Extracto
La evaluación de HER2 Visto:. Matsusaka K, S Ishikawa, Nakayama A, Ushiku T, Nishimoto A, Urabe M, et al. (2016) Tumor contenido gráfico Asistida por HER2 /CEP17 Editor: Yves St-Pierre, INRS, Canada | Recibido: 7 de noviembre de 2015; Aceptado: 13 Abril de 2016; Publicado: 27 Abril 2016 Derechos de Autor © 2016 Matsusaka y col. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan Disponibilidad de datos:. Todo relevante los datos están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y Financiación:. Este trabajo se llevó a cabo como parte del Proyecto BioBanco Japón (http://www.src.riken.jp/english/project/person/) que fue apoyado por el Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología (http://www.mext.go.jp/english/), la Agencia Japonesa para la investigación médica y el desarrollo (http: //www.amed.go .jp /es /), y subvenciones-en-Ayudas a la Investigación Científica (KAKENHI) de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (https://www.jsps.go.jp/english/e-grants/). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia Introducción el cáncer gástrico es uno de los tumores malignos más comunes y la tercera causa principal de muerte por cáncer en todo el mundo [1]. Los casos avanzados sin la intervención quirúrgica tienen mal pronóstico y requieren enfoques de tratamiento multidisciplinares. HER2 es una glicoproteína transmembrana de 185 kDa que es un miembro de la familia del receptor del factor de crecimiento epidérmico y funciona como un receptor de tirosina quinasa [2, 3]. En las células normales, HER2 proteína actúa como un transductor de señal durante la proliferación o diferenciación celular [4]; sin embargo, tiene propiedades oncogénicas cuando se sobreexpresa. Esto es causado usualmente por HER2 Para los pacientes con cáncer gástrico resecable, el estado de HER2 debe ser examinada usando una pequeña muestra de la biopsia. Como se representa en las últimas recomendaciones para la determinación de HER2 en cáncer de mama por la American Society of Clinical Oncology (ASCO) /Colegio Americano de Patólogos (CAP), inmunohistoquímica (IHC) y /o hibridación in situ (ISH) son los métodos estándar para la evaluación de HER2 de estado [19], pero cada uno tiene sus limitaciones. Por ejemplo, la eficacia de HER2-IHC se ve afectado por varios factores tales como el proceso de fijación con formalina, y el sistema de puntuación no siempre es reproducible especialmente en casos dudosos, para el que se recomienda ISH [19-25]. En campo claro HER2 En este estudio, hemos aplicado basada en la tecnología digital de microfluidos PCR. (BioMark; Fluidigm, Cambridge, Reino Unido) [26] para determinar relación de número de copia HER2 Ética Declaración Este estudio fue aprobado por el Comité Ético de la Universidad de Tokio Institucional. Las muestras clínicas con el consentimiento informado por escrito se recogieron en virtud de la Universidad de Tokio directrices institucionales para el estudio de los tejidos humanos. clínicos gástricos muestras de biopsias de cáncer y especímenes quirúrgicos En total, 44 muestras de biopsia de cáncer gástrico de 32 pacientes tratados por la rutina fijado en formol e incluido en parafina (FFPE) estaban disponibles para el análisis. Todas las muestras de biopsia endoscópica se obtuvieron en el Departamento de Endoscopia y Cirugía Endoscópica. Cuatro muestras quirúrgicas, que fueron resecados quirúrgicamente en el Departamento de Cirugía Gastrointestinal, también se analizaron. Estas muestras fueron fijadas en 10% formalina tamponada neutra. Todos los casos fueron diagnosticados en el Departamento de Patología del Hospital de la Universidad de Tokio. Se cortaron secciones con un espesor de 4 micras mediante el uso de técnicas histológicas convencionales; éstos se recogieron en