értékelése HER2 katalógusa génamplifikációnak lényeges eleme a terápiás döntéshozatalt előrehaladott vagy áttétes gyomorrákban. Egy egyszerű módszer, amely alkalmazható a kis, formalin-fixált, paraffinba ágyazott biopsziás minták kívánatos, mint kiegészítéseként vagy helyettesítésére jelenleg használt HER2 immunhisztokémiai és in situ hibridizációs protokollokat. Ebben a vizsgálatban, kifejlesztettünk egy mikrofluidika-alapú digitális PCR módszer meghatározására HER2 katalógusa és 17-es kromoszóma centromer (CEP17) kópiaszám és becslésére tumor tartalom aránya (TCR). A HER2 katalógusa /CEP17 aránya határozza meg három változó-TCR és abszolút kópiaszám HER2 katalógusa és CEP17-vizsgálatával tumorsejtek; csak az arány a két utóbbi lehet előállítani digitális PCR egész minta nélkül tisztítására tumorsejteket. TCR határoztuk félautomata képelemzés. Kifejlesztettünk egy Tumor tartalom diagram, amely egy sík, téglalap koordinátáit álló HER2 Citation: Matsusaka K, Ishikawa S, Nakayama A, Ushiku T, Nishimoto A, Urabe M, et al. (2016) Tumor Content kör segített HER2 /katalógusa CEP17 Digitális PCR analízise Gyomorrák biopsziás minták. PLoS ONE 11 (4): e0154430. doi: 10,1371 /journal.pone.0154430 katalógusa Szerkesztő: Yves St-Pierre, INrS, Kanada katalógusa Beérkezett: november 7, 2015; Elfogadva: 13. április 2016; Megjelent: április 27, 2016 katalógusa Copyright: © 2016 Matsusaka et al. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra. Katalógusa Az adatok elérhetősége: minden releváns adatok a papír és az azt támogató információs fájlokat. katalógusa Forrás: Ezt a munkát végezte, mint egy része a biobank Japán Project (http://www.src.riken.jp/english/project/person/), amely támogatta az Oktatási Minisztérium, Kulturális, Sport, Tudományos és Technológiai (http://www.mext.go.jp/english/), Japán Ügynökség orvosi kutatás és fejlesztés (http: //www.amed.go .de /hu /), és Grants-in-Aid for Scientific Research (KAKENHI) a Japán Társaság a Promotion of Science (https://www.jsps.go.jp/english/e-grants/). A finanszírozók nem volt szerepe a tanulmány tervezés, adatgyűjtés és elemzés, döntés, hogy közzéteszi, vagy a készítmény a kézirat. Katalógusa Érdekütközés: A szerzők kijelentették, hogy nem ellentétes érdekek léteznek. Katalógusa Bevezető gyomorrák egyik leggyakoribb rosszindulatú tumorok és a harmadik vezető oka a rák okozta halál az egész világon [1]. Részletes nélküli esetekben műtéti beavatkozás rossz prognózis és a szükségessé multidiszciplináris kezelési módszereket. HER2 egy 185 kDa méretű transzmembrán glikoprotein, amely tagja az epidermális növekedési faktor receptor család és funkciókat, mint egy tirozin-kináz-receptor [2, 3]. A normál sejtek, a HER2-protein működik, mint egy jelátvivő közben sejtproliferáció vagy differenciálódását [4]; Azonban onkogén tulajdonságai, ha túlzott mértékben. Ezt általában az okozza, HER2 A betegek rezekálható gyomorrák, a HER2-státust kell vizsgálni egy kis biopsziás mintában. Amint az a legfrissebb ajánlások HER2-vizsgálat az emlőrák American Society of Clinical Oncology (ASCO) /College of American Pathologists (KAP), immunhisztokémia (IHC) és /vagy in situ hibridizáció (ISH) a szabványos módszerek értékelésére HER2 állapot [19], de mindegyiknek megvan a maga korlátai. Például a hatékonyságát HER2-IHC számos tényező befolyásolja, mint például a formalin