PLoS ONE: Tumor Inhalt Diagramm-Assisted HER2 /CEP17 Digitale PCR-Analyse von Magenkrebs Biopsien

Abstrakt

Auswertung HER2
Genamplifikation ist ein wesentlicher Bestandteil der therapeutischen Entscheidungsfindung für fortgeschrittenem oder metastasiertem Magenkrebs. Eine einfache Methode, die kleine, in Formalin fixierten, in Paraffin eingebetteten Biopsieproben anwendbar ist, ist wünschenswert, als Ergänzung zu oder als Ersatz für die derzeit verwendeten HER2 Immunhistochemie und in situ Hybridisierungsprotokolle. In dieser Studie haben wir ein Mikrofluidik-basierten digitalen PCR-Verfahren zur Bestimmung HER2 Karten und Chromosom 17 Zentromer (CEP17) Kopienzahlen und Abschätzen Tumorgehaltsverhältnis (TCR). Die HER2
/CEP17 Verhältnis wird durch drei Variablen-TCR und absolute Kopienzahlen von HER2
und CEP17-durch die Untersuchung von Tumorzellen bestimmt wird; nur das Verhältnis der beiden letzteren können ohne Reinigung Tumorzellen durch digitale PCR unter Verwendung der gesamten Probe erhalten werden. TCR wurde durch halbautomatische Bildanalyse bestimmt. Wir entwickelten ein Tumor Inhalt Grafik, die eine Ebene der rechtwinkligen Koordinaten ist, die aus HER2
/CEP17 digitale PCR-Daten und TCR, die, nicht-verstärkten abgrenzt verstärkt und zweideutig Bereichen. Durch die Anwendung dieser Methode, 44 klinischen Proben von Magenkrebs Biopsie wurden als verstärkte klassifiziert (n = 13), nicht-amplifizierte (n = 25) oder mehrdeutig (n = 6). Zum Vergleich: 11 Proben waren positiv, 11 negativ waren, und 22 waren zweideutig Immunhistochemie. Somit reduziert unser neues Verfahren um die Anzahl der zweideutigen Proben 22-6, wodurch die Notwendigkeit zur Bestätigung durch Fluoreszenz oder Dual-Sonde in situ Hybridisierung auf < 30% der Fälle. Tumor Inhalt Grafik-unterstützte digitale PCR-Analyse ist auch auf mehrere Standorte in chirurgisch entfernten Gewebe. Diese Ergebnisse zeigen, dass diese Analyse ist eine sinnvolle Alternative zu HER2 Immunhistochemie in Magenkrebs, der als Grundlage für die automatisierte Auswertung von HER2
Status dienen kann

Citation. Matsusaka K, Ishikawa S, Nakayama A, Ushiku T, Nishimoto A, Urabe M, et al. (2016) Tumor Inhalt Diagramm-Assisted HER2 /
CEP17 Digitale PCR-Analyse von Magenkrebs Biopsien. PLoS ONE 11 (4): e0154430. doi: 10.1371 /journal.pone.0154430

Editor: Yves St-Pierre, INRS, KANADA

Empfangen: 7. November 2015; Akzeptiert: 13. April 2016; Veröffentlicht: 27. April 2016

Copyright: © 2016 Matsusaka et al. Dies ist ein offener Zugang Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

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Finanzierung:. Diese Arbeit als Teil des BioBank Japan-Projekt durchgeführt wurde (http://www.src.riken.jp/english/project/person/), die durch das Ministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie (http://www.mext.go.jp/english/), Japan Agentur für medizinische Forschung und Entwicklung (http unterstützt wurde: //www.amed.go .jp /de /) und Grants-in-Aid for Scientific Research (KAKENHI) von der japanischen Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften (https://www.jsps.go.jp/english/e-grants/). Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Magenkrebs ist eine der häufigsten bösartigen Tumoren und die dritthäufigste Ursache der durch Krebs verursachten Tod in der ganzen Welt [1]. Erweiterte Fälle ohne operativen Eingriff haben eine schlechte Prognose und erfordern multidisziplinäre Behandlungsansätze. HER2 ist ein 185 kDa-Transmembran-Glykoprotein, das ein Mitglied des epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptorfamilie und fungiert als Tyrosinkinase-Rezeptor ist [2, 3]. In normalen Zellen HER2-Protein wirkt als Signalgeber während der Zellproliferation oder Differenzierung [4]; jedoch hat es onkogenen Eigenschaften, wenn sie überexprimiert. Dies ist in der Regel verursacht durch HER2
Gen-Amplifikation, die in mehreren Arten von bösartigen Tumor berichtet wurde [5] einschließlich Brustkrebs [6, 7], Speicheldrüse Adenokarzinom [8], Harnblasenkrebs [9] und Magenkrebs [10]. HER2-überexprimierenden Konto Magenkrebs 8% -31% aller Fälle [11-15]. Im Trastuzumab für Magenkrebs-Studie, Trastuzumab (Roche Diagnostics, Basel, Schweiz) -a humanisierten anti-HER2 monoklonalen die Überlebensrate von Patienten mit HER2-positivem Magenkrebs-Antikörper-erhöht, wenn sie in Kombination mit einer Chemotherapie [16], verabreicht und war auch für die Behandlung von Brustkrebs zugelassen [17, 18]. HER2-Status Auswertung ist daher ein wesentlicher Aspekt der Magenkrebstherapie.

