Abstract
Het evalueren van HER2 Citation kunnen dienen. Matsusaka K, S Ishikawa, nakayama A, Ushiku T, Nishimoto A, Urabe M, et al. (2016) Tumor Content Grafiek-Assisted HER2 / Editor: Yves St-Pierre, INRS, CANADA Ontvangen: 7 november 2015; Geaccepteerd: 13 april 2016; Gepubliceerd: 27 april 2016 Copyright: © 2016 Matsusaka et al. Dit is een open toegang Artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd Data Availability:. Alle relevante gegevens binnen het papier en de Ondersteunende informatie bestanden Financiering:. Dit werk werd uitgevoerd als onderdeel van de BioBank Japan Project (http://www.src.riken.jp/english/project/person/), die werd ondersteund door het Ministerie van Onderwijs, Cultuur, Sport, Wetenschap en Technologie (http://www.mext.go.jp/english/), Japan Agentschap voor medisch onderzoek en ontwikkeling (http: //www.amed.go .jp /nl /), en Grants-in-Steun voor Wetenschappelijk Onderzoek (KAKENHI) van de Japan Society voor de Bevordering van de Wetenschap (https://www.jsps.go.jp/english/e-grants/). De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan Introductie Maagkanker is een van de meest voorkomende kwaadaardige tumoren en de derde belangrijke oorzaak van kanker-gerelateerde sterfgevallen wereldwijd [1]. Gevorderde gevallen zonder operatieve ingreep hebben een slechte prognose en noodzakelijk multidisciplinaire behandeling benaderingen. HER2 is een 185-kDa transmembraan glycoproteïne dat een lid van de epidermale groeifactor receptorfamilie en functioneert als een receptor tyrosinekinase [2, 3]. In normale cellen, HER2 eiwit werkt als een signaaltransductor tijdens celproliferatie of differentiatie [4]; Maar het heeft oncogene eigenschappen wanneer tot overexpressie gebracht. Dit wordt meestal veroorzaakt door Voor patiënten met inoperabel maagkankers dient HER2 status onderzocht met een kleine biopt. Zoals weergegeven in de meest recente aanbevelingen voor het HER2 testen in borstkanker door American Society of Clinical Oncology (ASCO) /College van Amerikaanse Pathologen (CAP), immunohistochemie (IHC) en /of in situ hybridisatie (ISH) zijn de standaard methoden voor het evalueren van HER2 -status [19], maar elk heeft zijn beperkingen. Zo wordt de effectiviteit van HER2-IHC afhankelijk van verschillende factoren zoals het formaline fixatie proces en het scoresysteem is niet altijd reproduceerbaar name dubbelzinnige gevallen waarvoor ISH aanbevolen [19-25]. In heldere veld HER2 In deze studie hebben we toegepast microfluidics-gebaseerde digitale PCR technologie. (BioMark, Fluidigm, Cambridge, UK) [26] te bepalen HER2 Twitter /CEP17 copy number ratio. In digitale PCR, wordt template-DNA verdeeld in 770 stukjes in nanoliter reactiekamers, met een verwachte concentratie van 0-1 molecule per kamer. Dual-gekleurde doelwit en referentie-genen tegelijkertijd PCR-versterkt en hun kopie-aantallen worden berekend door het tellen van de kamers met positieve signalen. Deze zeer robuuste methode kon de vergelijking van de HER2 Kopen en CEP17 kopie-aantallen met behulp van verschillende primer sets. Het doel van deze studie was om de haalbaarheid van digitale PCR-technologie voor de analyse van maagkanker biopten bevestigen. Een probleem met deze benadering is dat het weefsel bevat gewoonlijk goedaardige stromacellen die interfereren met moleculaire analyses. Om dit probleem te overwinnen, ontwikkelden we tweedimensionale wel de Tumor Content (TC) diagram dat gegevens toewijst in versterkte, niet-versterkte en dubbelzinnige categorieën spreidingsdiagram. Het