fixálás folyamata, és a pontozási rendszer nem mindig reprodukálható különösen kétértelmű esetekben, amely ISH ajánlott [19-25]. Világos mező HER2 katalógusa kettős szonda ISH ( HER2 katalógusa -DISH), HER2 katalógusa és 17-es kromoszóma centromer (CEP17) kópiaszám is kimutatható jelek szerint a fény mikroszkóp alatt az egész régió a minta. Ugyanakkor, bár ez a módszer a kiváló érzékenység, ez költséges és viszonylag időigényes. Ebben a tanulmányban alkalmazott mikrofluidikai-alapú digitális PCR Technology (Biomark; Fluidigm, Cambridge, UK) [26], hogy meghatározzák HER2 katalógusa /CEP17 kópiaszám arány. Digitális PCR templát DNS oszlik 770 darab nanoliter reakció kamra, a várható koncentrációja 0-1 molekula egy kamra. Kétszínű cél és a referencia gén egyszerre PCR-amplifikált és másolási számok számítható ki a kamarák pozitív jeleket. Ez a rendkívül robusztus módszer lehetővé tette az összehasonlítást a HER2 katalógusa és CEP17 kópiaszám különböző primer készletek. A cél az volt, hogy erősítse meg a megvalósíthatóságát digitális PCR technológia elemzésére gyomorrák biopsziás minták. Azonban az egyik probléma ezzel a megközelítéssel az, hogy a szövet rendszerint tartalmaz nem rákos kötőszöveti sejtek, amelyek zavarják a molekuláris elemzések. Ahhoz, hogy ez a kérdés megoldható, kifejlesztettük kétdimenziós szórásdiagramon nevezik tumor tartalom (TC) diagramot, amely osztja adatokat erősített, nem erősített, és kétértelmű kategóriában. A cél az volt, hogy dolgozzon ki egy automatizált eszközök értékelésének HER2 katalógusa státuszban, TC chart segített HER2 katalógusa /CEP17 digitális PCR analízis szolgáló első lépés. Katalógusa Anyagok és módszerek Etikai nyilatkozat katalógusa Ez a tanulmány által jóváhagyott University of Tokyo intézeti etikai bizottság. Klinikai minták írásos beleegyezést gyűjtötték az University of Tokyo intézményi előírásoknak a tanulmány az emberi szövetekben. Katalógusa Klinikai gyomorrák biopsziás mintákat és sebészeti mintákban katalógusa A teljes, 44 gyomorrák biopsziás minták 32 beteg által feldolgozott rutin formalin-fixált, paraffinba ágyazott (FFPE) álltak rendelkezésre az elemzéshez. Minden biopsziás mintákat kapott endoszkópos Tanszék endoszkópos és endoszkópos sebészet. Négy sebészeti mintákban, amelyeket eltávolított műtéti Tanszékén gasztrointesztinális sebészet, szintén elemezték. Ezeket a mintákat fixáltuk 10% -os semleges, pufferolt formalin. Minden esetet diagnosztizáltak a Pathologiai a University of Tokyo Kórház. Metszeteket vastagságban 4 um alkalmazásával hagyományos szövettani módszerekkel; ezeket gyűjtöttük tárgylemezre és használt hematoxilin-eozin (HE) festés, a HER2-IHC, és HER2 katalógusa -DISH. Az immunhisztokémiai katalógusa Az immunhisztokémiai festéssel végeztük a FFPE szövet felhasználásával Ventana BenchMark XT (Roche Diagnostics) az 4D5 anti-HER2 antitest. Festődés intenzitása és a membrán immunreaktivitás minták értékeltünk a Dako pontozási rendszer szerint ASCO /CAP iránymutatások [19]. Nem membránfestôdést pontozták a 0; halvány vagy alig észrevehető /hiányos membránfestôdést pontozták, mint 1+; hiányos és /vagy gyenge /közepes kerületi membránfestôdést pontozták a 2+; és teljesen és intenzíven kerületi membránfestôdést pontozták a 3+. katalógusa HER2- katalógusa Dish festéssel és értékelési katalógusa HER2 katalógusa -DISH