Ocena HER2 Citation:. Matsusaka K, Ishikawa S, Nakayama A Ushiku T Nishimoto A Urabe M, et al. (2016) Tumor Content Graf-Assisted HER2 / Urednik: Yves St-Pierre, INRS, Kanada Prejeto: 7. november 2015; Sprejeto: 13. april 2016; Objavljeno: 27. april 2016 Copyright: © 2016 Matsusaka et al. To je prost dostop članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo razpoložljivost podatkov. Vse ustrezne podatki so v papirju in njene dodatne informacije datotek Financiranje:. To delo je bila izvedena kot del BioBank japonskega projekta (http://www.src.riken.jp/english/project/person/), ki je bil podprt s strani Ministrstva za izobraževanje, kulturo, šport, znanost in tehnologijo (http://www.mext.go.jp/english/~~HEAD=pobj), Japonska agencija za medicinske raziskave in razvoj (http: //www.amed.go Jp /en /), in donacije v obliki pomoči za znanstvene raziskave (KAKENHI) iz Japonske društvo za promocijo znanosti (https://www.jsps.go.jp/english/e-grants/). Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi Uvod rak želodca je eden izmed najpogostejših malignih tumorjev in tretji vodilni vzrok smrti zaradi raka po vsem svetu [1]. Napredno primerih brez operativnega posega imajo slabo prognozo in zahtevalo multidisciplinarne pristope zdravljenja. HER2 je 185-kDa-transmembranski glikoprotein, ki je član epidermalni rastni družine receptorja faktorja in deluje kot tirozin kinaze receptorja [2, 3]. V normalnih celicah proteinu HER2 deluje kot pretvornik signala med celično proliferacijo ali diferenciacijo [4]; Vendar pa ima onkogenih lastnosti, kadar prekomerno. To se ponavadi posledica HER2 Pri bolnikih z neresektabilnimi želodca raka, bi bilo HER2 stanje je treba preučiti z majhno biopsijo vzorec. Kot je predstavljena v zadnjih priporočila za testiranje HER2 pri raku na dojki, ki ga American Society of Clinical Oncology (ASCO) /College ameriških patologov (SKP), imunohistokemijo (IHC) in /ali v situ hibridizacija (ISH), so standardne metode za ocenjevanje HER2 stanje [19], ampak vsak ima svoje omejitve. Na primer, je učinkovitost HER2-imunohistokemijo vpliva več dejavnikov, kot so formalinom postopek vezave, in sistem sedaj ni vedno ponovljiva zlasti v dvoumnih primerih, za katerega se priporoča ISH [19-25]. Na svetlem polju HER2 V tej raziskavi smo uporabili temelji Microfluidics digitalne tehnologije PCR. (Biomark; Fluidigm, Cambridge, Velika Britanija) [26] določiti HER2 etiko izjavo Ta študija je bila odobrena s etično institucionalni odbor Univerze v Tokiu. Klinični vzorci s pisnim privoljenjem so bili zbrani v skladu s smernicami Univerzi v Tokiu institucionalnih za preučevanje človeških tkiv. V celotni, 44 želodčni rak biopsije primerkov od 32 bolnikov z rutinskim-formalinom fiksni parafinskega vgrajeni (FFPE), ki se obdelujejo bili na voljo za analizo. Vsi vzorci biopsije so bili pridobljeni endoskopsko na Oddelku za endoskopijo in endoskopsko kirurgijo. Štiri kirurške osebki, ki so bili odstranjenimi kirurško na kirurgijo Oddelek prebavil, smo analizirali tudi. Ti osebki so bile določene v 10% nevtralnem zastalega formalinu. Vsi primeri so bili diagnosticirani