doel was om een geautomatiseerde manier van evalueren ontwikkelen HER2 Verklaring Ethiek Deze studie werd goedgekeurd door de Universiteit van Tokyo Institutional Ethische Commissie. Klinische monsters met schriftelijke informed consent werden verzameld in het kader van de Universiteit van Tokyo institutionele richtlijnen voor de studie van menselijke weefsels. In totaal 44 maagkanker biopsie specimens van 32 patiënten verwerkt door routine-formaline gefixeerde in paraffine ingebedde (FFPE) waren beschikbaar voor analyse. Alle biopsie monsters werden endoscopisch verkregen bij de afdeling Endoscopie en Endoscopische Chirurgie. Vier chirurgische exemplaren, die operatief werden weggesneden op de afdeling Gastro-intestinale chirurgie, werden ook geanalyseerd. Deze exemplaren werden gefixeerd in 10% neutraal gebufferde formaline. In alle gevallen werden gediagnosticeerd bij de afdeling Pathologie van de Universiteit van Tokyo Hospital. Secties werden bij een dikte van 4 urn gesneden door toepassing van gebruikelijke histologische technieken; deze werden verzameld op glasplaatjes en gebruikt voor hematoxyline-eosine (HE) kleuring, HER2-IHC en HER2 Immunohistochemie Immunohistochemische kleuring werd uitgevoerd op FFPE weefsel met behulp Ventana BenchMark XT (Roche Diagnostics) met het 4D5 antilichaam tegen HER2. Kleurintensiteit en membraan immunoreactiviteit patronen werden beoordeeld volgens het scoringssysteem Dako volgens ASCO /CAP richtlijnen [19]. Nr membraan kleuring werd gescoord als 0; flauw of nauwelijks waarneembaar /onvolledige membraankleuring werd gescoord als 1+; onvolledig en /of zwak /matig omtrek membraankleuring werd gescoord als 2+; en volledig en intens omtrek membraan kleuring werd gescoord als 3+. HER2 HER2 Om DNA uit biopsie monsters te extraheren, 10 seriële coupes met een dikte van 10 urn op een glazen oppervlak voor HER2 geplaatst -IHC en HER2 primer sets voor het amplificeren HER2 Kopen en CEP17 worden getoond in Tabel 1. Elke primer werd ontworpen zodat de PCR producten verkregen waren voldoende korte (59 en 65 bp) het elimineren invloed van DNA-fragmentatie in de FFPE proces. Digitale PCR werd uitgevoerd onder toepassing van een systeem met een EP1 48,770 digitale matrix geïntegreerde fluïdumkringloop (Fluidigm). Elke chip bevat 48 panelen die verder werden verdeeld in 770 reactiekamers. Het aantal positieve fluorescentiesignalen in elk paneel werd gebruikt om verschillende DNA-sequenties te kwantificeren. Het protocol is elders [26] beschreven. In het kort werden 4-pl reactiemengsels voorbereid voor elke test die 1 x TaqMan genexpressie master mix, 1 × HER2-FAM en chr17cent-VIC TaqMan probes, en 1 × monster laden reagens (Fluidigm) bevatte. Het reactiemengsel werd gelijkmatig verdeeld in de reactiekamers 770 en de digitale array thermo-cycled op EP1 System FC1 cycler. De twee doelgebieden werden afzonderlijk geamplificeerd en 6-carboxyfluoresceïne en VIC kleurstof signalen in de kamers werden opgenomen aan het einde van elke PCR-cyclus. Het aantal van 6-carboxyfluoresceïne-positieve (HER2) en VIC-positieve (CEP17) kamers in elk paneel werd geteld en HER2 Twitter /CEP17 copy number verhouding werd berekend [27]. slide beeld van HE secties, waarin die net voor de seriële secties voor DNA-extractie waren Whole, werd gescand met behulp van NanoZoomer (Hamamatsu Photonics, Hamamatsu, Japan). De gegevens werden geïmporteerd in Definiens Tissue Studio 2.0 (http://www.tissuestudio.com) voor het bepalen van TCR. Het geselecteerde gebied van chirurgische