végeztünk FFPE szövet segítségével a HER2 DNS Dish reagenskészlet (Roche Diagnostics) alkalmazásával a gyártó utasításai és mintákat értékeltük fénymikroszkóppal. HER2 katalógusa jelek jelentek meg fekete pöttyök vagy klaszterek és CEP17 jelek jelentek meg piros pontok. Húsz nem átfedő rák magok tekét HER2 katalógusa és CEP17 jeleket, és HER2 katalógusa génamplifikációval besorolt által ajánlott ASCO /CAP iránymutatások [19]; pozitív, [ HER katalógusa 2 /CEP17 arány ≥ 2,0] és /vagy [átlag HER katalógusa 2 kópiaszám ≥ 6,0 jelek /cella]; kétértelmű, [ HER katalógusa 2 /CEP17 arány < 2.0] és [átlag HER katalógusa 2 kópiaszám ≥ 4,0 és < 6.0 jelek /cella]; negatív, [ HER katalógusa 2 /CEP17 arány < 2.0] és [átlag HER katalógusa 2 kópiaszám < 4,0 jeleket /cella]. a DNA kivonása érdekében biopsziás mintákból, 10 soros szakaszok elvágva vastagsága 10 jim helyeztünk az üveg felületén HER2 -IHC és HER2 katalógusa -DISH. Tumor tartalom megerősítették előtt és után vágási festéssel a szomszédos diákat HE. Mivel egyetlen paraffinblokkba rendszerint tartalmaz néhány darab biopsziás minta, egyedi mintákat izoláltuk üveg vágó. A DNA kivonása érdekében a sebészeti eltávolított minták, 5 soros szakaszok minden egyes reprezentatív szövet-blokkot vágtunk vastagsága 10 um, ami helyeztünk egy lapon készült politetrafluor-etilén (PTFE, Sanplatec, Osaka, Japán). A membrán kémiai ellenállás xilol-alapú deparaffinization, és könnyen darabokra vágni. Abban a vizsgálatban, különböző részek voltak clip ki a lapok szerinti HER2 profilt. Az üveg vagy PTFE darabokat össze egy 2,0 ml-es csőbe, és a DNS-t extraháljuk a QIAamp DNS FFPE Tissue Kit-tel (Qiagen, Valencia, CA, USA). primer készletek amplifikálására HER2 Szervíz a tumor tartalom aránya (TCR) hotelben Egész diakép HE szakaszok, melyek voltak azok előtt a metszeteket a DNS kivonására került beolvasott NanoZoomer (Hamamatsu Photonics, Hamamatsu, Japán). Az adatok behozták definiense Tissue Studio 2.0 (http://www.tissuestudio.com) meghatározásához TCR. A kiválasztott régióban sebészeti mintákban volt beolvasott a BZ-710 mikroszkóp (Keyence, Osaka, Japán). Az adatok behozták hibrid sejtszám szoftver (BZ-H3C, Keyence). Adatok, amelyek részletesen a sejtek számának importált képek és kiváló rákos a nem rákos sejtek alapuló nucleus mérete automatikusan generált katalógusa Kísérletek fejlesztésére TC grafikonok katalógusa sejtvonalak. Katalógusa kontroll kísérletekben, H522 tüdőrák és SK-BR-3 emlőrák sejtvonalakat az American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). GM18997 Epstein-Barr-vírussal transzformált limfoblasztoid sejtvonalat (LCL) kapunk Coriell Biorepository (https://catalog.coriell.org/). H522-sejtek és az LCL-ben tenyésztettük Roswell Park Memorial Institute-1640 közegben (Nacalai Tesque, Kyoto, Japán), amely 10% magzati borjúszérumot (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) és 1% penicillin-sztreptomicin-oldatot ( Nacalai Tesque). SK-BR-3-sejteket tenyésztettünk Dulbecco-féle módosított Eagle-féle tápközegben /Hams F12-t (Nacalai Tesque, Japán) 10% magzati borjúszérumot és 1% penicillin /sztreptomicint. A sejteket 37 ° C hőmérsékleten olyan atmoszférában, amely 5% CO 2. DNS-t extraháltunk egy QIAquick DNS Mini Kit (Qiagen). FFPE H522, SK-BR-3, és az LCL cellatömböt készítettünk HER2 katalógusa -DISH értékelést. Katalógusa lépcsőzetes