portaobjetos de vidrio y se utilizan para hematoxilina-eosina (HE) tinción, HER2 IHC, y HER2 La inmunohistoquímica La tinción inmunohistoquímica se llevó a cabo en el tejido FFPE usando Ventana XT BenchMark (Roche Diagnostics) con el anticuerpo 4D5 anti-HER2. patrones de intensidad de tinción de membrana y de inmunorreactividad se calculan utilizando el sistema de puntuación Dako según las directrices de la ASCO /PAC [19]. No tinción de membrana se puntuó como 0; débil o apenas perceptible tinción de membrana /incompleta se calificó como 1+; incompleta y /o débil tinción de membrana periférica moderada /se calificó como 2+; y completamente e intensamente tinción de membrana periférica se calificó como 3+. HER2 HER2 Para extraer el ADN de las muestras de biopsia, 10 de serie de secciones cortadas a un espesor de 10 micras se colocaron sobre una superficie de vidrio para HER2 -IHC y HER2 los conjuntos de cebadores para amplificar digitales HER2 Opiniones y CEP17 se muestran en la Tabla 1. Cada cebador se diseñó de tal manera que los productos de PCR obtenidos fueron suficientemente corto (59 y 65 pb) para eliminar la influencia de la fragmentación del ADN en el proceso de FFPE. PCR Digital se llevó a cabo utilizando un sistema de EP1 con un circuito de fluido integrado 48.770 matriz digital (Fluidigm). Cada chip contenía 48 paneles que se dividieron adicionalmente en 770 cámaras de reacción. Se utilizó el número de señales fluorescentes positivos en cada panel para cuantificar diferentes secuencias de ADN. El protocolo se ha descrito en otra parte [26]. Brevemente, se prepararon 4-l mezclas de reacción para cada ensayo que contenía 1 × TaqMan la expresión génica mezcla maestra, 1 × HER2-FAM y sondas TaqMan VIC-chr17cent, y 1 × reactivo de carga de muestra (Fluidigm). La mezcla de reacción se distribuyó uniformemente en las cámaras de reacción 770 y la matriz digital fue ciclada termo en un ciclador EP1 sistema FC1. Las dos regiones diana se amplificaron de forma independiente y las señales de 6-carboxifluoresceína y colorantes VIC en las cámaras se registraron al final de cada ciclo de PCR. El número de cámaras de 6-carboxifluoresceína-positivos (HER2) y VIC-positivos (CEP17) en cada panel se contó y Relación de número de copia HER2 imagen de conjunto de diapositivas de perfiles HE, que eran los que justo antes de las secciones de serie para la extracción de ADN, relación de contenido tumoral (TCR) Los experimentos para el desarrollo de los gráficos TC Las líneas celulares. Para los experimentos de control, el cáncer de pulmón H522 y SK-BR-3 líneas celulares de cáncer de mama se obtuvieron de la American Type Culture Collection (Manassas, VA, EE.UU.). Se obtuvo GM18997 de Epstein-Barr virus transformado línea celular linfoblastoide (LCL) de Coriell biorepositorio (https://catalog.coriell.org/). H522 células y el LCL se cultivaron en medio Roswell Park Memorial Institute-1640 (Nacalai Tesque, Kyoto, Japón) que contenía suero bovino fetal al 10% (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.) y solución de penicilina-estreptomicina al 1% ( Nacalai Tesque). SK-BR-3 células se cultivaron en medio de Eagle Modificado /F12 Hams de Dulbecco (Nacalai Tesque, Japón) con suero bovino fetal al 10% y 1% de penicilina /estreptomicina. Las células se cultivaron a 37 ° C en una atmósfera que contiene 5% de CO 2. Se extrajo el ADN utilizando un kit QIAquick DNA mini (Qiagen). FFPE H522, SK-BR-3, y LCL bloques de células se prepararon para HER2 El ADN genómico de H522 y SK BR-3 células y el LCL se ajustó a una concentración de 50 ng /l. ADN genómico H522 y LCL se mezcló en ocho pasos en las siguientes relaciones de volumen: 8: 2, 7: 3, 6: 4, 5: 5, 4: 6, 3: 7, 2: 8, y 1: 9 (H522 : LCL). SK-BR-3 y el ADN genómico LCL se mezcló en cuatro