Vurderer HER2 Citation. Matsusaka K, Ishikawa S, Nakayama A, Ushiku T, Nishimoto A, Urabe M, et al. (2016) Tumor Content Chart-pasning HER2 / Redaktør: Yves St-Pierre, INRS, CANADA mottatt: 07.11.2015; Godkjent: 13 april 2016; Publisert: 27 april 2016 Copyright: © 2016 Matsusaka et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres Data Tilgjengelighet:. All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer Finansiering:. Dette arbeidet ble utført som en del av Biobank Japan Project (http://www.src.riken.jp/english/project/person/) som ble støttet av departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi (http://www.mext.go.jp/english/), Japan Direktoratet for medisinsk forskning og utvikling (http: //www.amed.go jp /no /), og Grants-i-Aid for Scientific Research (KAKENHI) fra Japan Society for Promotion of Science (https://www.jsps.go.jp/english/e-grants/). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer Innledning Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP er en av de mest vanlige ondartede svulster og det tredje ledende årsak til kreft-relaterte dødsfall over hele verden [1]. Avanserte tilfeller uten operative inngrep har dårlig prognose og nødvendigtverrfaglige behandlingsmetoder. HER2 er et 185-kDa transmembran glykoprotein som er et medlem av den epidermale vekstfaktor-reseptor-familien, og fungerer som en tyrosin-kinase-reseptor [2, 3]. I normale celler, HER2-proteinet virker som et signal transduser i løpet av celleproliferasjon eller differensiering [4]; har imidlertid den onkogene egenskaper når den overuttrykkes. Dette skyldes vanligvis HER2 For pasienter med inoperabel mage kreft, bør HER2 status undersøkes ved hjelp av en liten biopsiprøve. Som representert i de nyeste anbefalingene for HER2 testing av brystkreft fra American Society of Clinical Oncology (ASCO) /College of American Patologer (CAP), immunhistokjemi (IHC) og /eller in situ hybridisering (ISH) er standard metoder for å vurdere HER2 status [19], men hver har sine begrensninger. For eksempel er effekten av HER2-IHC påvirkes av flere faktorer slik som formalin fikseringsprosessen, og poengsystemet er ikke alltid reproduserbare særlig i tvetydige tilfeller hvor det ISH er anbefalt [19-25]. I lyse felt HER2 I denne studien, søkte vi MicroFluidics basert digital PCR-teknologi. (BioMark; Fluidigm, Cambridge, UK) [26] for å bestemme HER2 Twitter /CEP17 kopiantall ratio. I digital PCR, er malen DNA delt inn i 770 stykker i nanoliter reaksjonskamrene, med en forventet konsentrasjon av 0-1 molekyl per kammer. Dual-farget mål- og referanse gener er samtidig PCR-forsterket og deres kopiantall er beregnet ved å telle kamrene med positive signaler. Denne svært robust metode aktivert sammenligning av HER2 Hotell og CEP17 kopiantall ved hjelp av ulike primersett. Målet med denne studien var å bekrefte muligheten for digital PCR-teknologi for analyse av magekreft biopsier. Imidlertid er ett problem med denne tilnærmingen at vevet inneholder som regel ikke-kreft stromale celler som interfererer med den molekylære analyser. For å overvinne dette problemet, har vi utviklet todimensjonale spredningsdiagram referert til som Tumorinnhold (TC) diagram som allokerer data til forsterket, ikke-forsterket, og tvetydige kategorier. Målet var å utvikle en automatisert måte å evaluere HER2 Etikk erklæringen Denne studien ble godkjent av University of Tokyo Institutional Etisk Komité. Kliniske prøver med skriftlig