na oddelku za patologijo Univerze v bolnišnici v Tokiu. Odseki smo razrezali na debelino 4 um z uporabo konvencionalnih tehnik histološke; ti so bili zbrani na steklenih ploščicah in se uporablja za hematoksilin-eozinom (HE) barvanja, HER2-IHC in HER2 Imunohistokemija Imunohistokemijsko je bila izvedena na FFPE tkiva z uporabo Ventana Benchmark XT (Roche Diagnostics) s protitelesom 4D5 anti-HER2. Barvanje intenzivnost in membrane radioinkorporacijo vzorci so bili ocenjeni s pomočjo točkovanja Dako v skladu s smernicami ASCO /SKP [19]. Ne obarvanje membrane je dosegel kot 0; šibek ali komaj je zaznavna /nepopolna obarvanje membrane dosegel kot 1+; nepopolne in /ali šibka /zmerno obodna obarvanje membrane je dosegel kot 2+; in v celoti in intenzivno je obodna obarvanje membrane dosegel kot 3+. HER2- HER2 Za ekstrakcijo DNK iz biopsijo vzorcev, 10 serijskih sekcije narežemo na debelino 10 um so bili dani na stekleni površini HER2 -IHC in HER2 Temelj sklopov za pomnoževanje HER2 Celotna slide podobo visokošolskih oddelkov, ki so bili tisti, tik pred serijsko oddelkov za ekstrakcijo DNK, smo posneli s pomočjo NanoZoomer (Hamamatsu fotonika, Hamamatsu, Japonska). Podatki so bili uvoženi v Definiens tkiv Studio 2.0 (http://www.tissuestudio.com) za določanje TCR. Izbrana regija kirurških vzorcev smo posneli z uporabo BZ-710 mikroskopom (KEYENCE, Osaka, Japonska). Podatki so bili uvoženi v Hybrid Cell grofa programske opreme (BZ-H3C, KEYENCE). Podatki, ki podrobno število celic v uvoženih slik in uglednih rakavi od ne-rakave celice na osnovi jedra velikosti so samodejno ustvarjeni preizkuse za razvoj TC grafikonih celičnih linijah. kontrolnih eksperimentih, H522 pljučnega raka in SK-BR-3 raka dojke celičnih linij smo dobili od American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). GM18997 Epstein-Barr virus, transformirana celična linija limfoblastoidni (LCL) dobimo Coriell Biorepository (https://catalog.coriell.org/). H522 celice in LCL smo kultivirali v Roswell Park Memorial Inštitut-1640 medij (Nacalai Tesque, Kyoto, Japonska), ki vsebuje 10% fetalni goveji serum (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ZDA) in 1% penicilin-streptomicinom raztopine ( Nacalai Tesque). SK-BR-3 celice smo gojili v Dulbeccovem Modified Eagle je srednje /Hams F12 (Nacalai Tesque, Japonska) z 10% fetalnega govejega seruma in 1% penicilin /streptomicin. Celice smo gojili pri 37 ° C v atmosferi, ki vsebuje 5% CO 2. DNK smo ekstrahirali z uporabo QIAquick DNA mini kit (Qiagen). FFPE H522, SK-BR-3, in LCL celic bloki so bili pripravljeni za HER2 genomske DNK iz H522 in SK -Br-3 celic in LCL smo naravnali na koncentracijo 50 ng /ul. H522 in LCL genomske DNA smo zmešali v osmih korakih v naslednjih razmerjih obsega: 8: 2, 7: 3, 6: 4, 5: 5, 4: 6, 3: 7, 2: 8 in 1: 9 (H522 : LCL). SK-BR-3 in LCL genomske DNA smo zmešali v štirih korakih v naslednjih razmerjih obsega: 8: 2, 6: 4, 4: 6 in 2: 8 (SK-BR-3: LCL). Statistične analize smo uporabili hi-kvadrat testi za primerjavo števila med HER2 Rezultati Razvoj TC grafikonu digitalnih podatkov PCR razmerje HER2 V tej študiji [ x enačbi (1) je grafično predstavljen kot TC grafikonu, s [ r Opredelili smo HER2 Obe strani enačbe (2), deljeno s [ Ax Kombinacija z enačbah (1) in (3), dobimo naslednje: (4) (5) enačbi (5) je bil pogoj, ki ustreza [ B Zato, kadar koli je bila enačbi (6) izpolnjen, HER2 Po drugi strani pa je definicija HER2 enačbi (7) je bil obdelan na enak način kot Enačbe (2) - (5) in je bil izražen kot sledi: (8) enačbi (8) je pogoj ustreza [ B Tako, kadar koli je bila enačbi (9) izpolnjen, HER2 Ko Enačbe (6) in (9) sta narisana na TC grafikonu območje nad črto krivljenje navzgor [ r pri [em> x Primerjava digitalnega PCR in HER2 potrjen smo teoretični enačbi (1) in TC grafikon s stopenjsko sistem zmesi celičnih linij. EQ (1) je bila pridobljena s pomočjo dejanskih izmerjenih vrednosti [ A številke Relativna kopiranje za HER2 H522 in SK-BR-3 celic genomske DNA zmešamo z da z LCL v postopen način ter zmesi smo analizirali z digitalnim PCR. V H522 celicah, HER2 Skladnost med TC grafikon za digitalno PCR in HER2-IHC /. - DISH v kliničnih vzorcih z biopsijo želodcu raka vzorci biopsije (n = 44) od 32 bolnikov, so bili analizirani z digitalnim PCR. HER2 Podatki Digitalni PCR in TCR o vsakem primeru so bile narisane na TC grafikonu (slika 4), vključno s podatki o za HER2 Teoretično ocenjena [ B več primerih so opazovali pri osmih bolnikih (slika 4 in S1 tabelo). V vseh primerih, v vsakem bolniku je pokazala enake rezultate za posodo in digitalno PCR z izjemo bolnikov, 24 (Pt-24); eden od petih primerov ( ) je bila pozitivna in dva ( in ) so bili negativni na obeh merjenjih. Dva primera negativne za DISH bila dodeljena pozitivna (!) in dvoumen ( ) območjih v TC tabeli (tabela 3 in S1 tabeli). V celoti je bilo 22 HER2-IHC primeri točk 2+ (tabela 4), ki obsega tri pozitivno, 15 negativno, in štiri dvomljivih primerov, ki temeljijo na TK shemo digitalnega PCR. Pozitivni in negativni rezultati so bili povsem skladnih s tistimi, ki HER2 intratumorska HER2 heterogenost je bila ocenjena s kombinacijo HER2-IHC /-DISH in digitalni PCR (slika 5, S1 slika in S2 tabelo). Case_1, 2 in 4 so pokazali izrazito intratumorska heterogenost sestavljen iz HER2-IHC-pozitivnih in HBeAg negativnih lezij v skupini, medtem ko Case_3 splošno pokazala sumljiv HER2-IHC izraz vzorec. Pomembneje so HER2 pozitivni lezije dostopna iz lumnu želodca v Case_1 (-2,-3), Case_2 (-1,-2) in Case_4 (-4). Vsi HER2-IHC /-DISH-pozitivni primeri so narisane v pozitivnem območju. Trije vzorci Case_3 (-1, -2 in -3), ki kaže HER2-IHC (nezanesljivo) in HER2 Pogovor študija je prvi poskus kategorizacijo želodčnih raka v HER2 metoda digitalni PCR je bila uporabljena za ocenjevanje številu kopij virusa [28], ploda kromosomsko aneuploidija [29], in onkogeni v različnih rak tkiva [30, 31]. Velik problem, ki ga je treba premagati, je popravek neobdelanih podatkov glede na vsebino tumorja osebkov; želodčni rak tkiva običajno vsebujejo večje količine infiltracijo non-rakavo celico, npr intersticijske ali vnetnih celic. V tej raziskavi smo uporabili analizo slike za pridobitev-pol avtomatsko ocenjevanje vsebine tumorskih celic in razvili