pasos en las siguientes relaciones de volumen: 8: 2, 6: 4, 4: 6, y 2: 8 (SK-BR-3: LCL). pruebas de Chi-cuadrado se aplicaron para comparar los recuentos entre HER2 Resultados Desarrollo de la gráfica TC para los datos de PCR Digital El se determinó la relación HER2 En el presente estudio, [ x la ecuación (1) se representa gráficamente como la tabla de TC, con [ r Hemos definido HER2 Los dos lados de la ecuación (2) se dividieron por [ Ax la combinación de las ecuaciones (1) y (3) arrojó los siguientes: (4) (5) la ecuación (5) era una condición equivalente a [ B Opiniones / un Hotel < 2]. El miembro lateral derecho de la ecuación (5) indica un aumento monotónico de acuerdo a la variable [ A Por lo tanto, cada vez que la ecuación (6) se mostró satisfecho, el HER2 Por otro lado, la definición de HER2 ecuación (7) se procesó de la misma manera como las ecuaciones (2) - (5) y se expresó de la siguiente manera: (8) la ecuación (8) era una condición equivalente a [ B Opiniones un Por lo tanto, cada vez que la ecuación (9) se mostró satisfecho, el HER2 Cuando las ecuaciones (6) y (9) se representa en el gráfico de TC, el área por encima de la línea curva hacia arriba [ r = Cuando [ x Comparación de la PCR digital y HER2 Hemos validado la ecuación teórica (1) y el diagrama de TC por un sistema de mezcla por etapas de líneas celulares. La ecuación (1) se obtuvo utilizando los valores medidos reales de [ Un número de copias relativa de HER2 Opiniones y CEP17 ( HER2 H522 y 3-SK-BR ADN genómico de células se mezcló con la del LCL de una manera escalonada y las mezclas se analizaron por PCR digital. En las células H522, HER2 La concordancia entre el diagrama de TC para la PCR digital y HER2 IHC /. - DISH en muestras de biopsias clínicas muestras de biopsia de cáncer gástrico (n = 44) de los 32 pacientes fueron analizados por PCR digital. El HER2 PCR datos digitales y TCR de cada caso se representan en el gráfico de TC (figura 4), incluidos los datos HER2 En teoría estimado [ B Opiniones / Un se evaluaron múltiples casos de ocho pacientes (figura 4 y Tabla S1). Todos los casos en cada paciente mostraron los mismos resultados para DISH y PCR digital salvo para-24 Paciente (Pt-24); uno de los cinco casos ( ) fue positivo y dos ( y ) fueron negativos para ambas mediciones. Dos casos negativos para el plato fueron asignados a las áreas positivas (!) y equívoco ( ) en la tabla de TC (Tabla 3 y Tabla S1). En total, 22 casos HER2 IHC tenían una puntuación de 2 + (Tabla 4), que comprende tres positivos, 15 negativos, y cuatro casos dudosos en base a la tabla de TC de PCR digital. Los resultados positivos y negativos fueron completamente concordantes con los de HER2 intratumoral HER2 heterogeneidad se evaluó mediante una combinación de HER2 IHC /-DISH y PCR digital (figura 5, la figura S1 y el cuadro S2). Case_1, 2 y 4 mostraron una heterogeneidad intratumoral distinta que consiste en lesiones HER2 IHC-positivos y negativos en un clúster, mientras Case_3 general mostró un patrón de expresión de HER2-IHC equívoca. Es importante destacar que las lesiones HER2-positivos fueron accesibles desde el lumen del estómago en Case_1 (-2,-3), Case_2 (-1,-2), y Case_4 (-4). Todos los /las cajas HER2 IHC -DISH-positivos se representaron en la zona positiva. Tres muestras de Case_3 (-1, -2, y -3) que muestra HER2-IHC (equívoco) y HER2 Discusión el estudio es el primero en intentar una categorización de los cánceres gástricos en HER2 el método PCR digital ha sido aplicada a la evaluación del número de copias de virus [28], la aneuploidía cromosómica fetal [29], y en varios oncogenes tejidos de cáncer [30, 31]. Un problema importante que se debe superar es la corrección de los datos en bruto de acuerdo con el contenido del tumor de los especímenes; tejidos de cáncer