informert samtykke ble samlet under Universitetet i Tokyo Institusjonelle retningslinjer for studiet av menneskelig vev. I totalt, 44 magekreft biopsier fra 32 pasienter behandlet med rutine formalinfiksert parafin-embedded (FFPE) var tilgjengelig for analyse. Alle biopsiprøver ble oppnådd endoskopisk ved Institutt for Endoskopi og endoskopisk kirurgi. Fire kirurgiske prøver, som ble resected kirurgisk ved Institutt for Gastrointestinal kirurgi, ble også analysert. Disse prøvene ble fiksert i 10% nøytral bufret formalin. Alle saker ble diagnostisert ved Avdeling for patologi ved Universitetet i Tokyo Hospital. Snitt ble kuttet med en tykkelse på 4 um ved anvendelse av konvensjonelle histologiske teknikker; disse ble samlet på objektglass og brukes for hematoxylin-eosin (HE) farging, HER2-IHC, og HER2 Immunohistochemistry Immunhistokjemisk farging ble utført på FFPE vev ved hjelp av Ventana BenchMark XT (Roche Diagnostics) med 4D5 anti-HER2-antistoff. Fargeintensitet og membran immunoreaktivitets mønstre ble evaluert ved bruk av Dako scoring system i henhold til ASCO /CAP retningslinjer [19]. Ingen membranfarging ble scoret som 0; svak eller knapt merkbar /ufullstendig membranfarging ble scoret som 1+; ufullstendig og /eller svak /moderat omkrets-membranfarging ble scoret som 2+; og helt og intenst periferiske membranfarging ble scoret som 3+. HER2- HER2 Å trekke ut DNA fra biopsiprøver, 10 seriesnitt kuttet med en tykkelse på 10 mikrometer ble plassert på en glassflate for HER2 -IHC og HER2 primer sett for amplifisering HER2 Hele lysbilde bilde av HE seksjoner, som var de like før seriesnitt for DNA-ekstraksjon, ble skannet ved hjelp NanoZoomer (Hamamatsu Photonics, Hamamatsu, Japan). Data ble importert til Definiens Tissue Studio 2.0 (http://www.tissuestudio.com) for bestemmelse av TCR. Den valgte regionen kirurgiske prøver ble skannet med en BZ-710 mikroskop (Keyence, Osaka, Japan). Data ble importert til Hybrid Cell Count programvare (BZ-H3C, Keyence). Data som detaljert antall celler i importerte bilder og fremstående kreft fra ikke-kreft celler basert på kjernestørrelse ble automatisk generert Eksperimenter for å utvikle TC diagrammer Cellelinjer. For kontrolleksperimenter, H522 lungekreft og SK-BR-3-brystcancercellelinjer ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). GM18997 Epstein-Barr virus-transformert lymfoblastoid cellelinje (LCL) ble oppnådd fra Coriell Biorepository (https://catalog.coriell.org/). H522-celler og LCL ble dyrket i Roswell Park Memorial Institute 1640-medium (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan) inneholdende 10% føtalt bovint serum (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) og 1% penicillin-streptomycin-løsning ( Nacalai Tesque). SK-BR-3-celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium /Hams F12 (Nacalai Tesque, Japan) med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin /streptomycin. Celler ble dyrket ved 37 ° C i en atmosfære inneholdende 5% CO 2. DNA ble ekstrahert ved bruk av et QIAquick DNA mini-sett (Qiagen). FFPE H522, SK-BR-3, og LCL celleblokker var forberedt på HER2 Genomisk DNA fra H522 og SK -Br-3-celler og LCL ble justert til en konsentrasjon på 50 ng /ul. H522 og LCL genomisk DNA ble blandet i åtte trinn på følgende volumforhold: 8: 2, 7: 3, 6: 4, 5: 5, 4: 6, 3: 7, 2: 8 og 1: 9 (H522 : LCL). SK-BR-3 og LCL genomisk DNA ble blandet i fire trinn ved følgende volumforhold: 8: 2, 6: 4, 4: 6, og 2: 8 (SK-BR-3: LCL). Statistiske analyser Chi-squared tester ble brukt for å sammenligne teller mellom HER2 Resultater Utvikling av TC diagrammet for digitale PCR data HER2 Twitter /CEP17 forholdet ble fastsatt på grunnlag av tre variabler:. TCR og absolutte kopiere numre av HER2 Hotell og CEP17. Bare de relative forhold av de to sistnevnte kan oppnås ved digital PCR ved anvendelse av tumor-prøven uten isolering av enkeltceller. HER2 Twitter /CEP17 forhold oppnås ved digital PCR [ r I denne studien, [ x likning (1) var representert grafisk som TC diagrammet, med [ r Vi definerte HER2 Begge sider av ligning (2) ble delt etter [ Ax kombinere med ligningene (1) og (3) ga følgende: (4) (5) EQ (5) var en tilstand som tilsvarer [ B Twitter / A Derfor når likning (6) var fornøyd, HER2 På den annen side, definisjonen av HER2 likning (7) ble behandlet på samme måte som ligningene (2) - (5) og ble uttrykt som følger: (8) Eq (8) var en tilstand som tilsvarer [ B Twitter / A Således når likning (9) var fornøyd, HER2 Når ligningene (6) og (9) ble plottet på TC diagrammet, området over linjen kurvet oppover [ r Når [ x Sammenligning av digital PCR og HER2 Vi validert den teoretiske ligning (1) og TC kartet med en trinnvis blanding system av cellelinjer. EQ (1) ble oppnådd ved bruk av faktisk målte verdier av [ En Relativ kopiantall av HER2 Hotell og CEP17 ( HER2 Twitter /CEP17) i LCL og H522 og SK-BR-3cells ble evaluert av HER2 H522 og SK-BR-3 cellers genomisk DNA ble blandet med at av LCL på en trinnvis måte og blandingene ble analysert ved hjelp av digital PCR. I H522 celler, HER2 product: [ B samsvar mellom TC diagrammet for digital PCR og HER2-IHC /. - oppvask i kliniske biopsiprøver magekreft biopsier (n = 44) fra 32 pasienter ble analysert ved digital PCR. HER2 Digital PCR data og TCR av hvert tilfelle ble plottet på TC diagrammet (figur 4), inkludert data for HER2 Teoretisk beregnet [ B Twitter / En Flere saker ble evaluert for åtte pasienter (fig 4 og S1 tabell). Alle saker i hver pasient viste samme resultat for oppvask og digital PCR bortsett Pasient-24 (Pt-24); ett av fem tilfeller ( ) var positive og to ( og ) var negative for begge målingene. To tilfeller negative for oppvask ble allokert til positive (!) og tvetydige ( ) områder i TC diagrammet (tabell 3 og S1 tabell). I alt 22 HER2-IHC tilfellene hadde en score på 2+ (tabell 4), som består av tre positive, 15 negativ, og fire tvetydige tilfeller basert på TC diagram av digital PCR. Positive og negative resultater var helt konkordant med de av HER2 intratumoral HER2 heterogenitet ble evaluert ved en kombinasjon av HER2-IHC /-DISH og digital PCR (figur 5, S1 og S2 fig tabell). Case_1, 2 og 4 viste tydelig intratumoral heterogenitet som består av HER2-IHC-positive og -negative lesjoner i en klynge, mens Case_3 generelt viste en tvetydig HER2-IHC uttrykksmønster. Viktigere, HER2-positiv lesjoner var tilgjengelig fra lumen av magen i Case_1 (-2-3), Case_2 (-1-2), og Case_4 (-4). Alle HER2-IHC /-DISH-positive saker ble plottet i den positive området. Tre prøver av Case_3 (-1, -2 og -3) viser HER2-IHC (tvetydig) og HER2 Diskusjoner studien er den første til å forsøke en kategorisering av magekreft i HER2 den digitale PCR-metoden har vært brukt til evaluering av kopien antall virus [28], fosterets kromosom Aneuploidy [29], og onkogener i ulike cancervev [30, 31]. Et stort problem som må overvinnes er korreksjon av rådata i henhold til tumor-innhold av