TC grafikon za razvrščanje podatkov v tri kategorije-t.j.., Dopolnjena, non-pomnoženih in dvoumnih. Možno bi bilo, da se očisti rakave celice iz oddelkov FFPE tkiva z mikrodisekcijo, ampak to je preveč zahtevno za rutinsko klinično prakso, čeprav je bolj natančen v teoriji. Uporaba tega pristopa za biopsijo, število HER2-IHC-dvoumnih primerih (2+), se je zmanjšal s 22 na šest, s tem pa tudi potreba po potrditvi s HER2 Na voljo so dodatne prednosti digitalnega PCR protokolu. Najprej je preprosto glede na ISH, ki zahteva spretnost in je delovno intenzivna, ki obsega več korakov. Drugič, zahteva manj primerov za potrjevanje, kot so potrebni za HER2
pomnožitev gena je pomemben sestavni del zdravljenja odločanju za napredovalega ali metastatskega raka želodca. Preprosta metoda, ki se uporablja za mala,-formalin določen,-parafin vgrajeni biopsijo je zaželen kot dodatek ali kot nadomestek za zdaj uporablja HER2 imunohistokemiji in situ hibridizacija protokolov. V tej študiji smo razvili digitalni način, ki temelji na mikrofluidne PCR za določanje HER2
in kromosoma 17 Centromera (CEP17) kopirate in ocenjevanju razmerja vsebine tumor (TCR). razmerje HER2
/CEP17 je določena s tremi spremenljivkami-TCR in absolutnega števila kopij za HER2
in CEP17-s preučevanjem tumorske celice; Samo razmerje slednjih lahko dobimo z digitalnim PCR z uporabo cele vzorec brez čiščenja tumorske celice. TCR določimo z polavtomatsko analizo slik. Razvili smo tumorje Content grafikon, ki je ravnina pravokotnimi koordinatami sestavljen iz podatki HER2
/CEP17 digitalni PCR in TCR, ki prikazuje ojačani, non-ojačati in nejasne območja. Z uporabo te metode smo 44 kliničnih želodčni rak vzorci biopsije razvrščen kot ojačeno (n = 13), non-ojačeno (n = 25) ali dvoumen (n = 6). Za primerjavo je bilo 11 vzorcev pozitivnih, 11 so bili negativni, in 22 so bili equivocally imunohistokemija. Tako je naša nova metoda zmanjša število dvoumnih vzorcev od 22. do 6, s čimer se izognemo potrebi po potrditvi fluorescenco ali dvojno sonde in situ hibridizacija, da < 30% primerov. Vsebnost Tumor grafikon podprto digitalna analiza PCR se uporablja na več mestih v kirurško odstranjenimi tkivih tudi. Ti rezultati kažejo, da je ta analiza uporabna alternativa HER2 imunohistokemiji v želodcu raka, ki lahko služijo kot podlaga za avtomatsko ocenjevanje HER2
statusa
CEP17 Digitalni PCR analiza Rak želodca biopsijo. PLoS ONE 11 (4): e0154430. doi: 10,1371 /journal.pone.0154430
pomnožitev gena, ki so poročali v več vrstah malignega tumorja [5] vključno z rakom dojke [6, 7], žleze ščitnice adenokarcinoma [8], urinske rak mehurja [9] in rak želodca [10]. želodčni rak HER-2 s prekomerno ekspresijo predstavljajo 8% -31% vseh primerov [11-15]. V trastuzumab za želodca raka sojenja, trastuzumab (Roche Diagnostics, Basel, Švica) -a humanizirano anti-HER2 monoklonsko protitelo, povečano stopnjo preživetja bolnikov z želodca raka HER2-pozitiven, če je uporabljen v kombinaciji s kemoterapijo [16], in je bil odobreno tudi za zdravljenje raka dojke [17, 18]. Vrednotenje statusa HER2 je zato pomemben vidik zdravljenja raka želodca za.