specimens werd gescand met behulp van een BZ-710 microscoop (Keyence, Osaka, Japan). De gegevens werden geïmporteerd in Hybrid Cell Count software (BZ-H3C, Keyence). Gegevens die het aantal cellen in geïmporteerde afbeeldingen en kankerachtige onderscheiden van niet-kankercellen gedetailleerde gebaseerd op nucleus formaat werden automatisch gegenereerd Experimenten voor het ontwikkelen van de TC overzichten Cellijnen. Bij controleproeven, H522 longkanker en SK-BR-3 borstkanker cellijnen werden verkregen van de American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). GM18997 Epstein-Barr-virus getransformeerde lymfoblastoïde cellijn (LCL) werd verkregen van Coriell biorepository (https://catalog.coriell.org/). H522 cellen en LCL werden gekweekt in Roswell Park Memorial Institute 1640-medium (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan) dat 10% foetaal runderserum (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) en 1% penicilline-streptomycine-oplossing ( Nacalai Tesque). SK-BR-3-cellen werden gekweekt in Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium /Hams F12 (Nacalai Tesque, Japan) met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline /streptomycine. Cellen werden gekweekt bij 37 ° C in een atmosfeer die 5% CO 2. DNA werd geëxtraheerd met behulp van een QIAquick DNA mini kit (Qiagen). FFPE H522, SK-BR-3, en LCL cel blokken werden voorbereid op HER2 Genomic DNA van H522 en SK -BR-3 cellen en LCL werd ingesteld op een concentratie van 50 ng /ul. H522 en LCL genomisch DNA werd gemengd in acht stappen in de volgende volumeverhoudingen: 8: 2, 7: 3, 6: 4, 5: 5, 4: 6, 3: 7, 2: 8 en 1: 9 (H522 : LCL). SK-BR-3 en LCL genomisch DNA werd gemengd in vier stappen in de volgende volumeverhoudingen: 8: 2, 6: 4, 4: 6 en 2: 8 (SK-BR-3: LCL). Statistische analyses Chi-kwadraat testen werden toegepast op tellingen tussen de HER2 Resultaten Ontwikkeling van de TC grafiek voor digitale PCR data De HER2 Twitter /CEP17 verhouding werd bepaald op basis van drie variabelen:. TCR en absolute kopie aantallen HER2 Kopen en CEP17. Alleen de relatieve verhoudingen van de twee laatstgenoemde kan worden verkregen door PCR met de digitale tumor specimen zonder isoleren van individuele cellen. HER2 In de huidige studie, [ x Eq (1) werd grafisch voorgesteld als de TC grafiek, met [ r We gedefinieerd HER2 Beide zijden van vergelijking (2) gehouden op [ Ax de combinatie met vergelijkingen (1) en (3) leverde de volgende: (4) (5) Eq (5) was een voorwaarde gelijk aan [ B Twitter / a Restaurant < 2]. De rechterkant lid van vergelijking (5) wees op een monotone toename volgens de variabele [ A Daarom wanneer Eq (6) was voldaan, de HER2 Aan de andere kant, de definitie van HER2 vergelijking (7) werd behandeld op dezelfde wijze als vergelijkingen (2) - (5) en werd uitgedrukt als volgt: (8) Eq (8) was een voorwaarde gelijk aan [ B Twitter / a Dus, wanneer Eq (9) was voldaan, de HER2 bij vergelijkingen (6) en (9) werden uitgezet op de TC grafiek, het gebied boven de lijn gebogen naar boven [ r Wanneer [ x Vergelijking van digitale PCR en HER2 We gevalideerd theoretische vergelijking (1) en TC grafiek door een stapsgewijze mengsel systeem cellijnen. De vergelijking (1) werd verkregen met behulp van werkelijk gemeten waarden van [ A Relatieve kopie aantallen HER2 Kopen en CEP17 ( HER2 Twitter /CEP17) in LCL en H522 en SK-BR-3cells werden beoordeeld door HER2 H522 en SK-BR-3 cell genoom-DNA werd gemengd met dat de LCL stapsgewijs en de mengsels werden geanalyseerd met digitale PCR. In