prøver; magekreft vev generelt inneholde større mengder av ikke-cancercelleinfiltrasjon, f.eks interstitiell eller betennelsesceller. I denne studien har vi brukt bildeanalyse for å få en semi-automatisert estimering av tumorcelleinnhold og utviklet TC diagrammet for å klassifisere data i tre kategorier-dvs., Forsterket, ikke-forsterket, og tvetydige. Det kan være mulig å rense kreftceller fra FFPE vevssnitt ved mikrodisseksjon, men dette er altfor arbeidskrevende for rutinemessig klinisk praksis, selv om det er mer presist i teorien. Ved hjelp av denne tilnærmingen for biopsiprøver, antallet HER2-IHC-tvetydige tilfeller (2+) ble redusert fra 22 til seks, og dermed behovet for bekreftelse av HER2 Det er flere fordeler med å digital PCR-protokollen. For det første er det lett i forhold til ISH, noe som krever dyktighet og er arbeidskrevende, omfattende flere trinn. Dernest er færre tilfeller kreves for validering enn er nødvendig for HER2
genamplifisering er en avgjørende del av terapeutisk beslutnings for avansert eller metastatisk ventrikkelkreft. En enkel metode som er anvendelig for små, formalinfikserte, parafininnstøpte biopsiprøver er ønskelig som et tillegg til eller som en erstatning for tiden brukes HER2 immunhistokjemi og in situ hybridisering protokoller. I denne studien har vi utviklet en MicroFluidics-basert digital PCR-metode for å bestemme HER2 Hotell og kromosom 17 cent (CEP17) kopiere numre og estimering svulst innhold ratio (TCR). HER2 Twitter /CEP17 forholdet bestemmes av tre variabler-TCR og absolutte kopiere numre av HER2 Hotell og CEP17-ved å undersøke tumorceller; bare forholdet mellom de to sistnevnte kan oppnås ved digital PCR ved anvendelse av hele prøven uten rensing tumorceller. TCR ble bestemt av semi-automatisk bildeanalyse. Vi har utviklet en svulst innhold figuren, som er en plan av rektangulære koordinater bestående av HER2
/CEP17 digital PCR-data og TCR som avgrenser forsterkede, ikke-forsterket, og tvetydige områder. Ved å bruke denne fremgangsmåte ble 44 kliniske gastrisk kreft biopsiprøver klassifisert som forsterkes (n = 13), ikke-forsterket (n = 25), eller tvetydige (n = 6). Til sammenligning 11 prøvene var positive, 11 var negative, og 22 var equivocally immunhistokjemi. Således vår nye fremgangsmåte reduseres antallet tvetydige prøvene 22-6, slik at man unngår behovet for bekreftelse ved fluorescens eller dual-probe in situ hybridisering til < 30% av tilfellene. Tumor innhold chart-assistert digital PCR-analyse er også aktuelt for flere nettsteder i kirurgisk resected vev. Disse resultatene indikerer at denne analysen er et nyttig alternativ til HER2 immunhistokjemi i mage kreft som kan tjene som grunnlag for automatisert evaluering av HER2
status
CEP17 Digital PCR analyse av magekreft biopsier. PLoS ONE 11 (4): e0154430. doi: 10,1371 /journal.pone.0154430
genamplifisering, som har blitt rapportert i flere typer ondartet svulst [5], herunder brystkreft [6, 7], spyttkjertel adenokarsinom [8], kreft i urinblæren [9] og magekreft [10]. HER2-overuttrykk mage kreft står for 8% -31% av alle tilfeller [11-15]. I Trastuzumab for magekreft rettssaken, trastuzumab (Roche Diagnostics, Basel, Sveits) -en humanisert anti-HER2 monoklonalt antistoff-økt overlevelse av pasienter med HER2-positiv mage kreft når det gis i kombinasjon med kjemoterapi [16], og var også godkjent for behandling av brystkreft [17, 18]. Vurderer HER2 status er derfor en viktig del av magekreft terapi.