keverés LCL. Katalógusa A genomiális DNS-H522 és SK -BR-3 sejteket és a LCL-ját koncentrációja 50 ng /ul. H522 és LCL genomi DNS-t összekeverünk nyolc lépésben a következő térfogat arányok: 8: 2, 7: 3, 6: 4, 5: 5, 4: 6, 3: 7, 2: 8 és 1: 9 (H522 : LCL). SK-BR-3 és LCL genomi DNS-t összekeverünk négy lépésben a következő térfogat arányok: 8: 2, 6: 4, 4: 6 és 2: 8 (SK-BR-3: LCL). Statisztikai elemzések katalógusa Chi-négyzet tesztet alkalmaztunk összehasonlítani számít a HER2 katalógusa -DISH és digitális PCR a H522 és SK-BR-3 sejtek és LCL. A különbségeket akkor tekintettük szignifikánsnak, ha a p katalógusa < 0.05. Fejlesztés a TC chart digitális PCR adat katalógusa A HER2 katalógusa /CEP17 aránya alapján határoztuk meg három változó: TCR és abszolút kópiaszám HER2 katalógusa és CEP17. Csak a relatív arányai az utóbbi kettő lehet előállítani digitális PCR tumor minta izolálása nélkül, egyedül álló sejtek. A HER2 A jelen tanulmányban [ x katalógusa] határoztuk HE-festett minták segítségével képet analízis szoftver, például a szöveti Studio képelemző szoftver a biopsziás mintákat és hibrid sejtszám szoftver a sebészeti mintákban rendre; és [ r katalógusa] és [ x katalógusa] határoztuk mérésekből. katalógusa Eq (1) képviselte grafikusan TC chart, a [ r definiált HER2 katalógusa erősítés-negatív, mint a [ B katalógusa / Egy fiatal < 2] vagy [ B katalógusa < 2 Egy fiatal]. [ Bx katalógusa + 2 (1 - x katalógusa)] ezután a következőképpen fejezhető ki: (2) hotelben Mindkét fél Eq (2) elosztottuk [ Ax katalógusa + 2 (1 - x katalógusa)] :( 3) hotelben Ötvözi egyenletek (1) és (3) után a következő: (4) (5) Eq (5) feltétele volt egyenértékű [ B katalógusa / egy fiatal < 2]. A jobb oldali tagja Eq (5) szerint a monoton növekedés változó szerint [ Egy fiatal] (2 ≤ Egy fiatal ≤ 8); beépítése [ Egy fiatal = 2], ami a minimális érték [ Egy fiatal] bele Eq (5) a következő: (6) hotelben Ezért amikor Eq (6) elégedett volt, a HER2 katalógusa erősítés-negatív feltétel [ B katalógusa / Egy fiatal < 2] igaz bármelyik értéke [ Egy fiatal] (2 ≤ Egy fiatal ≤ 8). Katalógusa Másrészt, a meghatározása HER2 Eq (7) volt feldolgozott azonos módon mint egyenletek (2) - (5), és a következőképpen fejezhető ki: (8) hotelben Eq (8) feltétele volt egyenértékű [ B katalógusa / egy fiatal ≥ 2]; a jobb oldalon tagja az egyenlet jelzett egy monoton növekszik. Beépítése [ Egy fiatal = 8], amely a maximális érték [ Egy fiatal] bele Eq (8) során a következő: (9) hotelben Így amikor Eq (9) elégedett volt, a HER2 katalógusa erősítés-pozitív állapot [ B katalógusa / Egy fiatal ≥ 2] volt igaz bármelyik értéke [ a Amikor egyenletek (6) és (9) ábrázoltuk a TC chart, a területet a vonal fölé felfelé kanyarodó [ r katalógusa = (7 x katalógusa + 1) /(3 x katalógusa + 1)] ( Egy fiatal = 8) jelölték a pozitív terület, és a terület alatt az egyenes [ r katalógusa = x katalógusa + 1] ( Egy fiatal = 2) volt negatív területet. A terület zárt vonalak által [ r katalógusa = x katalógusa + 1] és [ r katalógusa = (7 x katalógusa + 1) /(3 x katalógusa + 1)] volt határozatlan terület értékétől függően a [ egy fiatal], amely jelölték a kétes terület és a következőképpen definiáljuk (1B ábra) :( 10) Ha a [ X összehasonlítása digitális PCR és HER2 katalógusa -DISH tenyésztett sejtekben katalógusa érvényesített elméleti Eq (1) és a TC chart lépésenként