dual-sonda ISH ( HER2
-DISH), HER2
in kromosoma 17 Centromera (CEP17) izvod številke lahko zazna kot signali pod svetlobo mikroskop po celotnem območju osebka. Čeprav je ta metoda vrhunsko občutljivost, je draga in sorazmerno zamuden
/CEP17 razmerje števila kopij. V digitalnem PCR, je predlogo DNA razdeljen na 770 kosov nanoliter reakcijskih komor, s pričakovano koncentracijo 0-1 molekule na komori. Dual-barvne ciljne in referenčne geni so hkrati PCR pomnožili in njihovo število kopij se izračunajo s štetjem komore s pozitivnimi signali. Ta zelo robustna metoda omogočila primerjavo HER2
in število kopij CEP17 uporabo različnih začetnih oligonukleotidov sklopov. Cilj te raziskave je bil potrditi izvedljivost digitalne tehnologije PCR za analizo želodčnega raka biopsijo. Vendar pa en problem tega pristopa je, da se tkivo običajno vsebuje ne-rakave stromalne celice, ki motijo molekularne analize. Da bi rešili ta problem, smo razvili dvodimenzionalni graf raztrosa navedel, da je tumor Content (TC) diagrama, ki dodeljuje podatkov v dopolnjena, non-ojačan in dvoumnih kategorij. Cilj je bil razviti avtomatiziranega načina za vrednotenje HER2
stanje, s TC grafikon podprto HER2
/CEP17 digitalni PCR analiza služi kot prvi korak.
Materiali in metode
klinični želodca vzorci rak biopsije in kirurške osebki
-DISH.
DISH barvanja in vrednotenje
-DISH je bila izvedena na FFPE tkiva s pomočjo DISH komplet HER2 DNA (Roche Diagnostics) v skladu z navodili proizvajalca, ter vzorce smo ovrednotili s svetlobnim mikroskopom. HER2
signali pojavil kot črne pike ali grozdov in CEP17 signali pojavil kot rdeče pike. so bili dosegel dvajset brez prekrivanja jedra raka za HER2
in CEP17 signali in HER2
pomnožitev gena je bil razvrščen kot v smernicah ASCO /SKP priporoča [19]; pozitiven, [ HER
2 /CEP17 razmerje ≥ 2,0] in /ali [povprečna HER
2 kopiranja število ≥ 6,0 signale /celice]; dvoumni, [ HER
2 /CEP17 razmerje < 2.0] in [povprečno HER
2 kopijo število ≥ 4,0 in < 6.0 signali /celic]; negativen, [ HER
2 /CEP17 razmerje < 2.0] in [povprečno HER
2 obrazec številka < 4.0 signale /celice].
Priprava DNA iz FFPE kliničnega materiala
-DISH. Vsebnost tumorja je bila potrjena pred in po odseke z obarvanjem sosednje stekelca z HE. Ker je ena parafin blok običajno vsebuje več kosov biopsija vzorca, so posamezni osebki izolirali z rezili za steklo. Za ekstrakcijo DNK iz kirurške odstranjenimi osebkov, so 5 serijske sekcije iz vsakega vzorčnega tkiva bloka zmanjšati na debelino 10 um, ki so bili dani na list narejen iz politetrafluoroetilena (PTFE, Sanplatec, Osaka, Japonska). Trak je kemična odpornost za temelji na ksilena deparaffinization in se z lahkoto narežemo na koščke. V študiji so različni deli posnetek ven iz pločevine po katerem HER2 profilu. Steklo ali PTFE delci so sestavljeni v 2,0-ml epruveto, in DNA je bila vzeta z QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen, Valencia, CA, ZDA).
HER2
ocena število kopij digitalnih PCR
in CEP17 so prikazani v tabeli 1. Vsak primer je bil oblikovan tako, da so bili PCR produkti pridobljeni dovolj kratek (59 in 65 bp), da se odpravi vpliv fragmentacije DNK v procesu FFPE. Digitalni PCR je bila izvedena z uporabo sistema EP1 z 48,770 digitalnega polja integriranega fluidno vezju (Fluidigm). Vsak čip vseboval 48 plošč, ki so še dodatno razdeljena na 770 reakcijskih komor. Število pozitivnih fluorescentnih signalov iz vsake plošče smo uporabili za količinsko različne sekvence DNA. Protokol je bil opisan drugje [26]. Na kratko, smo pripravili 4-ul reakcijske zmesi za vsako analizo, ki jo vsebuje 1 x TaqMan izražanje genov master mix, 1 x HER2-FAM in chr17cent-VIC TaqMan sonde, in 1 × vzorec nakladanje reagenta (Fluidigm). Reakcijsko zmes enakomerno porazdeljena v 770 reakcijskih komor in digitalni matrika je termo-premikati na EP1 sistem FC1 ciklerja. Obe ciljne regije so bile neodvisno pomnožili in 6-karboksifluorescein in VIC barv signali v komorah bili zabeleženi na koncu vsakega cikla PCR. Število 6-karboksifluorescein pozitivnih (HER2) in VIC-pozitivnih (CEP17) zbornice v vsaki plošči je prešteti in HER2
/CEP17 razmerje števila kopij je bil izračunan [27].