H522 cellen, HER2 Overeenstemming tussen TC grafiek voor digitale PCR en HER2-IHC /. - schotel in klinische biopsiesteekproeven Maagkanker biopten (n = 44) van 32 patiënten werden geanalyseerd met digitale PCR. De HER2 Digital PCR data en TCR elk geval werden uitgezet op de TC grafiek (figuur 4), waaronder data voor HER2 In theorie naar schatting [ B Twitter / A Meerdere gevallen werden beoordeeld op acht patiënten (figuur 4 en Tabel S1). Alle gevallen elke patiënt vertoonde dezelfde resultaten schotel en digitale PCR behalve Patiënt 24 (Pt-24); een van de vijf gevallen ( ) was positief en twee ( en ) waren negatief voor beide metingen. Twee gevallen negatief voor DISH werden toegewezen aan positieve (!) en dubbelzinnige ( ) gebieden in de TC grafiek (tabel 3 en S1 tabel). In totaal 22 HER2-IHC gevallen had een score van 2+ (Tabel 4), omvattende drie positieve, negatieve 15 en vier dubbelzinnige gevallen op basis van de TC grafiek van digitale PCR. Positieve en negatieve resultaten waren volledig overeenstemmend met die van de HER2 intratumorale heterogeniteit HER2 werd geëvalueerd door een combinatie van HER2-IHC /-DISH en digitale PCR (figuur 5, figuur S1 en S2 tabel). Case_1, 2 en 4 toonde duidelijke intratumorale heterogeniteit bestaande uit HER2-IHC-positieve en -negatieve laesies in een cluster, terwijl Case_3 over het algemeen sprake van een dubbelzinnige HER2-IHC expressie patroon. Belangrijker HER2-positieve laesies toegankelijk vanuit het lumen van de maag Case_1 (-2,-3), Case_2 (-1,-2) en Case_4 (-4). Alle HER2-IHC /-DISH-positieve gevallen werden uitgezet in de positieve omgeving. Drie monsters van Case_3 (-1, -2 en -3) tonen HER2-IHC (twijfelachtig) en HER2 Discussie de studie is de eerste die een indeling van maagkanker proberen in HER2 de digitale PCR-werkwijze werd toegepast voor de beoordeling van kopie-aantal van virussen [28], foetale chromosomale aneuploïdie [29] en in diverse oncogenen kankerweefsels [30, 31]. Een groot probleem dat overwonnen moet worden is de correctie van ruwe gegevens volgens de inhoud van tumor specimens; maagkanker weefsels bevatten gewoonlijk grotere hoeveelheden niet-kankerachtige cel infiltratie, b.v. interstitiële of ontstekingscellen. In deze studie hebben we gebruik beeldanalyse een semi-automatische schatting van tumorcel gehalte te bepalen en ontwikkelde de TC diagram om data te delen in drie categorieën-d.w.z.., Versterkt, niet versterkt, en dubbelzinnig. Het zou mogelijk zijn om kankercellen FFPE weefselsecties te zuiveren door microdissectie, maar dit is te omslachtig voor routinematige klinische praktijk, ook al is nauwkeuriger in theorie. Met deze aanpak voor biopsie specimens, het aantal HER2-IHC-dubbelzinnige gevallen (2+) werd teruggebracht van 22 tot zes, waardoor de behoefte aan bevestiging door HER2 Er zijn bijkomende voordelen van de digitale PCR protocol. Ten eerste is het eenvoudig opzichte ISH, die vaardigheid vereist en is arbeidsintensief, omvattende meerdere stappen. In de tweede plaats, zijn minder gevallen vereist voor de validatie dan zijn nodig voor HER2
