abstraktné
Vyhodnotenie HER2 Citácia :. Matsusaka K, Ishikawa S, Nakayama A, T Ushiku, NISHIMOTO A, Urabe M, et al. (2016) Tumor Obsah Graf-Assisted HER2 /CEP17 Strih: Yves St-Pierre, INRS, Kanada prijatá: 7. novembra 2015; Prijaté: 13. apríla 2016; Uverejnené: 27.apríla 2016 Copyright: © 2016 Matsusaka et al. Toto je článok o otvorenej distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané Dáta Availability :. Všetky relevantné údaje sú v papiera a jeho podporné informácie súbory Financovanie :. Táto práca bola vykonaná ako súčasť biobanky Japan Project (http://www.src.riken.jp/english/project/person/), ktorý bol podporený Ministerstvom školstva, kultúry, športu, vedy a technológie (http://www.mext.go.jp/english/~~HEAD=pobj), Japonsko agentúra pre lekársky výskum a vývoj (http: //www.amed.go .jp /en /), a granty-v-pomoc pre vedecký výskum (KAKENHI) z Japonska spoločnosť pre podporu vedy (https://www.jsps.go.jp/english/e-grants/). Platcovia mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo prípravu rukopisu Konkurenčné záujmy: .. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú Úvod karcinóm žalúdka je jedným z najčastejších zhubných nádorov a treťou najčastejšou príčinou úmrtia na nádorové ochorenie na celom svete [1]. Pokročilé prípady bez operatívneho zásahu majú zlú prognózu a vyžaduje multidisciplinárne liečebné prístupy. HER2 je transmembránový glykoproteín 185 kDa, ktorý je členom rodiny epidermálneho rastového faktora receptora a funguje ako tyrozínkinázy receptora [2, 3]. V normálnych bunkách, HER2 proteín pôsobí ako vysielač signálu počas bunkovej proliferácie alebo diferenciácie [4]; Avšak, to má onkogénne vlastnosti, pokiaľ je nadmerne exprimovaný. To je zvyčajne spôsobené tým, HER2 U pacientov s neoperovateľným rakoviny žalúdka, by mal byť stav HER2 skúmané pomocou malej vzorky biopsie. Ako je znázornené na najnovších odporúčaní pre testovanie HER2 u karcinómu prsníka u American Society of Clinical Oncology (ASCO) /College amerických patológov (CAP), imunohistochemicky (IHC) a /alebo in situ hybridizácia (ISH), sú štandardné metódy na hodnotenie HER2 stav [19], ale každý z nich má svoje obmedzenia. Napríklad, efektivita HER2-IHC je ovplyvnený viacerými faktormi, ako je formalín proces fixácie, a bodovací systém nie je vždy reprodukovateľné a to najmä v prípadoch, nejasných, pre ktoré sa odporúča ISH [19-25]. Pri jasnom poli HER2 V tejto štúdii sme aplikovali Microfluidics založených na digitálnu technológiu PCR. (BioMark, Fluidigm, Cambridge, UK) [26] pre stanovenie HER2 vyhlásenie pre etiku Táto štúdia bola schválená etickou komisiou Institutional University of Tokyo. Klinické vzorky s písomný informovaný súhlas boli zozbierané v rámci University of Tokyo pokynov inštitucionálnej pre štúdium ľudských tkanív. Celkom bolo 44 vzorky žalúdočné biopsia Rakovina z 32 pacientov, spracovaných rutinné formalínom fixované zaliatych parafínu (FFPE) boli k dispozícii pre analýzu. Všetky biopsie boli získané endoskopicky na Katedre endoskopie a endoskopickou chirurgiu. Štyri chirurgické vzorky, ktoré boli operaciindikováni chirurgicky na Oddelenie gastrointestinálne operácií, boli tiež analyzované. Tieto vzorky boli fixované v 10% neutrálnom pufrovanom formalínu. Všetky prípady boli diagnostikované na katedre patológie na univerzite v Tokiu nemocnice. Rezy boli narezané na hrúbku 4 um použitím konvenčných histologických metód; tieto boli zhromaždené na sklenenej doštičky a použité pre hematoxylín-eozín (HE) farbenie, HER2-IHC a HER2 Imunohistochémia Imunohistochemické farbenie bolo vykonané na FFPE tkaniva pomocou Ventana Benchmark XT (Roche Diagnostics) s protilátkou 4D5 anti-HER2. Farbenie vzory intenzita a membránová imunoreaktivity boli hodnotené za použitia bodovacieho systému Dako v súlade s pokynmi ASCO /CAP [19]. Nie membránové farbenie bola hodnotená ako 0; mdloby alebo sotva postrehnuteľné /neúplná membránové farbenie bola hodnotená ako 1+; neúplné a /alebo slabý /mierny obvodové membránové farbenie bola hodnotená ako 2+; a úplne a intenzívne obvodové membránové farbenie bola hodnotená ako 3+. HER2 HER2 Ak chcete extrahovať DNA z biopsie vzoriek, 10 sériové rezy rezané pri hrúbke 10 um boli umiestnené na povrchu skla pre HER2 -IHC a HER2 sady primérov pre amplifikáciu HER2 stroje a CEP17 sú uvedené v tabuľke 1. Každý primer bol navrhnutý tak, že PCR produkty získané boli dostatočne krátka (59 a 65 bp), na odstránenie vplyv fragmentácie DNA v procese FFPE. Digitálna PCR bola vykonaná za použitia EP1 systém s integrovaným obvodom fluidné 48,770 digitálneho poľa (Fluidigm). Každý čip obsahoval 48 panelov, ktoré boli ďalej rozdelené do 770 reakčných komôr. Počet pozitívnych fluorescenčných signálov v každom paneli bola použitá pre kvantifikáciu rôznych sekvencií DNA. Protokol bol opísaný na inom mieste [26]. Stručne povedané, 4-ul reakčnej zmesi boli pripravené pre každý test, ktorý obsahoval 1 × TaqMan génovej expresie master mix, 1 × HER2-FAM a VIC-chr17cent TaqMan sond a 1 × vzorka nakladacia činidlo (Fluidigm). Reakčná zmes sa rozdelí rovnomerne do reakčnej komory 770 a duálny sa termo-cykluje na EP1 systém FC1 cyklovača. Tieto dve cieľové oblasti boli amplifikovanej nezávisle a 6-karboxyfluorescein a VIC farbivá signály v komore, boli zaznamenané na konci každého cyklu PCR. Počet 6-karboxyfluorescein pozitívnych (HER2) a VIC-pozitívny (CEP17) komôr v každom paneli ráta a HER2 Celá dráha obraz HE úsekov, ktoré boli tie, tesne pred sériových sekciou pre extrakciu DNA, boli kontrolované pomocou NanoZoomer (Hamamatsu Photonics, Hamamatsu, Japonsko). Dáta bola importovaná do definiens Tissue Studio 2.0 (http://www.tissuestudio.com) na stanovenie TCR. Zvolená oblasť chirurgických vzoriek boli kontrolované pomocou BZ-710 mikroskopu (Keyence, Osaka, Japonsko). Dáta bola importovaná do Hybrid Cell Count softvér (BZ-H3C, Keyence). Dáta, ktoré podrobne počet buniek v importovaných obrazov a význačných rakovinové od non-rakovinové bunky založené na jadre veľkosti boli automaticky generované Experimenty pre rozvoj TC grafy bunkových línií. Pre kontrolné experimenty, rakoviny pľúc H522 a SK-BR-3 karcinómu prsníka bunkové línie boli získané z American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). GM18997 Epstein-Barrovej transformovaných lymfoblastoidných bunková línia (LCL) sa získa z Coriell Biorepository (https://catalog.coriell.org/). H522 bunky a LCL boli kultivované v Roswell Park Memoriál Institute, 1640 (Nacalai Tesque, Kyoto, Japonsko) s obsahom 10% fetálneho hovädzieho séra (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) a 1% roztok penicilín-streptomycín ( Nacalai Tesque). SK-BR-3 bunky boli kultivované v Dulbecco modifikovanom Eaglovho média /Hams F12 (Nacalai Tesque, Japonsko) s 10% fetálnym bovinným sérom a 1% penicilín /streptomycín. Bunky boli kultivované pri teplote 37 ° C v atmosfére obsahujúcej 5% CO 2. DNA bola extrahovaná s použitím súpravy QIAquick DNA mini (Qiagen). FFPE