Ocena razmerja vsebine tumor (TCR)
-DISH vrednotenje.
Postopen mešanje z LCL.
-DISH in digitalni PCR v H522 in SK-BR-3 celic in LCL. Razlike so se šteli za pomembne, če p
< 0.05
/CEP17 je bila določena na podlagi treh spremenljivk. TCR in številke absolutno kopiranje za HER2
in CEP17. Samo relativna razmerja slednjih lahko dobimo z digitalnim PCR z uporabo tumorskih vzorec brez izoliranja posamezne celice. HER2
/CEP17 razmerje dobimo digitalne PCR [ r
] je bila izražena na naslednji način, ki temelji na predpostavki, da se število kopij gena za rakave celice homogena in da ne-rakave celice so gensko stabilen pri diploidnih kromosomov (Slika 1A in 1B) :( 1), kjer je [ r
] je razmerje HER2
za CEP17 dobimo z digitalnim PCR (0 < r
); [ x
] je TCR (0 ≤ x
≤ 1); [ A
] je CEP17 število kopij v enem rakavi celici (0 ≤ A
); in [ B
] je HER2
kopija število v eni celici raka (0 ≤ B
). V nadaljevanju je dvodimenzionalni graf raztrosa s enačbi (1), zastopani besedilu TC grafikonu.
] je bil določen z HE-obarvanih vzorcev z uporabo slike analiza programske opreme, kot so tkiva Studio programsko opremo za analizo slike za biopsijo in Hybrid Cell grofa programske opreme za kirurške primerkov, v tem zaporedju; in [ r
] in [ x
] so bile določene z meritvami.
] in [ x
] kot navpični in vodoravni osi, v tem zaporedju (slika 1B). Razmerje [ B
/ A
] je referenčna vrednost za določanje HER2
amplifikacijo gena. Dejansko je dejansko število kopijo CEP17 [ A
] in HER2
[ B
] ni mogoče določiti brez opravljanje HER2
-DISH. Vendar pa je praktično vrednotenje HER2
in CEP17 kopirate s DISH ugotovila, da [ A
] v razponu od 2,0 do 6,0 (med 40 in 117 CEP17 signalov med 20 rakavih celic v S1 in S2 tabele), in ne v kliničnih želodčnih vzorcih raka presegla 8,0. Po naših izkušnjah 164 zaporednih primerov raka želodca (Ushiku T et al
. Neobjavljeni podatki), CEP17 število kopij je 1,0-5,7, mediana 2,5 in monosomijo, definirana kot [ A
< 1.5], je zelo redka le v dveh primerih (1,2%). Tako je obseg [ A
] je bil določen kot [2 ≤ A
≤ 8] z varnostno rezervo.
ojačanje negativna kot [ B
/ A
< 2] ali [ B
< 2 A
]. [ Bx
+ 2 (1 - x
)], je bila nato izražena kot sledi: (2)
+ 2 (1 - x
)] :( 3)
/ A
< 2]. Na desni strani član enačbe (5), je pokazala monotonem povečanje glede na spremenljivko [ A
] (2 ≤ A
≤ 8); vključitev [ A
= 2], kar je najnižja vrednost v višini [ A
], v enačbi (5) je naslednja: (6)
ojačanje negativni pogoj [ B
/ A
< 2] je veljalo za katero koli vrednost [ A
] (2 ≤ A
≤ 8).
ojačanje-pozitivno je [ B
/ A
≥ 2] ali [ B
≥2 A
]. V tem primeru, [ Bx
+ 2 (1 - x
)] je bila izražena kot sledi: (7)
/ A
≥ 2]; desna stran član enačbe kaže na monotonem povečanje. Vključitev [ A
= 8], kar je najvišja vrednost v višini [ A
], v enačbi (8) dobimo naslednje: (9)
ojačanje pozitivni pogoj [ B
/ A
2 ≥] je veljalo za katero koli vrednost [ A
] (2 ≤ A
≤ 8).