genamplificatie is een essentieel onderdeel van de therapeutische besluitvorming voor geavanceerde of gemetastaseerde maagkanker. Een eenvoudige methode voor kleine, met formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde biopsiemonsters is wenselijk als aanvulling op of als vervanging van momenteel gebruikte HER2 immunohistochemie en in situ hybridisatie protocollen. In deze studie hebben we een-microfluidics gebaseerde digitale PCR-methode voor de bepaling van HER2 Kopen en chromosoom 17 centromeer (CEP17) kopiëren nummers en het schatten van tumor inhoud ratio (TCR). De HER2 Twitter /CEP17 verhouding wordt bepaald door drie variabelen-TCR en absolute kopie-aantallen van HER2 Kopen en CEP17-door het onderzoeken van tumorcellen; slechts de verhouding van deze twee kan worden verkregen door PCR met de digitale gehele monster zonder zuiveren tumorcellen. TCR werd bepaald door semi-automatische beeldanalyse. We ontwikkelden een Tumor Content diagram, dat een vlak van rechthoekige coördinaten, bestaande uit HER2
/CEP17 digitale PCR databank TCR dat omlijnt versterkt, niet-versterkt en dubbelzinnig gebieden. Door toepassing van deze methode werden 44 klinische maagkanker biopsie monsters geclassificeerd als geamplificeerd (n = 13), niet-versterkte (n = 25) of dubbelzinnige (n = 6). Ter vergelijking: 11 monsters waren positief, 11 waren negatief, en 22 waren eenduidig immunohistochemie. Aldus onze nieuwe werkwijze heeft het aantal monsters dubbelzinnige 22-6, waardoor de behoefte aan bevestiging door fluorescentie of dual-probe in situ hybridisatie met <ondervangen; 30% van de gevallen. Tumor-inhoud chart ondersteunde digitale PCR analyse ook voor verscheidene sites chirurgisch weggesneden weefsel. Deze resultaten geven aan dat deze analyse een bruikbaar alternatief HER2 immunohistochemie in maagkanker die als basis voor de geautomatiseerde evaluatie van HER2
toestand
CEP17 Digitale PCR Analyse van maagkanker biopten. PLoS ONE 11 (4): e0154430. doi: 10.1371 /journal.pone.0154430
HER2 genamplificatie, die werd gemeld in verschillende soorten kwaadaardige tumor [5] waaronder borstkanker [6, 7], speekselklier adenocarcinoom [8], urineblaaskanker [9] en maagkanker [10]. HER2-overexpressie maagkanker zijn goed voor 8% -31% van alle gevallen [11-15]. In het proces voor Trastuzumab maagkanker, trastuzumab (Roche Diagnostics, Bazel, Zwitserland) -a gehumaniseerd anti-HER2-monoklonaal antilichaam verhoogde de overlevingskans van HER2-positieve maagkanker indien toegediend in combinatie met chemotherapie [16] en was ook goedgekeurd voor de behandeling van borstkanker [17, 18]. Evaluatie HER2 status dan ook essentieel maagkanker therapie.
dual-probe ISH ( HER2
-DISH), HER2 Kopen en chromosoom 17 centromeer (CEP17) kopiëren nummers kunnen worden gedetecteerd als signalen onder een lichte microscoop over de hele regio van het monster. Hoewel deze methode superieure gevoeligheid, is kostbaar en relatief tijdrovend
-status, met TC-chart bijgestaan HER2 Twitter /CEP17 digitale PCR-analyse die als de eerste stap.
Materialen en methoden
Clinical maagkanker biopten en chirurgische monsters
-DISH.
DISH kleuring en evaluatie
-DISH werd uitgevoerd op FFPE weefsel met de HER2 DNA schotel kit (Roche Diagnostics) volgens de instructies van de fabrikant, en de monsters werden geëvalueerd met lichtmicroscopie. HER2
signalen verscheen als zwarte stippen of clusters, en CEP17 signalen verscheen als rode stippen. Twintig niet-overlappende kanker kernen werden gescoord voor de HER2 Kopen en CEP17 signalen en HER2
genamplificatie werd geclassificeerd als aanbevolen door de richtsnoeren ASCO /CAP [19]; positief, [ HER-verhuur 2 /CEP17 verhouding ≥ 2,0] en /of [gemiddeld HER-verhuur 2 copy number ≥ 6,0 signalen /cel]; dubbelzinnig, [ HER-verhuur 2 /CEP17 verhouding < 2.0] en [gemiddelde HER-verhuur 2 copy number ≥ 4,0 en < 6.0 signalen /cel]; negatief, [ HER-verhuur 2 /CEP17 verhouding < 2.0] en [gemiddelde HER-verhuur 2 copy number < 4,0 signalen /cel].