Für Patienten mit inoperablem Magenkrebs, sollte HER2-Status eine kleine Biopsie untersucht werden. Wie in den jüngsten Empfehlungen zur Behandlung von HER2-Tests bei Brustkrebs von der American Society of Clinical Oncology (ASCO) /College of American Pathologists vertreten (CAP), Immunhistochemie (IHC) und /oder in-situ-Hybridisierung (ISH) sind die Standardverfahren zur Bewertung von HER2 status [19], aber jeder hat seine Grenzen. Zum Beispiel wird die Wirksamkeit von HER2-IHC von mehreren Faktoren wie der Formalinfixierung Prozess beeinflusst, und das Bewertungssystem ist nicht immer reproduzierbar insbesondere in zweideutigen Fällen, für die ISH empfohlen [19-25]. In hellen Feld HER2
Dual-Sonde ISH ( HER2
-DISH), HER2
und Chromosom 17 Zentromer (CEP17) Kopienzahlen als Signale unter einem Licht detektiert werden kann Mikroskop über den gesamten Bereich der Probe. Obwohl jedoch dieses Verfahren überlegene Empfindlichkeit hat, ist es kostspielig und relativ zeitaufwendig

In dieser Studie haben wir die Mikrofluidik-basierten digitalen PCR-Technologie angewendet. (BioMark; Fluidigms, Cambridge, UK) [26], um zu bestimmen HER2
/CEP17 Kopienzahl-Verhältnis. In der digitalen PCR wird Templat-DNA unterteilt in 770 Stück in der Nano- Reaktionskammern, mit einer erwarteten Konzentration von 0-1 Molekül pro Kammer. Zweifarbig Ziel und Referenzgene gleichzeitig PCR-amplifiziert und ihre Kopienzahlen werden berechnet, indem die Kammern mit positiven Signalen zu zählen. Diese sehr robuste Methode ermöglicht den Vergleich von HER2
und CEP17 Kopienzahlen verschiedener Primer-Sets verwenden. Das Ziel dieser Studie war es, die Machbarkeit der digitalen PCR-Technologie zur Analyse von Magenkrebs Biopsieproben zu bestätigen. Jedoch besteht ein Problem bei diesem Ansatz, dass das Gewebe enthält gewöhnlich nicht kanzerösen Stromazellen, die mit molekularen Analysen stören. Um dieses Problem zu überwinden, entwickelten wir zweidimensionale Streudiagramm bezeichnet als der Tumor Inhalt (TC) Diagramm, das Daten in verstärkt, nicht verstärkt und zweideutig Kategorien zuordnet. Das Ziel war es, eine automatisierte Mittel zur Bewertung HER2
Status, mit TC-Chart-unterstützte HER2
/CEP17 digitale PCR-Analyse dient als erster Schritt zu entwickeln.

Werkstoffe und Methoden

Ethik Statement

Diese Studie wurde von der University of Tokyo Institutional Ethikkommission genehmigt wurde. Klinische Proben mit schriftlicher Einwilligung wurden für die Studie von menschlichen Geweben unter der University of Tokyo Institutional Richtlinien gesammelt.

Klinische Magenkrebs Biopsie-Proben und chirurgischen Proben

Insgesamt 44 Magenkrebs Biopsien von 32 Patienten durch Routine Formalin-fixierten und in Paraffin eingebetteten (FFPE) verarbeitet wurden für die Analyse zur Verfügung. Alle Biopsien wurden endoskopisch in der Abteilung für Endoskopie und Endoskopische Chirurgie erhalten. Vier chirurgischen Proben, die operativ reseziert wurden an der Abteilung für Magen-Darm-Chirurgie, wurden ebenfalls analysiert. Diese Proben wurden in 10% neutralem gepuffertem Formalin fixiert. Alle Fälle wurden am Institut für Pathologie der Universität Tokyo Krankenhaus diagnostiziert. Die Schnitte wurden mit einer Dicke von 4 &mgr; m geschnitten durch herkömmliche histologische Techniken; diese wurden auf Glasobjektträger gesammelt und für Hämatoxylin-Eosin (HE) Färbung, HER2-IHC verwendet, und HER2
-DISH.