dual-probe ISH ( HER2
-DISH), HER2 Hotell og kromosom 17 cent (CEP17) kopiere numre kan oppdages som signaler under et lys mikroskop på hele området av prøven. Imidlertid, selv om denne fremgangsmåte har overlegen sensitivitet, er det kostbart og forholdsvis tidkrevende
status, med TC chart-assistert HER2 Twitter /CEP17 digital PCR-analyse fungerer som det første skrittet.
Materialer og metoder
Kliniske mage kreft biopsiprøver og kirurgiske prøver
-DISH.
oppvask farging og evaluering
-DISH ble utført på FFPE vev ved hjelp av HER2-DNA antenne-sett (Roche Diagnostics) i henhold til produsentens instruksjoner, og prøver ble undersøkt ved lysmikroskopi. HER2
signaler fremstått som svarte prikker eller klynger, og CEP17 signaler dukket opp som røde prikker. Tjue ikke-overlappende kreft kjerner ble scoret for HER2 Hotell og CEP17 signaler og HER2
genamplifisering ble klassifisert som anbefalt av ASCO /CAP retningslinjer [19]; positive, [ HER
2 /CEP17 forholdet ≥ 2,0] og /eller [gjennomsnittlig HER
to eksemplar nummer ≥ 6,0 signaler /celle]; tvetydig, [ HER
2 /CEP17 ratio < 2,0] og [gjennomsnittlig HER
to eksemplar nummer ≥ 4,0 og < 6,0 signaler /celle]; negative, [ HER
2 /CEP17 ratio < 2,0] og [gjennomsnittlig HER
to eksemplar nummer < 4,0 signaler /celle].
Klargjøring av DNA fra FFPE klinisk materiale
-DISH. Tumor innhold ble bekreftet før og etter seksjonering ved farging tilstøtende lysbilder med HE. Siden en enkelt parafinblokk vanligvis inneholder flere stykker av biopsiprøve, ble individuelle prøver isolert ved anvendelse av en glassskjærer. For å ekstrahere DNA fra kirurgiske resekterte prøver, ble 5 seriesnitt fra hver representative vev-blokk kuttet med en tykkelse på 10 um, som ble plassert på et ark laget av polytetrafluoretylen (PTFE, Sanplatec, Osaka, Japan). Membranen er kjemisk bestandighet for xylen-baserte deparaffinization, og er lett skjæres i biter. I studien, ulike delene var klippet ut fra arkene i henhold til HER2-profil. Glass eller PTFE stykker ble montert i et 2,0 ml tube, og DNA ble ekstrahert ved hjelp av QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA).
HER2
kopiantall vurderingen ved digital PCR
og CEP17 er vist i tabell 1. Hver primer er utformet slik at PCR-produktene som ble oppnådd var tilstrekkelig kort (59 og 65 bp) for å eliminere påvirkning av DNA fragmentering i FFPE prosessen. Digital PCR ble utført ved hjelp av en EP1 system med en 48,770 digitale sett integrert fluidic krets (Fluidigm). Hver brikke inneholdt 48 paneler som ble videre oppdelt i 770 reaksjonskammere. Antallet positive fluorescerende signaler i hver plate ble anvendt for å kvantifisere forskjellige DNA-sekvenser. Protokollen er beskrevet andre steder [26]. Kort fortalt ble 4-ul reaksjonsblandinger forberedt for hver analyse som inneholdt 1 x TaqMan genekspresjon mester mix, 1 × HER2-FAM og chr17cent-VIC TaqMan prober og 1 × utvalg lasting reagens (Fluidigm). Reaksjonsblandingen ble jevnt fordelt inn i de 770 reaksjonskammere og den digitale matrise ble termo-testsystemet på en EP1 System FC1 cycler. De to målregioner ble amplifisert uavhengig av hverandre og 6-karboksyfluorescein og VIC fargestoff signaler i kamrene ble målt ved slutten av hver PCR-syklus. Antallet 6-carboxyfluorescein-positive (HER2) og VIC-positive (CEP17) kamre i hvert panel ble talt opp og HER2 Twitter /CEP17 kopiantall forholdet ble beregnet [27].