keverék rendszer sejtvonalak. Az Eq (1) előállításához ténylegesen mért értékeket a [ Egy fiatal] és [ B katalógusa] nyert HER2 katalógusa -DISH sejtvonalak segítségével, vagy a számított [ B 'katalógusa] a [ Egy fiatal] és a mért [ r katalógusa]. a relatív kópiaszám HER2 katalógusa és CEP17 ( HER2 katalógusa /CEP17) az LCL és H522 és SK-BR-3cells értékeltük HER2 katalógusa -DISH segítségével FFPE cellatömböt és digitális PCR (2. táblázat). HER2 katalógusa jelek megjelentek diszkrét pontok magok által HER2 katalógusa -DISH (2A és 2B); HER2 katalógusa kópiaszám egyedi sejtekben majdnem két LCL és négy H522 sejtekben. Ezzel szemben, a SK-BR-3-sejtek mutattak csoportosulnak HER2 H522 és az SK-BR-3 sejt genomiális DNS-t összekeverünk hogy a LCL lépcsőzetes módon, és a keverékeket analizáltuk digitális PCR-rel. Ezen H522-sejtek, HER2 katalógusa [ B katalógusa] és CEP17 [ Egy fiatal] kópiaszámok számoltuk HER2 katalógusa -DISH a következők szerint: [ Egy fiatal = 41/20 = 2,05] és [ B katalógusa = 85/20 = 4,25]. Ha az értékek [ Egy fiatal] és [ B katalógusa] vittük Eq (1), az adatok le lehetett a referencia vonal [ r katalógusa = ( 4.25 x katalógusa + 2 (1 - x katalógusa)) /(2,05 x katalógusa + 2 (1 - x katalógusa))] (ábra 2D ). Abban az esetben, SK-BR-3 sejtek CEP17 kópiaszám [ Egy fiatal] volt [ Egy fiatal = 83/20 = 4,15]; Azonban, amint a fentiekben leírtuk, HER2 egyezését TC chart digitális PCR és HER2-IHC /- DISH klinikai biopsziás mintákban a gyomorrák biopsziás minták (n = 44) 32 beteget vizsgáltak digitális PCR. A HER2 katalógusa állapotát minden mintából határoztuk meg HER2-IHC és -DISH (3A-3C). A becsült értékek összhangban voltak manuális számokhoz készített egy patológus (KM). TC arány határoztuk képek megkülönböztetése magok rákos azoktól nem rákos sejtekben (3D). Katalógusa Digitális PCR adatok és TCR minden esetben ábrázoltuk a TC táblázat (4. ábra), beleértve az adatokat a HER2 Elméletileg becslések szerint [ B katalógusa / Egy fiatal] számítottuk alkalmazásával mért [ r Több esetben értékeltük nyolc beteg (4. ábra és az S1 táblázat). Minden esetben, minden betegnél mutatta, ugyanazt az eredményt edény és digitális PCR kivéve Beteg-24 (Pt-24); egyike annak az öt esetben ( ) pozitív volt, és két ( és ) negatívak voltak mindkét mérés. Két esetben negatív DISH osztottak a pozitív (!) és kétértelmű ( ) területein a TC diagram (3. táblázat és az S1 táblázat). Katalógusa A teljes, 22 HER2-IHC esetben sem pontszáma 2+ (4. táblázat), amely három pozitív, 15 negatív, és négy kétértelmű esetek alapján TC chart digitális PCR. A pozitív és negatív eredmények teljesen egybehangzó azokkal HER2 katalógusa -DISH. A négy kétes esetekben az IHC pontszámot 2+, egy () pozitív volt, és a többiek (, és)) negatív volt, meghatározva HER2 katalógusa -DISH. A becslések szerint [ B katalógusa / Egy fiatal] értéket ennek megfelelően ≥ 2,0 eseténés < 2.0 Az utóbbi három kivételével az esetben a), a becslések szerint [ B katalógusa / Egy fiatal] az volt, 2,12. Katalógusa értékelése intratumorális HER2 heterogenitás sebészeti mintákban intratumorális HER2 heterogenitást értékeltük kombinációjával HER2-IHC /-DISH és digitális PCR (ábra 5, S1 ábra és S2 táblázat). Case_1, 2, és 4 megmutatta külön intratumorális heterogenitása álló HER2-IHC-pozitív és -negatív elváltozások egy klaszter, míg Case_3 általában