gástrico generalmente contienen cantidades más grandes de la infiltración de células no cancerosas, por ejemplo, células intersticiales o inflamatorias. En el presente estudio, se utilizó el análisis de imágenes para obtener una estimación semi-automatizado del contenido de las células tumorales y desarrollamos el gráfico TC para clasificar los datos en tres categorías, es decir., Amplificada, no amplificados, y equívocos. Puede ser que sea posible purificar las células de cáncer de secciones de tejido FFPE por microdisección, pero esto es demasiado laborioso para la práctica clínica habitual, incluso si es más preciso en la teoría. Al utilizar este enfoque para las muestras de biopsia, el número de casos HER2 IHC-equívocos (2+) se redujo de 22 a seis, por lo tanto la necesidad de confirmación por HER2
amplificación génica es un componente esencial de la toma de decisiones terapéuticas para avanzados o cáncer gástrico metastásico. Un método simple que es aplicable a, muestras pequeñas, fijadas en formalina embebidos en parafina de biopsia es deseable como un complemento de o como un sustituto para inmunohistoquímica HER2 se utilizan actualmente y en los protocolos de hibridación in situ. En este estudio, hemos desarrollado un método de PCR digital basada en la microfluídica para la determinación de HER2 Opiniones y centrómero del cromosoma 17 (CEP17) en número de copias y la estimación de relación de contenido tumoral (TCR). El relación HER2
/CEP17 está determinada por tres el número de copias absolutas de las variables-TCR y HER2 Opiniones y CEP17-mediante el examen de las células tumorales; solamente la relación de los dos últimos se puede obtener por PCR digital utilizando toda la muestra sin purificar las células tumorales. TCR se determinó por análisis de imagen semi-automática. Hemos desarrollado una tabla de contenidos de tumor, que es un plano de coordenadas rectangulares que consiste en los datos HER2
/CEP17 digital de PCR y TCR que delinea amplificadas y no amplificadas, y áreas equívocos. Mediante la aplicación de este método, 44 clínicos muestras de biopsia de cáncer gástrico se clasificaron como amplificado (n = 13), no amplificado (n = 25), o equívoca (n = 6). En comparación, 11 muestras fueron positivas, 11 fueron negativos, y 22 eran equívocamente inmunohistoquímica. Por lo tanto, nuestro nuevo método reduce el número de muestras equívocos 22-6, obviando así la necesidad de confirmación por fluorescencia o de doble sonda de hibridación in situ a < 30% de los casos. El análisis de PCR digital de tumor contenido de la carta-asistida es aplicable a múltiples sitios en los tejidos extirpados quirúrgicamente también. Estos resultados indican que este análisis es una alternativa útil a HER2 inmunohistoquímica en los cánceres gástricos que pueden servir de base para la evaluación automatizada de los HER2
estado
Análisis de PCR digital de cáncer gástrico especímenes de biopsia. PLoS ONE 11 (4): e0154430. doi: 10.1371 /journal.pone.0154430
amplificación de genes, que ha sido reportado en varios tipos de tumores malignos [5] incluyendo el cáncer de mama [6, 7], adenocarcinoma de glándula salival [8], el cáncer de vejiga urinaria [9] , y cáncer gástrico [10]. cánceres gástricos con sobreexpresión de HER2 representan el 8% -31% de todos los casos [11-15]. En el trastuzumab para el juicio del cáncer del estómago, el trastuzumab (Roche Diagnostics, Basilea, Suiza): un aumento de anticuerpos de la tasa de supervivencia anti-HER2 monoclonal humanizado de los pacientes con cáncer gástrico HER2-positivo cuando se administra en combinación con quimioterapia [16], y estaba también aprobado para el tratamiento de cánceres de mama [17, 18]. Evaluar el estado de HER2, por tanto, es un aspecto esencial de la terapia del cáncer gástrico.