Evaluering av tumor innhold ratio (TCR)
-DISH evaluering.
Trinnvis blanding med LCL.
-DISH og digital PCR i H522 og SK-BR-3 celler og LCL. Forskjeller ble ansett som vesentlig dersom p
< 0,05
] ble uttrykt som følger, basert på antagelsen om at genet kopiantall av kreftceller er homogene og at ikke-kreftceller er genetisk stabil med diploide kromosomer (fig 1A og 1B) :( 1) hvor [ r
] er forholdet mellom HER2
til CEP17 oppnås ved digital PCR (0 < r
); [ x
] er TCR (0 ≤ x
≤ 1); [ En
] er CEP17 kopiantall i en enkelt kreftcelle (0 ≤ A
); og [ B
] er HER2
kopiantall i en enkelt kreftcelle (0 ≤ B
). Heretter blir det todimensjonale scatterplot representert ved likning (1) referert til som TC diagrammet.
] ble bestemt fra HE-farget prøver ved hjelp av bilde analyse programvare, for eksempel Tissue Studio bildeanalyse programvare for lige snitt og hybrid Cell Count programvare for kirurgiske prøver, henholdsvis; og [ r
] og [ x
] ble bestemt fra målinger.
] og [ x
] som de vertikale og horisontale akser, henholdsvis (fig 1b). Forholdet mellom [ B Twitter / A
] var referanseverdien for å bestemme HER2
genamplifisering. Faktisk selve kopi antall CEP17 [ A
] og HER2 product: [ B
] kunne ikke bestemmes uten å utføre HER2
-DISH. Men en praktisk evaluering av HER2 Hotell og CEP17 kopiere numre av oppvask funnet ut at [ A
] varierte 2,0 til 6,0 (mellom 40 og 117 CEP17 signaler mellom 20 kreftceller i S1 og S2 tabeller) og aldri oversteget 8,0 i kliniske magekreft prøver. Ifølge vår erfaring av 164 sammenhengende tilfeller av magekreft (Ushiku T et al
. Upubliserte data), er CEP17 kopiantall 1,0 til 5,7, median 2,5, og monosomi, definert som [ A
< 1,5], er ganske sjelden i bare to tilfeller (1,2%). Dermed utvalget av [ En
] ble satt til [2 ≤ En
≤ 8] med en sikkerhetsmargin.
forsterkning-negative som [ B Twitter / A
< 2] eller [ B
< 2 A
]. [ Bx
+ 2 (1 - x
)] ble deretter uttrykt som følger: (2)
+ 2 (1 - x
)] :( 3)
< 2]. På høyre side medlem av ligning (5) indikerte en monoton økning i henhold til den variable [ A
] (2 ≤ En
≤ 8); inkorporering av [ A
= 2], som var den minimale verdi av [ A
], inn i likning (5) ga det følgende: (6)
forsterkning-negativ tilstand [ B Twitter / A
< 2] var sant for enhver verdi av [ A
] (2 ≤ En
≤ 8).
forsterkning-positiv var [ B Twitter / A
≥ 2] eller [ B
≥2 A
]. I dette tilfellet, [ Bx
+ 2 (1 - x
)] ble uttrykt som følger: (7)
≥ 2]; den høyre sideelement av ligningen indikerte en monoton økende. Inkorporering av [ A
= 8], som var den maksimale verdi av [ A
], inn i ligning (8) ga det følgende: (9)
forsterkning-positiv tilstand [ B Twitter / A
≥ 2] var sant for enhver verdi av [ A
] (2 ≤ En
≤ 8).