mutatott kétértelmű HER2-IHC expressziós mintázat. Fontos, hogy a HER2-pozitív elváltozások voltak hozzáférhetők a lumenből a gyomor Case_1 (-2,-3), Case_2 (-1,-2), és Case_4 (-4). Minden HER2-IHC /-DISH-pozitív esetet ábrázoltuk pozitív területen. Három mintát Case_3 (-1, -2 és -3) mutatott HER2-IHC (bizonytalan) és a HER2 katalógusa -DISH (pozitív) ábrázoltuk a kétes területen. Minta-2 ábrázoltuk a kétértelmű területen, mert régió-2 lefedett viszonylag nagy területen egyaránt tartalmazó HER2-pozitív és -negatív alkatrészeket. Minta-2 eltéréseket tárt között HER2-IHC (pozitív) és a HER2 katalógusa -DISH (negatív) (S2 táblázat), a digitális PCR eredmények megfelelő HER2 katalógusa -DISH. Vita katalógusa a tanulmány az első kísérlet egy kategorizálását gyomorrák be HER2 katalógusa erősítés-negatív, -equivocal és -pozitív esetek segítségével kétdimenziós szóródási cselekmény vagy TC chart alapján mért értékek HER2 katalógusa /CEP17 arányt kapott digitális PCR [ r katalógusa] és TCR [ x katalógusa] nélkül a hagyományos HER2 a digitális PCR módszert alkalmazták, hogy az értékelés kópiaszám vírus [28], a magzati kromoszóma-aneuploiditást [29], és a különböző onkogének rák szövetekben [30, 31]. A fő probléma, hogy le kell küzdeni a korrekció a nyers adatok szerint a tumor tartalom példányok; gyomorrák szövetek általában tartalmaznak nagyobb mennyiségű nem rákos sejt infiltráció, például intersticiális vagy gyulladásos sejtekben. A jelen tanulmányban alkalmazott képelemző megszerezni egy félautomata becslése tumorsejt tartalma és fejleszteni a TC chart besorolását adatokat három kategória-azaz., Erősített, nem erősített, és kétértelmű. Lehetséges lenne, hogy megtisztítsa a rákos sejtek FFPE szöveti metszetekben mikrodisszekció, de ez túl munkaigényes a klinikai gyakorlatban, akkor is, ha pontosabb elméletben. Ezt a megközelítést alkalmazva a biopsziás minták száma, a HER2-IHC-kétértelmű esetben (2+) csökkent, 22-től hat, ezáltal annak szükségességét, hogy a megerősítés HER2 katalógusa -DISH lehetne elkerülhető, hogy kevesebb, mint 30% az esetek. A frekvencia a HER2 Vannak további előnye, hogy a digitális PCR protokoll. Először is, ez egyszerű képest ISH, amely előírja, készség és munkaigényes, amely több lépésben. Másodszor, kevesebb esetben van szükség érvényesítésre, mint amennyi szükséges HER2 katalógusa -DISH, így költséghatékony. Végül csak arra van szükség, hogy tervezzen specifikus primerekkel, hogy lehet alkalmazni, hogy a gének nem
/CEP17 digitális PCR adatokat, és a TCR hogy körvonalazza amplifikált, nem amplifikált, és kétértelmű területeken. E megoldás alkalmazásával, 44 klinikai gyomorrák biopsziás mintákat besorolni amplifikáltuk (n = 13), a nem amplifikált (n = 25), vagy többféleképpen (n = 6). Összehasonlításképpen, 11 minta volt pozitív, 11 negatív, és 22-nél nem egyértelműen immunhisztokémia. Így, a mi új eljárás csökkentette a kétértelmű mintát 22-6, és ezáltal szükségtelenné téve a megerősítés fluoreszcencia vagy Dual-szonda in situ hibridizáció a < Esetek 30% -ában. Tumor tartalom chart-támogatott digitális PCR analízis is alkalmazható több helyen műtétileg eltávolított szöveteket. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy ez az elemzés hasznos alternatíva HER2 immunhisztokémiai gyomorrák, amely alapjául szolgálhat az automatizált elemzése HER2 katalógusa állapotát.