ISH de doble sonda ( HER2
-DISH), HER2 Opiniones y centrómero del cromosoma 17 (CEP17) en número de copias pueden ser detectados como señales bajo una luz microscopio sobre toda la región de la muestra. Sin embargo, aunque este método tiene una sensibilidad superior, que es costoso y relativamente lento
/CEP17. En la PCR digital, plantilla de ADN se divide en 770 piezas en cámaras de reacción de nanolitros, con una concentración esperada de 0-1 molécula por cámara. De dos colores objetivo y de referencia genes son amplificados simultáneamente-PCR y su número de copias se calculan contando las cámaras con señales positivas. Este método muy robusto permitió la comparación de los número de copias CEP17 HER2
y el uso de diferentes conjuntos de cebadores. El objetivo de este estudio fue confirmar la viabilidad de la tecnología digital PCR para el análisis de muestras de biopsia de cáncer gástrico. Sin embargo, un problema con este enfoque es que el tejido por lo general contiene las células del estroma no cancerosas que interfieren con los análisis moleculares. Para superar este problema, hemos desarrollado gráfico de dispersión de dos dimensiones se refiere como el contenido del tumor (TC) tabla que asigna los datos en amplificado, no amplificado, y las categorías equívocos. El objetivo era desarrollar un medio automatizado de evaluación de HER2
estado, con TC gráfico asistido por HER2
/CEP17 digital de PCR análisis que sirve como el primer paso.
Materiales y métodos
-DISH.
Placa de tinción y evaluación
-DISH se realizó en FFPE tejido utilizando el kit DNA DISH HER2 (Roche Diagnostics) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y las muestras se evaluaron por microscopía de luz. HER2
señales aparecieron como puntos negros o clusters, y las señales CEP17 apareció como puntos rojos. Veinte superposición de los núcleos que no son cancerosas se anotó para la CEP17 señales de HER2 y
y HER2
amplificación de genes se clasificó según lo recomendado por las directrices de la ASCO /PAC [19]; positivo, [ SU página 2 /CEP17 relación de ≥ 2,0] y /o [promedio SU página 2 número de copias ≥ 6,0 señales /célula]; equívoca, [ SU página 2 /CEP17 relación < 2.0] y [promedio SU página 2 número de copias ≥ 4,0 y < 6.0 /señales celulares]; negativo, [ SU página 2 /CEP17 relación < 2.0] y [promedio SU página 2 número de copias de < 4.0 señales /célula].
Preparación de ADN a partir de material clínico FFPE
-DISH. contenido tumoral se confirmó antes y después de la sección tiñendo las diapositivas adyacentes con HE. Desde un único bloque de parafina generalmente contiene varias piezas de muestra de biopsia, muestras individuales fueron aislados utilizando un cortador de vidrio. Para extraer el ADN de especímenes resecados quirúrgicos, 5 secciones en serie de cada tejido-bloque representante se cortaron a un espesor de 10 micras, que se colocaron en una hoja hecha de politetrafluoroetileno (PTFE, Sanplatec, Osaka, Japón). La membrana es la resistencia química para desparafinación a base de xileno, y se puede cortar fácilmente en pedazos. En el estudio, fueron varias partes del clip hacia fuera de las hojas de acuerdo con el perfil HER2. Vidrio o de PTFE piezas fueron ensambladas en un tubo de 2.0 ml, y el ADN se extrajo usando el kit de ADN de tejidos FFPE QIAamp (Qiagen, Valencia, CA, EE.UU.).