= (7 x
+ 1) /(3 x
+ 1)] ( A
= 8), ki je bila imenovana kot pozitivno območje, in območje pod premico [ r
= x
+ 1] ( A
= 2) je bilo negativno območje. Območje, omejeno s črtami, [ r
= x
+ 1] in [ r
= (7 x
+ 1) /(3 x
+ 1)] je bila za nedoločen pas glede na vrednosti [ A
], ki je bila imenovana za nezanesljivo območja in so opredeljena kot sledi (slika 1B) :( 10)
<] 0 (ki ne vsebuje rakave celice), vse proge zbližale na koordinatah (0,1), ki temelji na predpostavki, da so ne-rakave celice genomically stabilna. Ko [ x
] je bila 1.0 (ki jo sestavljajo samo rakavih celic), linije šel skozi koordinate (1,2), neodvisno od vrednosti za [ A
] in [ B
].
-DISH v kultiviranih celicah
] in [ B
], pridobljen s HER2
-DISH v celičnih linijah, ali z uporabo izračuna [ B '
] od [ A
] in izmeriti [ r
].
in CEP17 ( HER2
/CEP17) v LCL in H522 in SK-BR-3cells smo ovrednotili s HER2
-DISH uporabo FFPE celic blokov in digitalne PCR (tabela 2). HER2
signali pojavil kot diskretne pik v jedrih s HER2
-DISH (slika 2A in 2B); HER2
število kopij v posameznih celicah, je bilo skoraj dva v LCL in štiri v H522 celicah. V nasprotju s tem, SK-BR-3 celice pokazala zbrani HER2
signali, ki so težko individualizacijo (slika 2c); njihovo število je bilo samovoljno določi na najvišje vrednosti 7, 14, in 21 po velikosti grozda. Tako nižji razmerje HER2
/CEP17 je bila pridobljena s HER2
-DISH kot z digitalnim PCR.
[ B
] in CEP17 [ A
] copy številke so bili izračunani iz HER2
-DISH takole: [ A
= 41/20 = 2.05] in [ B
= 85/20 = 4,25]. Ko se vrednosti [ A
] in [ B
] so bili uporabljeni enačbi (1), se lahko podatki opišejo z referenčno črto [ r
= ( 4.25 x
+ 2 (1 - x
)) /(2,05 x
+ 2 (1 - x
))] (slika 2D ). V primeru celic SK-BR-3, je CEP17 obrazec številka [ A
] [ A
= 83/20 = 4,15]; Vendar pa, kot je opisano zgoraj, HER2
signali so bili zbrani, kar je zmanjšalo predvideno število kopij. Torej, z uporabo [ A
= 4.15], [ r
= 5.69] in [ x
= 1,0] enačbi (1), ocenjena HER2
obrazec številka [ B '
] je bila domneva, da je [ B'
= 5,69 x 4,15 = 23,61]. Zato, [ A
= 4.15] in [ B '
= 23.61] whilethe je referenčna črta [ r
= (23.61 x
+ 2 (1 - x
)) /(4.15 x
+ 2 (1 - x
))] (slika 2E). Izrisani digitalnih podatkov PCR iz celic-BR-3 SK, pomešanih z LCL skladna s to linijo namesto [ r
= (19.50 x
+ 2 (1 - x
)) /(4.15 x
+ 2 (1 - x
))], ki je temeljil na HER2
-DISH podatkov, za katere [ B
= 19,50]. Ti rezultati kažejo na veljavnost TC grafikona-to, da ima dovolj quantitativity digitalnega PCR za razlikovanje HER2 dopolnjena od ne-ojačan celic
status vsakega vzorca je bila določena s HER2-IHC in -DISH (slika 3A-3C). Ocenjene vrednosti so bile v skladu z ročnimi štetje, ki jih patolog (KM). Stopnja TC je bila določena s slik z razlikovanjem jedra rakavi od tistih, ki niso rakave celice (slika 3D).