Immunhistochemie

Die immunhistochemische Färbung wurde durchgeführt, auf FFPE Gewebe mit dem 4D5-Antikörper anti-HER2 unter Verwendung von Ventana BenchMark XT (Roche Diagnostics). Färbeintensität und Membran Immunreaktivität Muster wurden mit dem Dako-Scoring-System bewertet nach ASCO /CAP-Richtlinien [19]. Keine Membranfärbung wurde als 0 erzielt; schwache oder kaum wahrnehmbar /unvollständig Membranfärbung wurde als 1+ erzielt; unvollständig und /oder schwach /mittel Färbung Umfangs Membran erzielt als 2+ wurde; und vollständig und intensiv Umfangsmembranfärbung wurde als 3+ erzielt.

HER2-
DISH-Färbung und Auswertung

HER2
-DISH wurde am FFPE ausgeführt Gewebe durch die HER2 DNA DISH-Kit (Roche Diagnostics) gemß den Anweisungen des Herstellers, und Proben wurden durch Lichtmikroskopie untersucht. HER2
Signale erschien als schwarze Punkte oder Cluster, und CEP17 Signale erschienen als rote Punkte. Zwanzig nicht überlappende Krebs Kerne wurden erzielt für HER2
und CEP17 Signale und HER2
Genamplifikation klassifiziert wurde, wie durch die ASCO /CAP-Richtlinien empfohlen werden [19]; positiv, [ HER
2 /CEP17 Verhältnis ≥ 2,0] und /oder [Durchschnitt HER
2 Kopienzahl ≥ 6.0 Signale /Zelle]; zweideutig, [ HER
2 /CEP17 Verhältnis < 2.0] und [Durchschnitt HER
2 Kopienzahl ≥ 4,0 und < 6.0 Signale /Zelle]; negativ, [ HER
2 /CEP17 Verhältnis < 2.0] und [Durchschnitt HER
2 Kopienzahl < 4.0 Signale /Zelle].

Herstellung von DNA aus FFPE klinischem Material

Um DNA aus Biopsieproben, 10 Serienschnitte schneiden bei einer Dicke von 10 &mgr; m wurden auf einer Glasoberfläche gelegt für HER2 extrahieren -IHC und HER2
-DISH. Tumor-Gehalt wurde bestätigt, vor und nach dem Schneiden durch die benachbarten Folien mit HE-Färbung. Da ein einzelner in der Regel Paraffinblock mehrere Stücke von Biopsieprobe enthält, einzelne Exemplare wurden mit einem Glasschneider isoliert. An DNA von chirurgischen reseziert Proben, 5 Serienschnitte von jedem repräsentativen Gewebeblock extrahiert wurden bei einer Dicke von 10 &mgr; m geschnitten, die auf einem Blatt platziert wurden aus Polytetrafluorethylen (PTFE, Sanplatec, Osaka, Japan). Die Membran ist für die chemische Beständigkeit Xylol Basis Entparaffinierung, und ist leicht in Stücke geschnitten. In der Studie wurden verschiedene Teile aus den Blättern nach HER2 Profil Clip aus. Glas oder PTFE Stücke wurden in einem 2,0-ml-Röhrchen zusammengesetzt, und die DNA wurde unter Verwendung des QIAamp DNA FFPE Tissue Kit extrahiert (Qiagen, Valencia, CA, USA).