HER2
evaluación del número de copias por PCR
/CEP17 se calculó [27].
Evaluación de
fue preparada utilizando NanoZoomer (Hamamatsu Photonics, Hamamatsu, Japón). Los datos fueron importados a Definiens Tissue Studio 2.0 (http://www.tissuestudio.com) para la determinación del TCR. La región seleccionada de especímenes quirúrgicos se escaneó utilizando un microscopio BZ-710 (Keyence, Osaka, Japón). Los datos se importan al software recuento de células híbrido (BZ-H3C, Keyence). Los datos que se detalla el número de células en las imágenes importadas y las células cancerosas de distinguidos no canceroso en función del tamaño del núcleo fueron generados automáticamente
evaluación -DISH.
mezcla por etapas con LCL.
-DISH y PCR digital en H522 y SK-BR-3 células y LCL. Las diferencias se consideraron significativas si p Hotel < 0.05
/CEP17 basado en tres variables:. TCR y el número de copias absoluta de HER2 Opiniones y CEP17. Sólo las proporciones relativas de los dos últimos se pueden obtener mediante PCR digital utilizando la muestra de tumor sin aislar células individuales. La relación HER2
/CEP17 obtenido por Digital PCR [ r
] se expresó como sigue, basado en el supuesto de que el número de copias de genes de las células de cáncer son homogéneos y que las células no cancerosas son genéticamente estable con cromosomas diploides (Fig 1A y 1B) :( 1) donde [ r
] es la relación de HER2
a CEP17 obtenido por PCR digital (0 < r
); [ x
] es TCR (0 ≤ x
≤ 1); [ Un
] es el número de copias CEP17 en una sola célula cancerosa (0 ≤ Un
); y [ B Opiniones] es HER2
número de copias en una sola célula cancerosa (0 ≤ B Opiniones). De aquí en adelante, el diagrama de dispersión bidimensional representada por la ecuación (1) se conoce como la tabla de TC.
] se determinó a partir de muestras HE-teñidas utilizando la imagen el software de análisis, como el software de análisis de imágenes de tejidos Estudio de las muestras de biopsia y software Contador híbrido de pila de los especímenes quirúrgicos, respectivamente; y [ r
] y [ x
] se determinaron a partir de mediciones.
] y [ x
] como los ejes vertical y horizontal, respectivamente (figura 1B). La relación de [ B Opiniones / Un
] era el valor de referencia para la determinación de HER2
amplificación de genes. De hecho, el número de copias real de CEP17 [ Un
] y HER2
[ B Opiniones] no se pudo determinar sin realizar HER2
-DISH. Sin embargo, una evaluación práctica de HER2 Opiniones y CEP17 en número de copias por DISH encontró que [ Un
] varió de 2.0 a la 6.0 (entre 40 y 117 CEP17 señales entre las células del cáncer en 20 S1 y S2 tablas) y nunca superaron el 8,0 en muestras clínicas de cáncer gástrico. De acuerdo con nuestra experiencia de 164 casos consecutivos de cáncer gástrico (Ushiku T et al.
Datos no publicados), el número de copias CEP17 es 1,0 a 5,7, mediana 2,5, y monosomía, definida como [
< 1.5], es bastante raro en sólo dos casos (1,2%). Por lo tanto, el rango de [ Un
] se configura como [2 ≤ Un
≤ 8] con un margen de seguridad.
amplificación negativa como [ B Opiniones / Un Hotel < 2] o [ B Hotel < 2 Un
]. [ Bx
+ 2 (1 - x
)] se expresó de la siguiente manera: (2)
+ 2 (1 - x
)] :( 3)
] (2 ≤ A
≤ 8); incorporación de [ Un
= 2], que corresponde al valor mínimo de [ Un
], en la ecuación (5) se obtuvo el siguiente: (6)
condiciones de amplificación negativo [ B Opiniones / Un Hotel < 2], fue cierto para cualquier valor de [ Un
] (2 ≤ Un
≤ 8).
