. Dette er normalt forårsaget af HER2 For patienter med inoperabel gastrisk kræft, bør HER2 status undersøges ved hjælp af en lille biopsi prøve. Som repræsenteret i seneste anbefalinger for HER2 test i brystkræft ved American Society of Clinical Oncology (ASCO) /College of American Pathologists (CAP), immunhistokemi (IHC) og /eller in situ hybridisering (ISH) er standard metoder til evaluering HER2 status [19], men hver har sine begrænsninger. For eksempel er effektiviteten af HER2-IHC påvirkes af flere faktorer, såsom formalin fiksering proces, og pointsystemet er ikke altid reproducerbar især i tvetydige tilfælde, hvor der anbefales ISH [19-25]. I lyse felt HER2 I denne undersøgelse har vi anvendt mikrofluidik-baserede digitale PCR-teknologi. (BioMark; Fluidigm, Cambridge, UK) [26] til at bestemme HER2 Etik Statement Denne undersøgelse blev godkendt af University of Tokyo institutionelle Etisk Udvalg. Kliniske prøver med skriftligt informeret samtykke blev indsamlet under University of Tokyo Institutionelle retningslinjer for undersøgelse af humane væv. I alt, 44 mavekræft biopsi prøver fra 32 patienter, der behandles af rutinemæssig formalinfikseret paraffinindlejret (FFPE) var tilgængelige til analyse. Alle biopsi prøver blev opnået endoskopisk ved Institut for Endoskopi og Endoskopisk kirurgi. Fire kirurgiske prøver, som blev operativt fjernede kirurgisk ved Institut for Gastrointestinal Kirurgi, blev også analyseret. Disse prøver blev fikseret i 10% neutral pufret formalin. Alle tilfælde blev diagnosticeret ved Patologisk Institut ved universitetet i Tokyo Hospital. Snit blev skåret i en tykkelse på 4 um ved anvendelse af traditionelle histologiske teknikker; disse blev indsamlet på objektglas og anvendes til hæmatoxylin-eosin (HE) farvning, HER2-IHC, og HER2 Immunhistokemi immunhistokemisk farvning blev udført på FFPE væv under anvendelse Ventana BenchMark XT (Roche Diagnostics) med 4D5-anti-HER2-antistof. Farvningsintensitet og membran immunoreaktivitet mønstre blev vurderet ved anvendelse af Dako pointsystemet efter retningslinier ASCO /CAP [19]. Nogen membran farvning blev bedømt som 0; svag eller lige akkurat synlig /ufuldstændig membran farvning blev scoret som 1+; ufuldstændig og /eller svag /moderat omkredsen membran farvning blev scoret som 2+; og helt og intenst omkredsen membran farvning blev scoret som 3+. HER2- HER2 For at udtrække DNA fra biopsiprøver, 10 serielle snit skåret i en tykkelse på 10 um blev placeret på en glasoverflade for HER2 -IHC og HER2 primer sæt til amplifikation HER2 Hele slide billede af HE sektioner, som var dem, lige før de serielle sektioner for dna-ekstraktion, blev scannet ved hjælp NanoZoomer (Hamamatsu Photonics, Hamamatsu, Japan). Data blev importeret til Definiens Tissue Studio 2.0 (http://www.tissuestudio.com) til bestemmelse af TCR. Den valgte region kirurgiske prøver blev scannet ved hjælp af en BZ-710 mikroskop (Keyence, Osaka, Japan). Data blev importeret til Hybrid celletal software (BZ-H3C, Keyence). Data, som detaljeret antallet af celler i importerede billeder og fornemme kræft fra ikke-kræft celler baseret på kerne størrelse blev automatisk genereret Eksperimenter for at udvikle de TC diagrammer cellelinjer. i kontroleksperimenter, H522 lungecancer og SK-BR-3-brystcancercellelinier blev opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). GM18997 Epstein-Barr-virus-transformerede lymfoblastoide cellelinje (LCL) blev opnået fra Coriell Biorepository (https://catalog.coriell.org/). H522-celler og LCL blev dyrket i Roswell Park Memorial Institute-1640-medium (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan) indeholdende 10% føtalt bovint serum (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) og 1% penicillin-streptomycin-opløsning ( Nacalai Tesque). SK-BR-3-celler blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium /Hams F12 (Nacalai Tesque, Japan) med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin /streptomycin. Celler blev dyrket ved 37 ° C i en atmosfære indeholdende 5% CO 2. DNA blev ekstraheret under anvendelse af et QIAquick DNA mini kit (Qiagen). FFPE H522, SK-BR-3, og LCL celle blokke var forberedt på HER2 Genomisk DNA fra H522 og SK -BR-3-celler og LCL blev indstillet til en koncentration på 50 ng /pl. H522 og LCL genomisk DNA blev blandet i otte trin ved følgende volumenforhold: 8: 2, 7: 3, 6: 4, 5: 5, 4: 6, 3: 7, 2: 8 og 1: 9 (H522 : LCL). SK-BR-3 og LCL genomisk DNA blev blandet i fire trin ved følgende volumenforhold: 8: 2, 6: 4, 4: 6, og 2: 8 (SK-BR-3: LCL). statistiske analyser Chi-squared test blev anvendt til at sammenligne tællinger mellem HER2 Resultater Udvikling af TC chart for digitale PCR data HER2-service /CEP17 forholdet blev bestemt ud fra tre variabler:. TCR og absolut kopi antal HER2 I den foreliggende undersøgelse, [ x ligning (1) var repræsenteret grafisk som TC diagram, med [ r Vi definerede HER2 Begge sider af ligning (2) blev divideret med [ Ax Ved at kombinere med ligning (1) og (3) gav følgende: (4) (5) Eq (5) var en betingelse svarende til [ B-service / en Derfor når ligning (6) var tilfreds, HER2 På den anden side, at definitionen af HER2 Eq (7) blev behandlet på samme måde som ligning (2) - (5) og blev udtrykt på følgende måde: (8) ligning (8) var en betingelse svarende til [ B-service / a Således når ligning (9) var tilfreds, HER2 Når ligning (6) og (9) blev afbildet på TC diagrammet, området over linje buer opad [ r Når [ x Sammenligning af digital PCR og HER2 Vi valideret den teoretiske ligning (1) og TC diagrammet ved en trinvis blanding-system af cellelinier. Den ligning (1) blev opnået ved hjælp af faktisk målte værdier for [ En Relativ kopi antal HER2 H522 og SK-BR-3-genomisk DNA blev blandet med den for LCL på en trinvis måde, og blandingerne blev analyseret ved digital PCR. I H522 celler, HER2 Overensstemmelse mellem TC diagram for digital PCR og HER2-IHC /. - DISH i kliniske biopsiprøver mavekræft biopsiprøver (n = 44) fra 32 patienter blev analyseret ved digital PCR. HER2 Digital PCR-data og TCR i hvert tilfælde blev afbildet på TC diagrammet (fig 4), herunder data for HER2 Teoretisk anslået [ B-service / A Flere sager blev evalueret for otte patienter (fig 4 og S1 tabel). Alle tilfælde i hver patient viste de samme resultater for parabol og digital PCR bortset Patient-24 (Pt-24); en af fem tilfælde ( ) var positiv og to ( og ) var negative for begge målinger. To tilfælde negative for parabol blev tildelt positive (!) og tvetydige ( ) områder i TC diagrammet (tabel 3 og S1 tabel). I alt 22 HER2-IHC tilfælde havde en score på 2+ (tabel 4), omfattende tre positive, 15 negative, og fire tvetydige tilfælde baseret på TC diagram af digitale PCR. Positive og negative resultater var fuldstændig overensstemmende med de HER2 intratumoral HER2 heterogenitet blev bedømt ved en kombination af HER2-IHC /-DISH og digital PCR (figur 5, S1 fig og S2 tabel). Case_1, 2, og 4 viste tydelig intratumoral heterogenitet bestående af HER2-IHC-positive og -negative læsioner i en klynge, mens Case_3 generelt viste en tvetydig HER2-IHC udtryk mønster. Vigtigere, HER2-positive læsioner var tilgængeligt fra hulrummet i maven i Case_1 (-2,-3), Case_2 (-1,-2), og Case_4 (-4). Alle HER2-IHC /-DISH-positive tilfælde blev plottet i den positive område. Tre prøver af Case_3 (-1, -2 og -3) viser HER2-IHC (tvetydigt) og HER2 diskussion undersøgelsen er den første til at forsøge en kategorisering af gastrisk kræft i HER2 det digitale PCR-metode er blevet anvendt til evalueringen af kopi