Bereiding van DNA uit klinisch materiaal FFPE
-DISH. Tumor inhoud werd bevestigd voor en na het snijden door het kleuren van de aangrenzende dia's met HE. Aangezien één blok paraffine bevat meestal verschillende stukken van biopsie monster, werden individuele exemplaren geïsoleerd met behulp van een glassnijder. DNA van chirurgische resectiepreparaten extract werd 5 seriecoupes van elke representatieve weefsel-blok bij een dikte van 10 urn, die op een blad gemaakt van polytetrafluorethyleen (PTFE, Sanplatec, Osaka, Japan) werden geplaatst gesneden. Het membraan chemische bestendigheid voor-xyleen gebaseerde deparaffinisatie en gemakkelijk in stukken gesneden. In het onderzoek werden verschillende onderdelen uitknippen van de platen volgens HER2 profiel. Glas of PTFE stukken werden verzameld in een 2,0 ml buis, en DNA werd geëxtraheerd met behulp van de QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA).
HER2
kopienummer beoordeling van digitale PCR
Evaluatie tumor inhoud ratio (TCR)
-DISH evaluatie.
Stapsgewijze mengen met LCL.
-DISH en digitale PCR in H522 en SK-BR-3-cellen en LCL te vergelijken. Verschillen werden beschouwd als significant beschouwd als p
< 0.05
/CEP17 verhouding verkregen door digitale PCR [ r
] als volgt, op basis van de veronderstelling dat gen kopie aantal kankercellen homogeen en niet-kankercellen genetisch uitgedrukt stabiel diploïde chromosomen (figuur 1A en 1B) :( 1) waarbij [ r
] is de verhouding van HER2 Belgique om CEP17 verkregen digitale PCR (0 < r
); [ x
] is TCR (0 ≤ x
≤ 1); [ A
] is CEP17 aantal kopieën in een enkele kankercel (0 ≤ A
); en [ B
] is HER2
aantal kopieën in een enkele kankercel (0 ≤ B
). Hierna wordt de tweedimensionale scatterplot weergegeven door vergelijking (1), aangeduid als de TC grafiek.
] werd bepaald op basis van HE-gekleurde exemplaren met behulp van beeld analysesoftware, zoals weefsel Studio beeldanalyse software voor de biopten en hybride celtelling software voor de chirurgische specimens, respectievelijk; en [ r
] en [ x
] werden bepaald op basis van metingen.
] en [ x
] als de verticale en horizontale assen, respectievelijk (figuur 1B). De verhouding tussen [ B Twitter / A
] was de referentiewaarde voor de bepaling van HER2
genamplificatie. Inderdaad de werkelijke aantal kopieën van CEP17 [ A
] en HER2
[ B
] kon niet worden vastgesteld zonder het uitvoeren van HER2
-DISH. Echter, een praktische evaluatie van de HER2 Kopen en CEP17 kopiëren nummers door DISH vond dat [ A
] varieerde 2,0-6,0 (tussen de 40 en 117 CEP17 signalen tussen de 20 kankercellen in S1 en S2 tabellen) en nooit meer dan 8,0 in klinische maagkanker monsters. Volgens onze ervaring van 164 opeenvolgende gevallen van maagkanker (Ushiku T et al
. Ongepubliceerde gegevens), CEP17 aantal kopieën is 1,0-5,7, mediaan 2,5 en monosomie, gedefinieerd als [ A
< 1.5], is vrij zeldzaam in slechts twee gevallen (1,2%). Zo is het bereik van [ A
] is ingesteld als [2 ≤ A
≤ 8] met een veiligheidsmarge.
amplificatie-negatieve als [ B Twitter / A Restaurant < 2] of [ B Restaurant < 2 A
]. [ Bx
+ 2 (1 - x
)] werd vervolgens uitgedrukt als volgt: (2)
+ 2 (1 - x
)] :( 3)
] (2 ≤ A
≤ 8); incorporatie van [ A
= 2], waarbij de minimale waarde van was [ A
], in vergelijking (5) gaf het volgende: (6)
amplificatie-negatieve voorwaarde [ B Twitter / A Restaurant < 2] gold voor elke waarde van [ A
] (2 ≤ A
≤ 8).