H522, SK-BR-3 a LCL buniek bloky boli pripravené na HER2 genómovej DNA H522 a SK BR-3 bunky a LCL sa upraví na koncentráciu 50 ng /ul. H522 a LCL genomická DNA sa zmieša v ôsmich krokoch v nasledujúcich pomeroch objem: 8: 2, 7: 3 a 6: 4, 5: 5, 4: 6, 3: 7, 2: 8, 1: 9 (H522 : LCL). SK-BR-3 a LCL genomická DNA sa zmiešajú v štyroch krokoch v nasledujúcich pomeroch objem: 8: 2, 6: 4, 4: 6 a 2: 8 (SK-BR-3: LCL). štatistickej analýzy Chi-kvadrát testy boli použité pre porovnanie sa počíta medzi HER2 Výsledky Vývoj TC grafe pre digitálnu PCR dát pomer HER2 V tejto štúdii [ x rovnice (1) sa graficky znázorniť ako grafu TC, pomocou tlačidla [ r Definovali sme HER2 Na oboch stranách rovnice (2) boli rozdelené do [ Ax Kombinácia s rovnicami (1) a (3) sa získa nasledovné: (4) (5) rovnice (5) bolo podmienkou ekvivalentné [ B Z tohto dôvodu kedykoľvek rovnice (6) bola splnená, HER2 Na druhej strane, definícia HER2 rovnice (7), sa spracuje rovnakým spôsobom ako ENK (2) - (5), a bola vyjadrená takto: (8) rovnice (8) bolo podmienkou ekvivalentné [ B Tak, kedykoľvek rovnice (9) bola splnená, HER2 NEK (6) a (9), boli vynesené na grafe TC, oblasť nad líniu zakrivenie hore [ r = [ x Porovnanie digitálnej PCR a HER2 overená sme teoretický rovnice (1) a TC graf systémom postupným zmesi bunkových línií. Ekvalizéra (1) bol získaný v meraných hodnôt [ A Relatívna kopírovať počty HER2 H522 a SK-BR-3 buniek genomická DNA sa zmieša s že na LCL vo stupňovito a zmesi boli analyzované pomocou digitálnej PCR. V bunkách H522, HER2 Zhoda medzi TC grafe pre digitálnu PCR a HER2-IHC /. - DISH vo vzorkách klinických biopsiou vzorky žalúdočné biopsia rakovina (n = 44) z 32 pacientov, boli analyzované pomocou digitálneho PCR. HER2 dát Digitálne PCR a TCR každého prípadu boli vynesené do grafu na TC grafu (obr 4), vrátane údajov za HER2 Teoreticky odhaduje [ B Niekoľko prípadov sa hodnotilo osem pacientov (obr 4 a S1 tabuľka). Všetky prípady v každom pacientovi ukázal rovnaké výsledky na jedla a digitálne PCR s výnimkou pacientov-24 (PT-24); jeden z piatich prípadoch ( ) bola pozitívna a dve ( a ) boli negatívne na oboch meraní. Dva prípady negatívne na jedlá boli pridelené pozitívne (!) a nejednoznačné ( ) v oblastiach TC grafe (pozri tabuľku 3 a S1 tabuľka). V celkom 22 prípadov HER2 IHC mal skóre 2+ (tabuľka 4), obsahujúce tri pozitívne, negatívne, 15 a štyri sporných prípadov, na základe diagramu TC digitálneho PCR. Pozitívne a negatívne výsledky boli úplne zhodné s tými HER2 intratumorální HER2 heterogenita bola vyhodnotená pomocou kombinácie HER2-IHC /-DISH a digitálne PCR (obr 5, obr S1 a S2 tabuľka). Case_1, 2, 4 a ukázal výrazný intratumorální heterogénnosť, ktorých súčasťou sú HER2-IHC-pozitívnych a negatívnych lézií v klastri, zatiaľ čo Case_3 všeobecne vykazovali neurčitý HER2-IHC expresné vzor. Dôležité je, že HER2-pozitívne lézie boli prístupné z lumen žalúdka Case_1 (-2,až 3), Case_2 (-1,-2), a Case_4 (-4). Všetky HER2-IHC /-DISH pozitívne prípady boli vynesené v pozitívnom oblasti. Tri vzorky Case_3 (-1, -2 a -3), ktorá ukazuje HER2-IHC (nejasné) a HER2 Diskusia Táto štúdia je prvou, ktorá pokus o kategorizácii karcinómov žalúdka do HER2 digitálne metóda PCR bola použitá pre vyhodnotenie počtu kópií vírusu [28], fetálny chromozomálne aneuploidie [29], a onkogény v rôznych rakovinové tkanivá [30, 31]. Veľkým problémom, ktorý treba prekonať, je korekcia prvotných dát podľa obsahu nádoru vzoriek; rakovina žalúdka tkaniva zvyčajne obsahujú