génamplifikáció, amely számoltak be többféle rosszindulatú daganat [5], köztük az emlőrák [6, 7], nyálmirigy-adenocarcinoma [8], húgyhólyag rák [9] , és a gyomorrák [10]. HER2-t túlzott mértékben gyomorrák 8% -át -31% -a minden esetben [11-15]. A Trastuzumab gyomorrák próba, trastuzumab (Roche Diagnostics, Basel, Svájc) -a humanizált anti-HER2 monoklonális antitest-növelte a túlélési arány a betegek HER2-pozitív gyomor rák beadva kemoterápiával kombinálva [16] volt, és is kezelésére engedélyezett emlőrákok [17, 18]. Kiértékelése a HER2-státus tehát lényeges eleme gyomorrák terápia. Katalógusa
előállítása származó DNS FFPE klinikai anyagból
HER2
kópiaszám értékelés digitális PCR
és CEP17 táblázatban mutatjuk be 1. Valamennyi láncindító oligonukleotidot úgy terveztük, hogy a kapott PCR-termékek voltak kellően rövid (59 és 65 bp), hogy megszüntesse a hatása a DNS-fragmentáció a FFPE folyamat. Digitális PCR alkalmazásával végeztük egy EP1 rendszert egy 48,770 digitális tömb integrált áramlástechnikai áramkör (Fluidigm). Mindegyik chip tartalmaz 48 panelek tovább osztjuk 770 reakció kamra. A számos pozitív fluoreszcens jelek minden egyes panel számszerűsítésére használják különböző DNS-szekvenciák. A protokoll leírták máshol [26]. Röviden, a 4-il reakcióelegyeket készítünk mindegyik vizsgálati eljárás, amely tartalmazott 1 × TaqMan génexpressziós Master Mix, 1 × HER2-FAM és chr17cent-VIC TaqMan próbákat, és 1 × mintafelvitelről reagenst (Fluidigm). A reakcióelegyet egyenletesen eloszlik a 770 reakcióteret, és a digitális tömb volt thermo-szakad egy EP1 Rendszer FC1 cycler. A két cél régiókat függetlenül felerősödött és 6-karboxi és VIC festékkel jeleket kamrákat rögzített végén minden PCR ciklus. Száma 6-karboxi-pozitív (HER2) és VIC-pozitív (CEP17) kamrák mindegyik panel megszámoljuk, és HER2 katalógusa /CEP17 kópiaszám arányt úgy számítjuk ki [27]. Katalógusa
Eredmények katalógusa
/CEP17 arány kapott digitális PCR [ R
] a következőképpen fejezhető ki, azon a feltételezésen alapul, hogy a gén kópiaszámát a rákos sejtek homogén, és hogy a nem rákos sejtek genetikailag stabil diploid kromoszóma (ábra az 1A és 1B) :( 1), ahol [ r katalógusa] ez az arány HER2 katalógusa hogy CEP17 kapott digitális PCR (0 < r
); [ x katalógusa] a TCR (0 ≤ x katalógusa ≤ 1); [ Egy fiatal] a CEP17 kópiaszám egyetlen rákos sejt (0 ≤ Egy fiatal); és [ B katalógusa] HER2 katalógusa kópiaszám egyetlen rákos sejt (0 ≤ B katalógusa). A továbbiakban a kétdimenziós szórásgörbe képviselő Eq (1) nevezik a TC chart. Katalógusa
] és [ x katalógusa], mint a függőleges és vízszintes tengelyeken (1B ábra). Az arány a [ B katalógusa / Egy fiatal] volt a referenciaérték meghatározásához HER2 katalógusa génamplifikációt. Valójában a tényleges kópiaszám CEP17 [ Egy fiatal] és HER2 katalógusa [ B katalógusa] nem lehetett meghatározni, hogy nem végzünk HER2 katalógusa -DISH. Azonban a gyakorlati értékelése HER2 katalógusa és CEP17 kópiaszám a Dish megállapította, hogy [ Egy fiatal] mozgott 2,0-6,0 (40 és 117 CEP17 jelek között 20 ráksejtek S1 és S2 táblák) és soha nem haladta meg 8,0 klinikai gyomorrák mintákat. Tapasztalataink szerint a 164 egymást követő esetben gyomorrák (Ushiku T és munkatársai katalógusa. Nem publikált adat), CEP17 kópiaszám 1,0-5,7, medián 2,5 és monosomiát, amelyek a [ A
< 1.5] meglehetősen ritka csak két esetben (1,2%). Így a tartományban [ Egy fiatal] lett beállítva [2 ≤ Egy fiatal ≤ 8] egy biztonsági tartalékot. Katalógusa
erősítés-pozitív volt [ B katalógusa / Egy fiatal ≥ 2] vagy [ B katalógusa ≥2 Egy fiatal]. Ebben az esetben a [ Bx
+ 2 (1 - X
)] a következőképpen fejezhető ki: (7)
] (2 ≤ Egy fiatal ≤ 8). katalógusa
] 0 (nem tartalmaz rákos sejtek), az összes sor konvergált koordinátákra (0,1) azon a feltételezésen alapul, hogy a nem rákos sejtek genomically stabil. Ha a [ x katalógusa] a 1.0 (amely csak a rákos sejteket), vonalak áthaladt a koordinátákat (1,2) függetlenül értékek [ Egy fiatal] és [ B
]. katalógusa
jeleket amelyeket nehéz volt megkülönböztetni egyedileg (2C ábra); ezek száma önkényesen maximális értékei 7., 14., és 21. szerinti klaszter méretben. Így egy alacsonyabb HER2
/CEP17 arány kaptuk HER2
-DISH mint a digitális PCR-rel.