amplificación positivos fue [ B Opiniones / Un
≥ 2] o [ B Opiniones ≥2 Un
]. En este caso, [ Bx
+ 2 (1 - x
)] se expresó como sigue: (7)
≥ / 2]; el miembro lateral derecho de la ecuación indica un aumento monotónico. La incorporación de [ Un
= 8], que corresponde al valor máximo de [ Un
], en la ecuación (8) se desprende la siguiente: (9)
condiciones de amplificación positivas [ B Opiniones / Un
≥ 2], fue cierto para cualquier valor de [
] (2 ≤ Un
≤ 8).
(7 x
+ 1) /(3 x
+ 1)] ( Un
= 8) fue designado como el área positiva, y el área por debajo de la línea recta [ r =
x
+ 1] ( Un
= 2) fue el área negativa. La zona delimitada por las líneas [ r =
x
+ 1] y [ r =
(7 x
+ 1) /(3 x
+ 1)] fue una zona indefinida en función del valor de [ a
], que fue designado como el área equívoca y se define como sigue (Fig 1B) :( 10)
] era 0 (que no contiene células cancerosas), todas las líneas convergieron en las coordenadas (0,1) basado en la suposición de que las células no cancerosas son genómicamente estable. Cuando [ x
] fue de 1,0 (que consiste en células cancerosas sólo), líneas de pasar a través de las coordenadas (1,2), independientemente de los valores para [ Un
] y [ B
].
-DISH en células cultivadas
] y [ B Opiniones] obtenido por HER2
-DISH en líneas celulares, o utilizando el calcularon [ B '
] de [ Un
] y medido [ r
].
/CEP17) en LCL y H522 y SK-BR-3cells fueron evaluados por HER2
-DISH utilizando bloques de células FFPE y por PCR digital (Tabla 2). HER2
señales aparecieron como puntos discretos en los núcleos de HER2
-DISH (figura 2A y 2B); HER2
número de copias en las células individuales fue casi dos de LCL y cuatro en células H522. Por el contrario, SK-BR-3 células mostraron agrupados HER2
señales que eran difíciles de distinguir de forma individual (Figura 2C); sus números se establecieron arbitrariamente a los valores máximos de 7, 14, y 21 de acuerdo con tamaños de clúster. Por lo tanto, un menor relación HER2
/CEP17 se obtuvo por HER2
-DISH que por PCR digital.
[ B Opiniones] y CEP17 [ Un
] copiar números se calcularon a partir de HER2
-DISH de la siguiente manera: [ Una
= 41/20 = 2,05] y [ B Opiniones = 85/20 = 4,25]. Cuando los valores de [ Un
] y [ B Opiniones] se aplica a la ecuación (1), los datos podrían ser descritos por la línea de referencia [ r = (
4.25 x
+ 2 (1 - x
)) /(2,05 x
+ 2 (1 - x
))] (figura 2D ). En el caso de las células-BR-3 SK, CEP17 número de copias [ Un
] era [ Un
= 83/20 = 4,15]; sin embargo, como se describió anteriormente, HER2
señales se agruparon, que disminuyó el número de copias estimado. Por lo tanto, la aplicación de [ Un
= 4,15], [ r = 5,69
] y [ x
= 1.0] a la ecuación (1), el estimado HER2
número de copias [ B '
] se presumía que era [ B'
= 5,69 × 4,15 = 23,61]. Así pues, [ Un
= 4,15] y [ B '
= 23,61] whilethe línea de referencia fue [ r =
(23.61 x + 2
(1 - x
)) /(4,15 x
+ 2 (1 - x
))] (figura 2E). Graficados PCR datos digitales a partir de células-BR-3 SK mezclados con el LCL se ajustaban a esta línea [en lugar de r =
(19.50 x
+ 2 (1 - x
)) /(4,15 x
+ 2 (1 - x
))], que se basa en HER2
datos -DISH para los cuales [ B
= 19,50]. Estos resultados demuestran la validez de la carta-TC es decir, que no tiene suficiente de quantitativity digital PCR para distinguir HER2-amplificado a partir de células no amplificados
estado de cada muestra se determinó por HER2 IHC y -DISH (Figura 3A-3C). Los valores estimados fueron consistentes con los recuentos manuales realizados por un patólogo (KM). tasa de TC se determinó a partir de imágenes por distinguir núcleos de cancerosos de las de células no cancerosas (Figura 3D).