-DISH pozitivni (rdeči), -equivocal (vijolična) in -negativno (modra), kot tudi HER2-IHC pozitivni (rhombi), -equivocal (trikotniki), in -negativno ( cross-oznake) vzorci. Clinicopathological informacije o reprezentativnih in vseh primerih je prikazano v tabeli 3 in S1 tabeli oz. Ni bilo HER2
-DISH pozitivnih primerov pod črto [ r
= x
+ 1]; Vendar pa je ena HER2
-DISH negativni ( ), so bili v nezanesljivo območju opazili dva nejasne (in), in trije pozitivni (,)in,) primerih . Poleg tega je bil en HER2
-DISH negativni primer v pozitivnem območju (!). Trije primeri (,in*) so pokazali izrazito visoke digitalne vrednosti PCR (28.25, 19.99 in 24.00, v tem zaporedju). V HER2
-DISH, pokazala zbrani ti primeri HER2
signali (slika 3c), ki so bile težko oceniti, saj v SK-BR-3 celic. Enačbi (1) je bila izražena tudi na naslednji način: (11)
/ A
] je bila izračunana z uporabo izmeriti [ r
] in [ x
] in izmeriti [ A
], ki je bila določena z grofom CEP17 signalov, pridobljenih s HER2
-DISH v 20 rakave celice (Tabela 3 in S1 tabelo). [ B '
] je bila pridobljena tudi z merjenjem [ r
] in [ A
] in [ x
= 1], kot je opisano v SK-BR-3 celice.
-DISH. Od štirih dvoumnih primerih z rezultatom IHC 2+, eno () je bil pozitiven in drugi (, in)) so bili negativni, kot je določeno z HER2
-DISH. Ocenjena [ B
/ A
] vrednost ustrezno ≥ 2,0 je bilo v primeruin < 2.0 v drugem tri, razen v primeru), ocenjena [ B
/ A
], od katerih je bila 2.12.
Vrednotenje intratumorska HER2 heterogenosti v kirurških osebkov
-DISH (pozitivno) so bile narisane na nezanesljivo območju. Vzorec-2 so narisane na nezanesljivo območju, ker regija-2 zajeti razmeroma veliko območje, ki vsebuje tako HER2-pozitivnih in HBeAg negativnih komponent. Vzorec-2 pokazala razlike med HER2-IHC (pozitivno) in HER2
-DISH (negativni) (S2 tabela), pri digitalni rezultati PCR ustreza HER2
-DISH.
ojačanja negativna, -equivocal in -positive primeri z uporabo dvodimenzionalne odbojev plot ali TC grafikon, ki temelji na izmerjenih vrednosti HER2
/razmerje CEP17 pridobljen z digitalnim PCR [ r
] in TCR [ x
] brez konvencionalne HER2
-DISH ali informacije HER2-IHC. Tako je analiza s TC karti je neodvisen od CEP17 in HER2
kopirati številke ([ A
] in [ B
]) v eno samo rakave celice, ki lahko običajno dobimo z HER2
-DISH.
-DISH se lahko izognemo na manj kot 30% primerov. Pogostost HER2
ojačanje razlikuje po želodcu raka histološke vrste, od 20% -30% v črevesju < 10% v razpršenega tipa [32]. Zato je potrebna učinkovita metoda preverjanja v rutinski klinični praksi, še posebej v državah z visoko prevalenco raka želodca. TC grafikon se lahko uporablja tudi z drugo metodo, ki temelji na PCR, kot kvantitativno PCR za HER2
ojačanje [33].
-DISH, zaradi česar je stroškovno učinkovit. Nazadnje je potrebno le, da oblikujejo posebne začetnih oligonukleotidov, ki se lahko uporabljajo za druge kot genov HER2