jeleket csoportosulnak, amely csökkentette a becsült kópiaszáma. Ezért alkalmazása [ Egy fiatal = 4,15], [ r katalógusa = 5,69], és [ x katalógusa = 1,0] egyenlet (1), a becsült HER2 katalógusa kópiaszám [ B 'katalógusa] feltételeztük, hogy [ B' katalógusa = 5,69 × 4,15 = 23,61]. Ezért [ Egy fiatal = 4.15] és [ B 'katalógusa = 23,61] whilethe referencia vonal [ r katalógusa = (23,61 x + 2 katalógusa (1 - x katalógusa)) /(4,15 x katalógusa + 2 (1 - x katalógusa))] (ábra 2E). Ábrázoltuk digitális PCR adatok SK-BR-3 sejtek összekeverjük az LCL megfeleltek ezen a vonalon, nem pedig [ r katalógusa = (19,50 x katalógusa + 2 (1 - x
)) /(4,15 x katalógusa + 2 (1 - x katalógusa))], amelynek alapja a HER2 katalógusa -DISH adatokhoz [ B katalógusa = 19,50]. Ezek az eredmények azt mutatják érvényességét a TC chart-ie, hogy elegendő quantitativity digitális PCR megkülönböztetni HER2-amplifikált nem amplifikált sejtek. Katalógusa
-DISH-pozitív (piros), -equivocal (lila) és -negatív (kék), valamint a HER2-IHC-pozitív (rhombi), -equivocal (háromszögek) és -negatív ( cross-jelek) mintákban. Klinikopatológiai információt reprezentatív és a teljes esetekben táblázatban mutatjuk be a 3. és az S1 táblázat volt. Nem voltak HER2 katalógusa -DISH-pozitív esetek vonal alatt [ r katalógusa = x katalógusa + 1]; azonban egy HER2 katalógusa -DISH-negatív ( ), két kétértelmű (és), és három pozitív (,)és,) esetben volt megfigyelhető a kétes terület . Emellett volt egy HER2
-DISH-negatív esetben a pozitív terület (!). Három esetben (,és*) azt mutatta, igen magas digitális PCR értékeket (28.25, 19.99, 24.00, sorrendben). HER2 katalógusa -DISH, ezekben az esetekben mutatott csoportosulnak HER2 katalógusa jelek (3C), amelyek a nehéz számszerűsíteni, mint az SK-BR-3 sejtek. Eq (1) is kifejezve a következők: (11) hotelben
] és [ x katalógusa] és a mért [ Egy fiatal], melyet meghatározni rendbeli CEP17 kapott jelek szerint HER2 katalógusa -DISH 20 rákos sejtek (táblázat 3 és S1 táblázat). [ B 'katalógusa] is mérésével kapott [ r katalógusa] és [ Egy fiatal] és [ x katalógusa = 1] leírt SK-BR-3-sejtekben.
-DISH vagy HER2-IHC információkat. Tehát egy elemzést TC chart független CEP17 és HER2 katalógusa kópiaszám ([ Egy fiatal] és [ B katalógusa]) egy rákos sejt, amely képes általában lehet a HER2 katalógusa -DISH.
amplifikáció szerte változó gyomorrák szövettani típusú, 20% -30%, a bél a < 10% -kal a diffúz típus [32]. Ezért a hatékony szűrési módszer szükséges a rutin klinikai gyakorlatban, különösen azokban az országokban magas prevalenciája a gyomorrák. TC chart is használható más PCR-alapú módszer, például kvantitatív PCR HER2 katalógusa erősítés [33]. Katalógusa