antal virus [28], føtal kromosomal aneuploidi [29], og onkogener i forskellige cancer væv [30, 31]. Et stort problem, der skal overvindes, er en korrektion af rådata efter deres indhold af enheder tumor; gastrisk cancer væv generelt indeholde større mængder af ikke-cancercelle infiltration, f.eks interstitielle eller inflammatoriske celler. I den foreliggende undersøgelse anvendte vi billedanalyse til opnåelse af en semi-automatiseret estimering af tumorcelle indhold og udviklet TC chart at klassificere data i tre kategorier-dvs.., Amplificeres, ikke-amplificerede, og tvetydige. Det kunne være muligt at rense kræftceller fra FFPE vævssnit ved mikrodissektion, men det er for besværligt for rutinemæssig klinisk praksis, selv om det er mere præcis i teorien. Ved hjælp af denne metode til biopsiprøver, at antallet af HER2-IHC-tvetydige tilfælde (2+) blev reduceret fra 22 til seks, og dermed behovet for bekræftelse af HER2 Der er yderligere fordele ved den digitale PCR-protokol. For det første er enkel i forhold til ISH, som kræver dygtighed og er arbejdskrævende, omfattende flere trin. For det andet er færre tilfælde kræves til validering end der er behov for HER2
genamplifikation er et væsentligt element i terapeutisk beslutningstagning til avanceret eller metastatisk gastrisk cancer. En simpel metode, der kan anvendes på små, formalinfikserede, paraffinindlejrede biopsi prøver er ønskeligt som et supplement til eller som erstatning for øjeblikket anvendes HER2 immunhistokemi og in situ hybridisering protokoller. I denne undersøgelse har vi udviklet en mikrofluidik-baserede digitale PCR-metode til bestemmelse af HER2
og kromosom 17 centromer (CEP17) kopiere numre og estimering tumor indhold ratio (TCR). HER2-service /CEP17 forholdet er bestemt af tre variabler-TCR og absolutte kopi antal HER2
CEP17-ved at undersøge tumorceller; kun forholdet mellem de to sidstnævnte kan opnås ved digital PCR under anvendelse af helt præparat uden oprensning tumorceller. TCR blev bestemt ved halvautomatisk billedanalyse. Vi udviklede en tumor Content diagram, som er et plan af rektangulære koordinater bestående af HER2-service /CEP17 digital PCR data og TCR der afgrænser amplificerede, ikke-amplificeret, og tvetydige områder. Ved at anvende denne fremgangsmåde blev 44 kliniske mavekræft biopsiprøver klassificeret som amplificeret (n = 13), ikke-amplificeret (n = 25), eller tvetydig (n = 6). Til sammenligning 11 prøver var positive, 11 var negative, og 22 var tvetydigt immunhistokemi. Således er vores ny metode reduceret antallet af tvivlsomme prøver fra 22 til 6, hvorved behovet for bekræftelse ved fluorescens eller dual-sonde in situ hybridisering til < 30% af tilfældene. Tumor indhold chart-assisteret digital PCR-analyse er også for flere steder i kirurgisk resektion væv. Disse resultater indikerer, at denne analyse er et nyttigt alternativ til HER2 immunhistokemi i gastrisk kræft, der kan tjene som grundlag for den automatiske evaluering af HER2
status
CEP17 Digital PCR analyse af mavekræft biopsi prøver. PLoS ONE 11 (4): e0154430. doi: 10,1371 /journal.pone.0154430
genamplifikation, som er blevet rapporteret i flere typer af ondartet svulst [5], herunder brystkræft [6, 7], spytkirtel adenocarcinom [8], urinblære kræft [9] og gastrisk cancer [10]. HER2-overekspression gastrisk kræft tegner sig for 8% -31% af alle tilfælde [11-15]. I Trastuzumab for mavecancer forsøg, trastuzumab (Roche Diagnostics, Basel, Schweiz) -a humaniseret anti-HER2 monoklonalt antistof-øget overlevelsesraten for patienter med HER2-positive gastriske cancere, når de indgives i kombination med kemoterapi [16], og var også godkendt til behandling af brystcancer [17, 18]. Evaluering HER2 status er derfor et væsentligt aspekt af mavekræft terapi.