amplificatie-positief was [ B Twitter / A
≥ 2] of [ B
≥2 A
]. In dit geval, [ Bx
+ 2 (1 - x
)] als volgt uitgedrukt: (7)
≥ 2]; de rechterzijde lid van de vergelijking aangegeven een monotone stijging. Opname van [ A
= 8], dat de maximale waarde van was [ A
], in vergelijking (8) leverde de volgende: (9)
amplificatie-positieve voorwaarde [ B Twitter / A
≥ 2] gold voor elke waarde van [ A
] (2 ≤ A
≤ 8).
= (7 x
+ 1) /(3 x
+ 1)] ( A
= 8) werd aangewezen als de positieve omgeving, en het gebied onder de rechte lijn [ r
= x
+ 1] ( A
= 2) was de negatieve omgeving. Het gebied dat wordt ingesloten door de lijnen [ r
= x
+ 1] en [ r
= (7 x
+ 1) /(3 x
+ 1)] was een onbepaalde zone afhankelijk van de waarde van [ A
], die werd aangeduid als dubbelzinnige stippellijn gedefinieerd als volgt (figuur 1B) :( 10)
] 0 is (die geen kankercellen), alle lijnen geconvergeerd op de coördinaten (0,1) uitgegaan dat niet-kankercellen genomisch stabiel. Wanneer [ x
] werd 1,0 (bestaande uit alleen kankercellen), lijnen doorgegeven via de coördinaten (1,2) onafhankelijk van waarden voor [ A
] en [ B
].
-DISH in gekweekte cellen
] en [ B
] verkregen door HER2
-DISH in cellijnen, of met behulp van de berekende [ B '
] van [ A
] en gemeten [ r
].
-DISH behulp FFPE cel blokken en door digitale PCR (tabel 2). HER2
signalen verscheen als afzonderlijke stippen in kernen met HER2
-DISH (Fig 2A en 2B); HER2
aantal kopieën in individuele cellen was bijna twee in LCL en vier in H522 cellen. In contrast, SK-BR-3-cellen vertoonden geclusterd HER2
signalen die moeilijk waren te individualiseren (figuur 2C); hun aantallen werden arbitrair op de maximale waarde van 7, 14 en 21 volgens clusters. Zo kan een lagere HER2 Twitter /CEP17 verhouding werd verkregen door HER2
-DISH dan door digitale PCR.
[ B
] en CEP17 [ A
] kopiëren nummers werden berekend uit HER2
-DISH als volgt: [ Een
= 41/20 = 2,05] en [ B
= 85/20 = 4.25]. Wanneer de waarden van [ A
] en [ B
] werden aangebracht op Eq (1), kunnen de gegevens worden beschreven door de referentielijn [ r
= ( 4.25 x
+ 2 (1 - x
)) /(2,05 x
+ 2 (1 - x
))] (Fig 2D ). In het geval van SK-BR-3-cellen, CEP17 copy number [ A
] was [ A
= 83/20 = 4.15]; Zoals hierboven beschreven, HER2
signalen werden gegroepeerd, waarbij het geschatte aantal kopieën af. Daarom is het toepassen van [ A
= 4.15], [ r
= 5,69] en [ x
= 1,0] Vgl (1), de geschatte HER2
copy number [ B '[
= 5,69 x 4,15 = 23,61
] werd vermoed B] be'. Vandaar dat [ A
= 4,15] en [ B '
= 23,61] whilethe verwijzing lijn was [ r
= (23.61 x
+ 2 (1 - x
)) /(4,15 x
+ 2 (1 - x
))] (figuur 2E). Uitgezet digitale PCR-gegevens van SK-BR-3-cellen gemengd met de LCL gelijkvormig aan deze lijn in plaats van [ r
= (19.50 x
+ 2 (1 - x
)) /(4,15 x
+ 2 (1 - x
))], dat gebaseerd was op HER2
-DISH gegevens waarvoor [ B
= 19,50]. Deze resultaten tonen aan de geldigheid van de TC chart-ie, dat zij over voldoende quantitativity digitale PCR to-HER2 versterkt uit niet-versterkte cellen te onderscheiden
status van elk monster werd bepaald door HER2-IHC en -DISH (Fig 3A-3C). De geschatte waarden waren consistent met handmatige tellingen door een patholoog (KM). TC koers is uit afbeeldingen bepaald door onderscheid kernen van kankerachtige van die van niet-kankercellen (figuur 3D).