-DISH-positivo (rojo), -equivocal (púrpura) y negativos (azul), así como HER2 IHC-positivo (rombos), -equivocal (triángulos), y negativos ( cruzadas marcas) muestras. la información clínico-patológica en casos representativos y en total se muestra en la Tabla 3 y la Tabla S1, respectivamente. No hubo HER2
casos -DISH positivo por debajo de la línea [ r =
x
+ 1]; sin embargo, un HER2-negativo
-DISH ( ), se observaron dos (y), y tres positivos (,)y,) casos dudosos en la zona equívoca . Además, había un HER2
caso -DISH negativo en la zona positiva (!). Tres casos (,y*) mostraron valores de PCR digitales marcadamente elevados (28.25, 19.99, 24.00 y, respectivamente). En HER2
-DISH, mostró agrupan estos casos HER2
señales (Figura 3C), que eran difíciles de cuantificar, como en SK-BR-3 células. La ecuación (1) también se expresó de la siguiente manera: (11)
] se calculó mediante la aplicación de la medida [ r
] y [ x
] y medido [ Un
], que se determina a partir de los recuentos de señales CEP17 obtenidos por HER2
-DISH en 20 células de cáncer (Tabla 3 y en la Tabla S1). [ B '
] fue también obtiene midiendo [ r
] y [ Un
] y [ x
= 1], como se describe para SK-BR-3 células.
-DISH. De los cuatro casos dudosos con puntuación de IHC 2+, uno () fue positiva y los otros (, y)) fueron negativos, según lo determinado por HER2
-DISH. La [ B Opiniones / Un
] valor estimado era consecuencia ≥ 2,0 en el casoy < 2.0 en los últimos tres, excepto para el caso), el estimado [ B Opiniones / Un
] de los cuales era 2.12.
Evaluación de la heterogeneidad intratumoral HER2 en muestras quirúrgicas
-DISH (positivo) se representaron en la zona equívoca. Muestra-2 se trazó en la zona equívoca debido región-2 cubrió un área relativamente grande que contiene componentes tanto HER2-positivos y negativos. Muestra-2 mostraron discrepancias entre HER2 IHC (positivo) y HER2
-DISH (negativo) (Tabla S2), con los resultados de la PCR digital correspondiente a HER2
-DISH.
casos de amplificación negativo, -equivocal, y -positivo mediante el uso de una dispersión de dos dimensiones parcela o un gráfico TC, sobre la base de los valores medidos de HER2
/CEP17 cociente obtenido por PCR digitales [ r
] y TCR [ x
] sin HER2 convencional
-DISH o información de HER2 IHC. Por lo tanto, un análisis realizado por la carta TC es independiente de CEP17 y HER2
número de copias ([ Un
] y [ B Opiniones]) en una sola célula de cáncer, lo que puede normalmente se obtiene por HER2
-DISH.
-DISH podría obviarse a menos del 30% de los casos. La frecuencia de HER2
amplificación varía a través de tipos histológicos de cáncer gástrico, de 20% -30% en el intestinal a < 10% en el tipo difuso [32]. Por lo tanto, se requiere un método de cribado eficaz en la práctica clínica habitual, especialmente en países con una alta prevalencia de cáncer gástrico. gráfico de TC puede ser también utilizado con otro método basado en PCR, tal como la PCR cuantitativa para HER2