väčšie množstvo non-rakovinové bunky infiltrácie, napr. intersticiálna alebo zápalových buniek. V tejto štúdii sme použili analýzu obrazu pre získanie odhadu poloautomatický obsahu nádorových buniek a rozvinutý graf TC klasifikovať dát do troch kategórií-tj. Zosilené, non-amplifikovanej a nejednoznačné. To by mohlo byť možné čistiť rakovinové bunky od FFPE tkanivových rezoch podľa mikrodisekcii, ale to je príliš prácny pre bežnú klinickú prax, a to aj v prípade, že je presnejší teoreticky. Použitie tohto prístupu k biopsiou, počet HER2-IHC-nejasných prípadov (2+) bola znížená z 22 na šesť, čím potrebu potvrdenie HER2 Existujú ďalšie výhody digitálnej PCR protokolu. Po prvé, je to jednoduché v porovnaní s ISH, ktorý vyžaduje zručnosť a je náročné na pracovnú silu, zahŕňajúce viac krokov. Po druhé, je potrebné menej prípadov na overenie, ako sú potrebné pre HER2
amplifikácia génu je nevyhnutnou súčasťou terapeutické rozhodovanie pre pokročilých alebo metastatický rakovina žalúdka. Jednoduchý spôsob, ktorý je použiteľný pre malé formalínom fixovaných vzoriek, parafínových biopsia je žiaduce ako doplnok alebo ako náhrada za súčasnej dobe používaný HER2 imunohistochémia a in situ hybridizácia protokolov. V tejto štúdii sme vyvinuli Microfluidics založený na digitálny spôsob PCR pre stanovenie HER2 stroje a chromozómu 17 centromér (CEP17) kopírovať čísla a odhad pomeru obsahu tumor (TCR). pomer HER2
/CEP17 je určená tromi premennými-TCR a absolútnych číslach kópiu HER2 stroje a CEP17-skúmaním nádorových buniek; iba pomer posledných dvoch môže byť získaný PCR za použitia digitálneho celú vzorku bez čistenia nádorových buniek. TCR bola stanovená pomocou polo-automatickej analýzy obrazu. Vyvinuli sme nádoru obsahu graf, čo je rovina pravouhlých súradníc sa skladá z dát HER2
/CEP17 digitálne PCR a TCR, ktoré vymedzuje amplifikovanej, non-zosilnený, a nejednoznačné oblasti. Za použitia tejto metódy, 44 klinických vzoriek žalúdočnej biopsie rakoviny boli klasifikované ako amplifikovanej (n = 13), non-zosilnený (n = 25), alebo nejednoznačné (n = 6). Pre porovnanie, 11 vzoriek bolo pozitívnych, 11 boli negatívne, a 22 boli podmienečne imunohistochémia. Preto naša nová metóda znížila počet nejednoznačných vzoriek z 22 na 6, čím odstraňuje potrebu potvrdenie fluorescencie alebo duálny sondou in situ hybridizácia < 30% prípadov. Tumor obsah chart-assisted digitálna analýza PCR je tiež použiteľný na viacerých miestach v chirurgicky resekciu tkanív. Tieto výsledky naznačujú, že táto analýza je užitočnou alternatívou k HER2 imunohistochémia v karcinómov žalúdka, ktorý môže slúžiť ako základ pre automatizované vyhodnotenie HER2
stave
Digitálna PCR analýza rakovina žalúdka vzorky z biopsie. PLoS ONE 11 (4): e0154430. doi: 10,1371 /journal.pone.0154430
amplifikácie génu, ktorá bola popísaná v niekoľkých typov zhubného nádoru [5], vrátane rakoviny prsníka [6, 7], slinné žľazy adenokarcinóm [8], močového rakoviny močového mechúra [9] a rakovina žalúdka [10]. karcinómov žalúdka HER2-nadexprimující tvorí 8% -31% všetkých prípadov [11-15]. V trastuzumabu k pokusným rakovina žalúdka, trastuzumabom (Roche Diagnostics, Bazilej, Švajčiarsko) -a humanizovanej anti-HER2 monoklonálne protilátky zvýšenú mieru prežitia u pacientov s nádormi žalúdka HER2-pozitívne keď sú podávané v kombinácii s chemoterapiou [16], a to tiež schválený na liečbu rakoviny prsníka [17, 18]. Vyhodnocovanie stavu HER2 je preto dôležitým hľadiskom žalúdka liečbu rakoviny.