dual-sonde ISH ( HER2
-DISH), HER2
og kromosom 17 centromer (CEP17) kopi kan påvises numre som signaler under et lys mikroskop over hele regionen af prøven. Selv om denne metode har overlegen følsomhed, det er dyrt og forholdsvis tidskrævende
/CEP17 kopi nummer ratio. I digital PCR, er template-DNA opdelt i 770 stykker i nanoliter reaktionskamre, med en forventet koncentration på 0-1 molekyle pr kammer. Dual-farvede mål- og referencepunkter gener er samtidig PCR-forstærket og deres kopiantal beregnes ved at tælle kamrene med positive signaler. Denne meget robust metode muliggjorde sammenligning af HER2
og CEP17 kopiantal ved hjælp af forskellige primer sæt. Formålet med denne undersøgelse var at bekræfte gennemførligheden af digitale PCR-teknologi til analyse af gastriske cancer biopsiprøver. , Et problem ved denne fremgangsmåde er imidlertid, at vævet sædvanligvis indeholder ikke-kræft stromaceller som interfererer med molekylære analyser. For at overvinde dette problem har vi udviklet todimensionale punktdiagram benævnt Tumor Content (TC) diagram, der allokerer data i amplificeret, ikke-amplificeret, og tvetydige kategorier. Målet var at udvikle en automatiseret måde at evaluere HER2
status, med TC chart-assisteret HER2
/CEP17 digital PCR-analyse tjener som det første skridt.
Materialer og Metoder
Kliniske gastrisk kræft biopsi prøver og kirurgiske prøver
-DISH.
parabol farvning og evaluering
-DISH blev udført på FFPE væv ved hjælp af HER2-DNA parabol kit (Roche Diagnostics) i overensstemmelse med producentens instruktioner, og prøver blev vurderet ved lysmikroskopi. HER2
signaler optrådte som sorte prikker eller klynger, og CEP17 signalerne fremstod som røde prikker. Tyve ikke-overlappende kræft kerner blev scoret for HER2
CEP17 signaler og HER2
genamplifikation blev klassificeret som anbefalet af retningslinjerne for ASCO /CAP [19]; positiv, [ HER
2 /CEP17 forholdet ≥ 2,0] og /eller [gennemsnit HER
2 kopiantals ≥ 6,0 signaler /celle]; tvetydig, [ HER
2 /CEP17 forholdet < 2.0] og [gennemsnit HER
2 kopiantals ≥ 4,0 og < 6.0 signaler /celle]; negativ, [ HER
2 /CEP17 forholdet < 2.0] og [gennemsnit HER
2 kopiantals < 4,0 signaler /celle].
Forberedelse af DNA fra FFPE klinisk materiale
-DISH. Tumor indhold blev bekræftet før og efter sektionering ved farvning de tilstødende lysbilleder med HE. Da en enkelt paraffin blok indeholder sædvanligvis flere stykker biopsiprøve blev individuelle prøver isoleret ved anvendelse af en glas cutter. For at ekstrahere DNA fra kirurgiske resektion prøver blev 5 serielle snit fra hvert repræsentativt væv-blok skåret i en tykkelse på 10 um, som blev anbragt på en plade fremstillet af polytetrafluorethylen (PTFE, Sanplatec, Osaka, Japan). Membranen er kemisk resistens for xylen-baserede afparaffinering, og er let skæres i stykker. I undersøgelsen, forskellige dele var klippet ud fra arkene ifølge HER2 profil. Glas- eller PTFE stykker blev samlet i en 2,0-ml rør, og DNA blev ekstraheret under anvendelse af QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA).