-DISH-positieve (rood), -equivocal (paars) en -negatieve (blauw), alsmede HER2-IHC-positieve (ruiten), -equivocal (driehoeken), en -negatieve ( cross-merken) monsters. Clinicopathologische informatie op representatieve en totale gevallen wordt getoond in Tabel 3 en Tabel S1 resp. Er waren geen HER2
-DISH-positieve gevallen onder de lijn [ r
= x
+ 1]; Echter, een HER2
-DISH-negatief ( ), twee dubbelzinnige (en), en drie positieve (,)en,) gevallen werden waargenomen in de dubbelzinnige gebied . Daarnaast was er een HER2
-DISH-negatieve geval in de positieve gebied (!). Drie gevallen (,en*) toonde opvallend hoge digitale PCR-waarden (28.25, 19.99 en 24.00, respectievelijk). In HER2
-DISH, deze gevallen bleek geclusterd HER2
signalen (figuur 3C), die moeilijk te kwantificeren waren, zoals in SK-BR-3-cellen. Eq (1) werd ook uitgedrukt als volgt: (11)
] werd berekend door toepassing van de gemeten [ r
] en [ x
] en gemeten [ A
], die werd bepaald op basis van tellingen van CEP17 signalen verkregen door HER2
-DISH in 20 kankercellen (Tabel 3 en Tabel S1). [ B '
] werd ook verkregen door het meten van [ r
] en [ A
] en [ x
= 1], zoals beschreven voor SK-BR-3 cellen.
-DISH. Van de vier twijfelachtige gevallen met IHC score 2+, was één () positief is en de anderen (, en)) waren negatief, zoals bepaald door HER2
-DISH. De geschatte [ B Twitter / A
] waarde was bijgevolg ≥ 2,0 bijen < 2.0 in de laatste drie, met uitzondering van de zaak), de geschatte [ B Twitter / A
] daarvan was 2,12.
Evaluatie van intratumorale HER2 heterogeniteit in chirurgische specimens
-DISH (positief) werden uitgezet in de dubbelzinnige gebied. Monster-2 is uitgezet in de dubbelzinnige gebied, omdat regio-2 onder een relatief groot oppervlak die zowel HER2-positieve en -negatieve componenten. Monster-2 toonde discrepanties tussen HER2-IHC (positief) en HER2
-DISH (negatief) (S2 Table), met de digitale PCR-resultaten die overeenkomen met HER2
-DISH.
amplificatie-negatief, -equivocal en -positieve gevallen door het gebruik van een tweedimensionale scatter plot of TC grafiek, gebaseerd op de gemeten waarden van HER2 Twitter /CEP17 verhouding verkregen door digitale PCR [ r
] en TCR [ x
] zonder conventionele HER2
-DISH of HER2-IHC informatie. Dus, een analyse van TC grafiek is onafhankelijk van CEP17 en HER2
kopiëren nummers ([ A
] en [ B
]) in een enkele kankercel, dat kan gewoonlijk worden verkregen door HER2
-DISH.
-DISH kunnen worden ondervangen tot minder dan 30% zaken. De frequentie van de HER2
versterking verschilt maagkanker histologische types, van 20% -30% in de darm om < 10% van de diffuse soort [32]. Daarom is een doeltreffende screeningmethode vereiste dagelijkse praktijk, vooral in landen met een hoge prevalentie van maagkanker. TC kaart kan ook worden gebruikt met andere PCR-methode, zoals kwantitatieve PCR voor
HER2-amplificatie [33].