HER2
Kopienzahl Bewertung durch digitale PCR

Primer-Sets zum Verstärken von HER2
und CEP17 sind in Tabelle 1 gezeigt Jeder Primer wurde so ausgelegt, dass die PCR-Produkte erhalten ausreichend kurz waren (59 und 65 bp) zu beseitigen, die Einfluss der DNA-Fragmentierung in der FFPE Prozess. Digital-PCR wurde mit einer 48,770 Digital-Array-Integrated Fluidic Circuit (Fluidigm) unter Verwendung eines EP1 System durchgeführt. Jeder Chip enthält 48 Platten, die weiter unterteilt wurden in 770 Reaktionskammern. Die Anzahl der positiven Fluoreszenzsignale in jeder Platte verwendet wurde, unterschiedliche DNA-Sequenzen zu quantifizieren. Das Protokoll wurde an anderer Stelle [26] beschrieben. Kurz gesagt, wurden 4 ul-Reaktionsgemische für jeden Test vorbereitet, die mit 1 × TaqMan Genexpression Master-Mix enthalten ist, 1 × HER2-FAM und chr17cent-VIC TaqMan-Sonden und 1 × Probenbeladung Reagenz (Fluidigm). Das Reaktionsgemisch wurde gleichmßig in die Reaktionskammern 770 verteilt, und das digitale Array wurde auf einem System-EP1 FC1 cycler thermo getaktet. Die zwei Zielregionen wurden unabhängig voneinander verstärkt und 6-Carboxyfluorescein und VIC Farbstoffsignale in den Kammern wurden am Ende jedes PCR-Zyklus aufgezeichnet. Die Anzahl der 6-Carboxyfluorescein-positiv (HER2) und VIC-positive (CEP17) Kammern in jeder Platte wurde gezählt und HER2
/CEP17 Kopienzahl-Verhältnis berechnet wurde [27].

Evaluation von Tumorgehaltsverhältnis (TCR)

Ganze Dia Bild von HE Abschnitte, die denen kurz vor der Serienschnitte für die DNA-Extraktion wurde unter Verwendung Nanozoomer (Hamamatsu Photonics, Hamamatsu, Japan) gescannt. Die Daten wurden importiert in Definiens Tissue Studio 2.0 (http://www.tissuestudio.com) zur Bestimmung des TCR. Der ausgewählte Bereich der chirurgischen Proben wurde unter Verwendung eines BZ-710-Mikroskop (Keyence, Osaka, Japan) gescannt. Die Daten wurden importiert in Hybrid Cell Count Software (BZ-H3C, Keyence). Daten, die die Anzahl der Zellen in importierten Bildern und aufstrebenden Krebs von nicht kanzerösen Zellen auf Basis von Kern Größe detailliert wurden automatisch generiert

Die Experimente für die Entwicklung der TC-Charts

Zelllinien.

Für Kontrollexperimente, H522 Lungenkrebs und SK-BR-3-Brustkrebszelllinien wurden von der American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) erhalten. GM18997 Epstein-Barr-Virus-transformierten lymphoblastoiden Zelllinie (LCL) wurde von Coriell Biobanken erhalten (https://catalog.coriell.org/). H522-Zellen und der LCL wurden in Roswell Park Memorial Institute-1640-Medium (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan) mit 10% fötalem Rinderserum (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) und 1% Penicillin-Streptomycin-Lösung ( Nacalai Tesque). SK-BR-3-Zellen wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium /Hams F12 (Nacalai Tesque, Japan) mit 10% fötalem Rinderserum und 1% Penicillin /Streptomycin. Zellen wurden bei 37 ° C in einer Atmosphäre kultiviert, die 5% CO _{2. DNA wurde unter Verwendung eines QIAquick DNA Mini Kit (Qiagen) extrahiert. FFPE H522, SK-BR-3 und LCL Zellenblöcke wurden vorbereitet für HER2
-DISH Auswertung.}

Stepwise Vermischung mit LCL.

genomischer DNA aus H522 und SK -BR-3-Zellen und der LCL wurde auf eine Konzentration von 50 ng /&mgr; l eingestellt. H522 und LCL genomische DNA wurde in acht Schritten auf den folgenden Volumenverhältnissen gemischt: 8: 2, 7: 3, 6: 4, 5: 5, 4: 6, 3: 7, 2: 8 und 1: 9 (H522 : LCL). SK-BR-3 und LCL genomische DNA wurde in vier Schritten bei den folgenden Volumenverhältnissen gemischt: 8: 2, 6: 4, 4: 6 und 2: 8 (SK-BR-3: LCL).

Statistische Analysen

Chi-Quadrat-Tests angewandt wurden zum Vergleich zählt zwischen HER2
-DISH und digitale PCR in H522 und SK-BR-3-Zellen und LCL. Die Unterschiede wurden als signifikant angesehen, wenn p
< 0,05

Ergebnisse

• PLoS ONE: aberrante Expression von Cx43 ist im Zusammenhang mit der Peritoneal Metastasierung von Magenkrebs und Cx43-Mediated Gap Junction Verbessert Gastric Cancer Cell Diapedese von Peritoneal Meso…
• PLoS ONE: prognostische Bedeutung von Tag SNP rs1045411 in HMGB1 des aggressiven Magenkrebs in einem chinesischen Population