dual-sonda ISH ( HER2
-DISH), HER2 stroje a chromozómu 17 Centromera (CEP17) kopírovať čísla môžu byť detekované ako signály pod svetelným mikroskop v celom regióne vzorke. Avšak, aj keď táto metóda má vyššiu citlivosť, je to nákladné a pomerne časovo náročné
/CEP17 pomer počtu kópií. V digitálnom PCR, DNA templát je rozdelený do 770 kusov v nanoliter reakčných komorách, s očakávanou koncentráciu 0-1 molekuly na jednu komoru. Dual-farebné cieľové a referenčné gény sú súčasne amplifikovanej PCR a ich počty kópií sú vypočítané spočítaním komôr s pozitívnymi signálmi. Tento veľmi robustný metóda umožnila porovnanie HER2 stroje a počty kópií CEP17 za použitia rôznych primérov. Cieľom tejto štúdie bolo potvrdiť uskutočniteľnosť digitálne technológie PCR pre analýzu vzoriek žalúdočnej biopsia rakoviny. Avšak, jeden problém tohto prístupu je, že tkanivo zvyčajne obsahuje non-rakovinové bunky strómy, ktoré interferujú s molekulárnej analýzy. Na prekonanie tohto problému, sme vyvinuli dvojrozmerný bodový graf označuje ako je tumor obsah (TC), graf, ktorý rozdeľuje dáta do zosilnený, non-zosilnený a nejasných kategórie. Cieľom bolo vyvinúť automatizované prostriedky pre vyhodnocovanie HER2
status, s TC graf asistovanej HER2
/CEP17 digital PCR analýza slúži ako prvý krok.
Materiály a metódy
klinických vzoriek žalúdočnej biopsia Rakovina a chirurgické vzorky
-DISH.
DISH farbenie a vyhodnotenie
-DISH bola vykonaná na FFPE tkaniva pomocou sady DISH HER2 DNA (Roche Diagnostics) podľa inštrukcií výrobcu, a vzorky boli hodnotené pomocou svetelnej mikroskopie. HER2
signály sa objavil ako čierne bodky alebo zoskupení, a CEP17 signály sa objavil ako červené bodky. Dvadsať non-prekrývajúce sa jadrá s rakovinou boli hodnotené na HER2 stroje a CEP17 signály a amplifikácie génu HER2
bol klasifikovaný podľa odporúčania smerov ASCO /CAP [19]; pozitívne, [ HER
2 /CEP17 pomer ≥ 2,0] a /alebo [priemer HER
2 kópie číslo ≥ 6,0 signály /bunku]; jednoznačná [ HER
2 /CEP17 pomer < 2.0] a [priemer HER
2 počtom kópií ≥ 4,0 a < 6.0 Signály /článok]; záporná, [ HER
2 /CEP17 pomer < 2.0] a [priemer HER
2 počtom kópií < 4.0 Signály /článok].