HER2
kopital vurdering ved digitale PCR Salg
og CEP17 er vist i tabel 1. Hver primer blev udformet således, at PCR-produkterne var de opnåede tilstrækkelig kort (59 og 65 bp) for at eliminere indflydelse af DNA-fragmentering i FFPE processen. Digital PCR blev udført under anvendelse af et EP1-system med en 48,770 digital matrix integreret strømningsteknisk kredsløb (Fluidigm). Hver chip indeholdt 48 paneler, der blev yderligere opdelt i 770 reaktionskamre. Antallet af positive fluorescerende signaler i hvert panel blev anvendt til at kvantificere forskellige DNA-sekvenser. Protokollen er beskrevet andetsteds [26]. Kort fortalt blev 4-pi reaktionsblandinger fremstillet for hver analyse, der indeholdt 1 x TaqMan genekspression mastermix, 1 × HER2-FAM og chr17cent-VIC TaqMan prober, og 1 × prøvepåfyldning reagens (Fluidigm). Reaktionsblandingen blev jævnt fordelt i 770 reaktionskamre og den digitale Grupperingen blev termo-cykluser på et EP1 System FC1 cykliseringsapparat. De to målregioner blev uafhængigt forstærket og 6-carboxyfluorescein og VIC farvestof signaler i kamrene blev registreret i slutningen af hver PCR-cyklus. Antallet af 6-carboxyfluorescein-positive (HER2) og VIC-positive (CEP17) kamre i hvert panel blev talt og HER2
/CEP17 kopi nummer forholdet blev beregnet [27].
Evaluering tumor indhold ratio (TCR)
-DISH evaluering.
Trinvis blanding med LCL.
-DISH og digital PCR i H522 og SK-BR-3 celler og LCL. Forskelle blev anset for at være væsentlig, hvis s
< 0.05
CEP17. Kun de relative forhold mellem de to sidstnævnte kan opnås ved digital PCR under anvendelse af tumorprøve uden at isolere enkelte celler. HER2-service /CEP17 forholdet opnået ved digital PCR [ r
] blev udtrykt som følger, baseret på den antagelse, at gen-kopi antal kræftceller er homogene, og at ikke-kræft celler er genetisk stabil med diploide kromosomer (fig 1A og 1B) :( 1) hvor [ r
] er forholdet mellem HER2
at CEP17 opnås ved digital PCR (0 < r
); [ x
] er TCR (0 ≤ x
≤ 1); [ En
] er CEP17 kopi nummer i en enkelt kræftcelle (0 ≤ A
); og [ B
] er HER2
kopi nummer i en enkelt kræftcelle (0 ≤ B
). Herefter er den todimensionale scatterplot repræsenteret ved ligning (1) benævnt TC diagrammet.
] blev bestemt ud fra HE-farvede prøver vha billede analyse software, såsom Tissue Studio billedanalyse software til biopsi prøver og Hybrid celletal software til de kirurgiske prøver henholdsvis; og [ r
] og [ x
] blev bestemt ud fra målinger.
] og [ x
] som de lodrette og vandrette akser, henholdsvis (figur 1B). Forholdet mellem [ B-service / En
] var referenceværdien til bestemmelse HER2
genamplifikation. Faktisk det faktiske antal kopier af CEP17 [ A
] og HER2
[ B
] kunne ikke bestemmes uden at udføre HER2
-DISH. Men en praktisk vurdering af HER2
og CEP17 kopiere numre af parabol fandt, at [ En
] varierede fra 2,0 til 6,0 (mellem 40 og 117 CEP17 signaler blandt 20 kræftceller i S1 og S2 Tables) og aldrig oversteget 8,0 i kliniske gastrisk kræft prøver. Ifølge vores erfaring af 164 på hinanden følgende tilfælde af mavekræft (Ushiku T et al
. Upublicerede data), CEP17 kopi nummer er 1,0-5,7, median 2,5, og monosomi, defineret som [ A
< 1.5], er ret sjælden i kun to tilfælde (1,2%). Således intervallet [ A
] blev indstillet som [2 ≤ A
≤ 8] med en sikkerhedsmargen.