Príprava DNA z klinického materiálu FFPE
-DISH. Obsah nádoru bola potvrdená pred a po krájaní sfarbením susedných sklíčka s HE. Vzhľadom k tomu, jeden parafín blok zvyčajne obsahuje niekoľko kusov vzorky biopsie, jednotlivé vzorky boli izolované pomocou sklenenej frézu. Ak chcete extrahovať DNA z chirurgickej resekcii vzoriek, 5 Sériové rezy z každej reprezentatívneho tkanivového bloku boli narezané na hrúbku 10 um, ktoré boli uvedené na liste vyrobené z polytetrafluóretylénu (PTFE, Sanplatec, Osaka, Japonsko). Membrána je chemická odolnosť na báze xylénu Deparafinizace, a je ľahko rezať na kusy. V tejto štúdii boli rôzne časti pod z listov podľa HER2 profilu. Sklo alebo PTFE kusy boli zostavené do 2,0 ml skúmavky a DNA bola extrahovaná s použitím QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA).
HER2
vyhodnotenie počtu kópií digitálne PCR
/CEP17 počet kópií pomer bol vypočítaný [27].
Vyhodnotenie pomeru obsahu nádoru (TCR)
-DISH hodnotenia.
Postupné zmiešaní s LCL.
-DISH a digitálne PCR v H522 a SK-BR-3 buniek a LCL. Rozdiely boli považované za významné, ak p Hotel < 0,05
/CEP17 bola stanovená na základe troch premenných :. TCR a čísla absolútna kópiu HER2 stroje a CEP17. Iba relatívna pomery dvoch posledne menovaných možno získať digitálny PCR za použitia nádorových vzorky bez izolácie jednotlivých buniek. HER2
/CEP17 pomer získanej digitálnej PCR [ r
] bol vyjadrený nasledujúcim spôsobom, založený na predpoklade, že počtu kópií génu v rakovinových bunkách sú homogénne a že non-rakovinové bunky sú geneticky stabilný chromozómov (Obr 1A a 1B) :( 1), kde [ r
] je pomer HER2
na CEP17 získané digitálne PCR (0 °; r
); [ x
] Je TCR (0 ≤ x
≤ 1); [ A
] je CEP17 počet kópií v jednej nádorové bunky (0 ≤ A
); a [ B
] je HER2
počet kópií v jednej nádorové bunky (0 ≤ B
). Ďalej je dvojrozmerný Scatterplot zastúpená rovnice (1) je označovaný ako TC grafu.
] bola stanovená z He-postriekané vzoriek s použitím obraz softvér pre analýzu, ako je tkanivové Studio softvérom obrazovej analýzy pre biopsie a hybridné Cell Count softvér pre chirurgických vzoriek, v uvedenom poradí; a [ r
] a [ x
] boli stanovené z meraní.
] a [ x
] ako vertikálne aj horizontálne osi, respektíve (obr 1B). Pomer [ B
/ A
] bola referenčná hodnota pre stanovenie HER2
amplifikáciu génu. V skutočnosti skutočný počet kópií CEP17 [ A
] a HER2
[ B
] nebolo možné určiť bez vykonania HER2
-DISH. Avšak praktické hodnotenie HER2 stroje a CEP17 kopírovať čísla od misky zistené, že [ A
] v rozmedzí od 2,0 do 6,0 (medzi 40 a 117 CEP17 signálov medzi 20 rakovinových buniek v S1 a S2 tabuľky) a nikdy neprekročila 8,0 v klinických vzorkách s karcinómom žalúdka. Podľa našich skúseností 164 po sebe idúcich prípadov rakoviny žalúdka (Ushiku T et al.
Nepublikovaná dáta), CEP17 počtu kópií je 1,0 až 5,7, medián 2,5 a monosomie, definovaný ako [ A
< 1,5], je pomerne vzácny len v dvoch prípadoch (1,2%). To znamená, že rozsah [ A
] bola stanovená [2 ≤ A
≤ 8] s bezpečnostnou rezervou.
zosilnenie negatívny pri označení [ B
/ a Hotel < 2] alebo [ B Hotel < 2 A
]. [ Bx
+ 2 (1 - x
)] bol potom vyjadriť takto: (2)
+ 2 (1 - x
)] :( 3)
/ a Hotel < 2]. Na pravej strane člen rovnice (5) ukázal monotónna nárast v závislosti na premennej [ A
] (2 ≤ A
≤ 8); inkorporácie [ A
= 2], ktorý bol minimálna hodnota [ A
], do rovnice (5) sa získa nasledovné: (6)
amplifikácie negatívny stav [ B
/ a Hotel < 2] bolo platí pre akúkoľvek hodnotu [ A
] (2 ≤ A
≤ 8).