forstærkning-negativ som [ B-service / En
< 2] eller [ B
< 2 A
]. [ Bx
+ 2 (1 - x
)] blev derefter udtrykt som følger: (2)
+ 2 (1 - x
)] :( 3)
< 2]. Den højre side medlem af ligning (5) viste en monoton stigning efter variablen [ A
] (2 ≤ A
≤ 8); inkorporering af [ A
= 2], som var den mindste værdi af [ En
], i ligning (5) gav følgende: (6)
forstærkning-negative tilstand [ B-service / En
< 2] var sandt for enhver værdi af [ A
] (2 ≤ A
≤ 8).
forstærkning-positive var [ B-service / A
≥ 2] eller [ B
≥2 A
]. I dette tilfælde [ Bx
+ 2 (1 - x
)] blev udtrykt på følgende måde: (7)
≥ 2]; højre medlem af ligningen indikerede en monoton stigning. Inkorporering af [ A
= 8], som var den maksimale værdi af [ En
], i ligning (8) gav følgende: (9)
forstærkning-positive tilstand [ B-service / A
≥ 2] var sandt for enhver værdi af [ A
] (2 ≤ A
≤ 8).
= (7 x
+ 1) /(3 x
+ 1)] ( A
= 8) blev udpeget som det positive område, og området under den rette linje [ r
= x
+ 1] ( A
= 2) var den negative område. Området afgrænses af linjen [ r
= x
+ 1] og [ r
= (7 x
+ 1) /(3 x
+ 1)] var ubestemt zone afhængig af værdien af [ en
], der blev udpeget som den tvetydige område og defineret som følger (figur 1B) :( 10)
] var 0 (der ikke indeholder kræftceller), alle linjer konvergerede på koordinaterne (0,1) baseret på den antagelse, at ikke-kræft celler er genomisk stabile. Når [ x
] blev 1,0 (bestående af kun kræftceller), linjer passeret gennem koordinaterne (1,2) uafhængigt af værdier for [ En
] og [ B
].
-DISH i dyrkede celler
] og [ B
] opnås ved HER2
-DISH i cellelinjer, eller ved hjælp af beregnede [ B '
] fra [ En
] og målt [ r
].
CEP17 ( HER2
/CEP17) i LCL og H522 og SK-BR-3cells blev evalueret af HER2
-DISH hjælp FFPE celle blokke og ved digital PCR (tabel 2). HER2
signaler optrådte som diskrete prikker i kerner fra HER2
-DISH (Fig 2A og 2B); HER2
kopi nummer i individuelle celler var næsten to i LCL og fire i H522 celler. I modsætning hertil SK-BR-3 celler viste grupperet HER2
signaler, der var svært at skelne individuelt (figur 2C); deres antal blev arbitrært sat til de maksimale værdier for 7, 14 og 21 ifølge klyngestørrelser. Således er en lavere HER2-service /CEP17 forholdet blev opnået ved HER2
-DISH end med digital PCR.
[ B
] og CEP17 [ A
] kopi tal blev beregnet ud fra HER2
-DISH som følger: [ A
= 41/20 = 2,05] og [ B
= 85/20 = 4,25]. Når værdierne af [ En
] og [ B
] blev anvendt til ligning (1), kan dataene beskrives ved referencelinjen [ r
= ( 4,25 x
+ 2 (1 - x
)) /(2,05 x
+ 2 (1 - x
))] (fig 2D ). I tilfælde af SK-BR-3 celler, CEP17 kopi nummer [ En
] var [ A
= 83/20 = 4,15]; Men som beskrevet ovenfor, HER2
signaler blev grupperet, der faldt det anslåede antal kopier. Derfor anvender [ A
= 4.15], [ r
= 5.69], og [ x
= 1,0] til ligning (1), den anslåede HER2
kopi nummer [ B '
] blev formodes at være [ B'
= 5.69 × 4.15 = 23,61]. Derfor [ A
= 4.15] og [ B '
= 23,61] whilethe referencelinje var [ r
= (23,61 x
+ 2 (1 - x
)) /(4,15 x
+ 2 (1 - x
))] (fig 2E). Plottede digitale PCR data fra SK-BR-3-celler blandet med LCL lige med denne linje i stedet for [ r
= (19,50 x
+ 2 (1 - x
)) /(4,15 x
+ 2 (1 - x
))], som var baseret på HER2
-DISH data, for hvilke [ B
= 19.50]. Disse resultater viser gyldigheden af TC chart-dvs. at der er tilstrækkelig quantitativity af digital PCR at skelne HER2-amplificeret fra ikke-forstærkede celler
status af hver prøve blev bestemt ved HER2-IHC og -DISH (Fig 3A-3C). De estimerede værdier var i overensstemmelse med manuelle tællinger foretaget af en patolog (KM). TC blev bestemt fra billeder ved at skelne kerner af kræft fra de ikke-kræft celler (Fig 3D).