zosilnenie pozitívnych bolo [ B
/ a
≥ 2] alebo [ B
≥2 a
]. V tomto prípade, [ Bx
+ 2 (1 - x
)] sa vyjadriť takto: (7)
/ a
≥ 2]; pravá strana člen rovnice uvedenej monotónna nárast. Včlenenie [ A
= 8], ktorá bola maximálna hodnota [ A
], do rovnice (8) sa získa nasledovné: (9)
zosilnenie pozitívnych podmienka [ B
/ A
≥ 2] platilo pre akúkoľvek hodnotu [ A
] (2 ≤ a
≤ 8).
(7 x
+ 1) /(3 x
+ 1)] ( A
= 8) bol určený ako pozitívne oblasti, a plocha pod priamkou [ r
= x
+ 1] ( a
= 2) bola negatívna priestor. Táto oblasť je ohraničená hranicou [ r
= x
+ 1] a [ r
= (7 x
+ 1) /(3 x
+ 1)] bol neurčitý zóna v závislosti na hodnote [ a
], ktorý bol určený ako nepresvedčivé oblasti a definovaný takto (obr 1B) :( 10)
] 0 (neobsahujúce žiadne rakovinové bunky), všetky čiary konvergovanej na súradniciach (0,1) na základe predpokladu, že non-rakovinové bunky sú genomically stabilné. Ak je [ x
] bol 1,0 (pozostávať zo len nádorových buniek), čiary prešiel súradnicami (1,2) nezávisle na hodnotách [ A
] a [ ].
-DISH v kultivovaných bunkách
] a [ B
] získaný HER2
-DISH v bunkových líniách, alebo pomocou vypočítaná [ B '
] z [ a
] a meria [ r
].
a CEP17 ( HER2
/CEP17) v LCL a H522 a SK-BR-3cells boli hodnotené HER2
-DISH pomocou mobilného bloky FFPE a digitálnym PCR (tabuľka 2). HER2
signály sa objavil ako diskrétne bodky v jadrách podľa HER2
-DISH (obr 2A a 2B); HER2
počet kópií v jednotlivých bunkách bola takmer dva v LCL a štyri v H522 bunkách. Na rozdiel od SK-BR-3 bunky vykazovali zoskupený HER2
signály, ktoré boli ťažké rozlíšiť samostatne (obr 2c); ich počty boli ľubovoľne nastaviť do maximálnych hodnôt 7, 14, a 21 v súlade s veľkosťou klastra. Tak, nižšiu pomer HER2
/CEP17 bol získaný HER2
-DISH než digitálny PCR.
[ B
] a CEP17 [ A
] kopírovať čísla boli vypočítané z HER2
-DISH takto: [ a
= 41/20 = 2,05] a [ B
= 85/20 = 4,25]. Keď sú hodnoty [ A
] a [ B
] boli aplikované do rovnice (1), tieto údaje mohli byť opísaný ako referenčné líniu [ r
= ( 4,25 x
+ 2 (1 - x
)) /(2,05 x
+ 2 (1 - x
))] (obr 2D ). V prípade buniek SK-BR-3, CEP17 počtom kópií [ A
] bol [ A
= 83/20 = 4,15]; Avšak, ako bolo popísané vyššie, HER2
signály boli zoskupené, ktorý znížil odhadovaný počet kópií. Z tohto dôvodu použitie [ A
= 4,15], [ r
= 5,69] a [ x
= 1,0] do rovnice (1), ktorých odhadovaná HER2
počtu kópií [ B '
] sa predpokladá, že [ B'
= 5,69 x 4,15 = 23,61]. Z tohto dôvodu [ A
= 4,15] a [ B '
= 23,61] whilethe referenčné čiara bola [ r
= (23,61 x
+ 2 (1 - x
)) /(4,15 x
+ 2 (1 - x
))] (obr 2E). Zakreslené digitálnych dát PCR z buniek-BR-3 SK zmiešané s LCL zodpovedalo tejto línii, skôr než [ r
= (19,50 x
+ 2 (1 - x
)) /(4,15 x
+ 2 (1 - x
))], ktorý bol založený na HER2
-DISH údaje, pri ktorých [ B
= 19,50]. Tieto výsledky ukazujú na platnosť TC-grafu teda, že má dostatočnú quantitativity digitálnej PCR rozlíšiť HER2-zosilnený od non-zosilnený buniek
stav každej vzorky bola stanovená HER2 IHC a -DISH (obr 3A-3C). Odhadované hodnoty boli v súlade s manuálnymi počty vyrobených patológom (km). TC rýchlosť bola stanovená z obrázkov rozlišovaním jadra rakovinových od tých non-rakovinových buniek (obr 3D).
-DISH-pozitívne (červená), -equivocal (fialová) a -negativní (modrá), rovnako ako HER2-IHC-pozitívne (rhombi), -equivocal (trojuholníky), a -negativní ( krížové značky) vzorky. Klinicko informácie o reprezentatívnych a celkového počtu prípadov je uvedené v tabuľke 3 a tabuľke S1, resp. Neboli zistené žiadne HER2
-DISH-pozitívnych prípadov pod hranicou [ r
= x
+ 1]; Avšak, jeden HER2
-DISH-negatívne ( ), dve nejednoznačné (a), a tri pozitívne (,)a,) boli pozorované prípady v oblasti nepresvedčivé , Okrem toho, že bol jeden HER2
-DISH negatívny prípad kladnej oblasti (!). Tri prípady (,a*) ukázala výrazne vysoké hodnoty digitálnych PCR (28.25, 19.99 a 24.00, v uvedenom poradí). V ponuke HER2
-DISH, tieto prípady vykazovali zoskupený HER2
signály (obr 3c), ktoré boli ťažké kvantifikovať, ako v SK-BR-3 bunkách. Rovnica (1) bol tiež vyjadriť takto: (11)
/ A
] bola vypočítaná aplikácií meria [ r
] a [ x
] a meria [ a
], ktorá bola stanovená z počtov CEP17 signálov získaných HER2
-DISH 20 rakovinových buniek (tabuľka č 3 a S1 tabuľka). [ B '
] bola tiež získaná meraním [ r
] a [ A
] a [ x
= 1], ako je popísané pre SK-BR-3 bunky.
-DISH. Zo štyroch nejasných prípadoch s IHC skóre 2+, jeden (), bola pozitívna a ostatné (, a)) boli negatívne, ako je určené HER2
-DISH. Odhadovaná [ B
/ A
] hodnota sa preto ≥ 2,0 v prípade,a < 2.0 v druhom tri, s výnimkou prípadu), ktorých odhadovaná [ B
/ A
], z ktorých bolo 2,12.
Vyhodnotenie intratumorální HER2 heterogenity v chirurgických vzoriek
-DISH (pozitívne) boli vynesené v nepresvedčivé oblasti. Vzorka-2 bola vynesená v nepresvedčivé oblasti, pretože región-2 pokrytá pomerne veľkú plochu obsahujúcu ako HER2-pozitívnych a negatívnych komponenty. Vzorka-2 ukázala rozpory medzi HER2-IHC (pozitívne) a HER2
-DISH (negatívne) (S2 Table), s digitálnym výsledky PCR zodpovedajúce HER2
-DISH.
amplifikácie negatívne, -equivocal a -pozitívne prípady pomocou dvojrozmerný bodový plot alebo TC graf, na základe nameraných hodnôt HER2
/pomer CEP17 získa digitálny PCR [ r
] a TCR [ x
] bez konvenčné HER2
-DISH alebo HER2-IHC informácie. Tak, analýza TC graf je nezávislý na CEP17 a HER2
kopírovať čísla ([ A
] a [ B
]) v jednej nádorové bunky, ktoré môžu zvyčajne získať HER2
-DISH.
-DISH by mohli byť odstránené na menej ako 30% prípadov. Frekvencia HER2
zosilnenie sa mení cez žalúdočnú rakovinou histologických typov, z 20% -30% v črevnej aby < 10% v difúzneho typu [32]. Preto je potrebná efektívna metóda skríningu v bežnej klinickej praxi, a to najmä v krajinách s vysokou prevalenciou rakoviny žalúdka. TC graf môže byť tiež použitý s inou metódou PCR na báze, ako je kvantitatívne PCR za HER2
amplifikácie [33].