-DISH-positive (rød), -equivocal (lilla) og ekskluderet (blå), samt HER2-IHC-positive (rhombi), -equivocal (trekanter), og ekskluderet ( cross-mark) prøver. Klinisk-patologisk information om repræsentative og totale tilfælde er vist i tabel 3 og S1 Table hhv. Der var ingen HER2
-DISH-positive tilfælde under stregen [ r
= x
+ 1]; dog én HER2
-DISH-negative ( ), to tvetydige (og), og tre positive (,)og,) tilfælde blev observeret i tvetydige område . Desuden var der en HER2
-DISH-negative tilfælde i den positive område (!). Tre tilfælde (,og*) viste markant høje digitale PCR værdier (28.25, 19.99, og 24.00, henholdsvis). I HER2
-DISH, disse sager viste grupperet HER2
signaler (Fig 3C), der var vanskelig at kvantificere, som i SK-BR-3 celler. Eq (1) blev også udtrykkes således: (11)
] blev beregnet ved anvendelse af målte [ r
] og [ x
] og målt [ A
], som blev bestemt ud fra tællinger af CEP17 signaler opnået ved HER2
-DISH i 20 cancerceller (tabel 3 og S1 tabel). [ B '
] blev også opnået ved at måle [ r
] og [ En
] og [ x
= 1], som beskrevet for SK-BR-3 celler.
-DISH. Af de fire tvetydige tilfælde med IHC score 2+, en () var positiv, og de andre (, og)) var negative, som bestemt af HER2
-DISH. Den anslåede [ B-service / A
] værdi var således ≥ 2,0 i tilfældeog < 2.0 i de tre sidstnævnte, bortset fra tilfælde), den anslåede [ B-service / En
] hvoraf var 2.12.
Evaluering af intratumoral HER2 heterogenitet i kirurgiske prøver
-DISH (positiv) blev plottet i tvetydige område. Prøve-2 blev plottet i tvetydige område, fordi regionen-2 dækket et relativt stort område indeholdende både HER2-positive og -negative komponenter. Prøve-2 viste uoverensstemmelser mellem HER2-IHC (positiv) og HER2
-DISH (negativ) (S2 tabel), med de digitale PCR-resultater, der svarer til HER2
-DISH.
forstærkning-negative, -equivocal og-positive tilfælde ved hjælp af en to-dimensionel scatter plot eller TC diagram, baseret på målte værdier for HER2-service /CEP17 forholdet opnået ved digital PCR [ r
] og TCR [ x
] uden konventionel HER2
-DISH eller HER2-IHC oplysninger. Således en analyse af TC diagram er uafhængig af CEP17 og HER2
kopi tal ([ En
] og [ B
]) i en enkelt kræftcelle, som kan normalt opnås ved HER2
-DISH.
-DISH kunne undgås til mindre end 30% af tilfældene. Hyppigheden af HER2
forstærkning varierer mavekræft histologiske typer, fra 20% -30% i tarmen til < 10% i den diffuse form [32]. Derfor er en effektiv screeningsmetode kræves i almindelig klinisk praksis, især i lande med en høj forekomst af mavekræft. TC diagram kan også bruges sammen med andre PCR-metode, såsom kvantitativ PCR for HER2
forstærkning [33].