= (7 x
+ 1) /(3 x
+ 1)] ( A
= 8) ble utpekt som den positive området, og området nedenfor den rette linjen [ r
= x
+ 1] ( A
= 2) var det negative området. Den omsluttet av linjene [ r
= x
+ 1] og [ r
= (7 x
+ 1) /(3 område x
+ 1)] var en ubestemt sone avhengig av verdien av [ A
], som ble betegnet som den usikre området, og er definert som følger (figur 1 B) :( 10)
] var 0 (som ikke inneholder kreftceller), alle linjer konvergerte på koordinatene (0,1) basert på antagelsen om at ikke-kreftceller er genomisk stabil. Når [ x
] ble 1,0 (bestående av bare kreftceller), linjer gått gjennom koordinatene (1,2) uavhengig av verdiene for [ En
] og [ B
].
-DISH i dyrkede celler
] og [ B
] innhentet av HER2
-DISH i cellelinjer, eller ved hjelp av den beregnede [ B '
] fra [ En
] og målt [ r
].
-DISH hjelp FFPE- celleblokker og med digital PCR (tabell 2). HER2
signaler dukket opp som atskilte prikker i kjerner av HER2
-DISH (Fig 2A og 2B); HER2
kopiantall i individuelle celler var nesten to i LCL og fire i H522 celler. I motsetning til dette, SK-BR-3-celler viste gruppert HER2
signaler som var vanskelig å skille enkeltvis (figur 2C); deres tall ble vilkårlig satt til de maksimale verdier av 7, 14, og 21 i henhold til blokkstørrelser. Dermed vil en lavere HER2 Twitter /CEP17 forholdet ble oppnådd ved HER2
-DISH enn ved digital PCR.
] og CEP17 [ En
] kopiere numre ble beregnet ut fra HER2
-DISH som følger: [ A
= 41/20 = 2,05] og [ B
= 85/20 = 4,25]. Når verdiene av [ En
] og [ B
] ble brukt til likning (1), kan dataene beskrives ved referanselinjen [ r
= ( 4,25 x
+ 2 (1 - x
)) /(2,05 x
+ 2 (1 - x
))] (fig 2D ). I tilfelle av SK-BR-3-celler, CEP17 kopiantall [ En
] var [ A
= 83/20 = 4,15]; imidlertid, som beskrevet ovenfor, HER2
signaler ble samlet, noe som reduserte den beregnede kopiantall. Derfor søker [ A
= 4,15], [ r
= 5,69] og [ x
= 1.0] til likning (1), antatt HER2
kopiantall [ B '
] ble antatt å være [ B'
= 5.69 × 4,15 = 23,61]. Derfor [ A
= 4.15] og [ B '
= 23,61] whilethe referanselinjen var [ r
= (23,61 x
+ 2 (1 - x
)) /(4,15 x
+ 2 (1 - x
))] (fig 2E). Plottede digitale PCR data fra SK-BR-3-celler blandet med LCL lik denne linjen i stedet for [ r
= (19.50 x
+ 2 (1 - x
)) /(4,15 x
+ 2 (1 - x
))], som var basert på HER2
-DISH data som [ B
= 19,50]. Disse resultatene viser gyldigheten av TC chart-dvs. at den har tilstrekkelig quantitativity av digital PCR å skille HER2-forsterket fra ikke-forsterket celler
status for hver prøve ble bestemt av HER2-IHC og -DISH (figur 3A-3C). De estimerte verdiene var i samsvar med manuelle tellinger gjort av en patolog (KM). TC Hastigheten ble bestemt ut fra bilder ved å skille kjerner av kreft fra de ikke-kreftceller (Fig 3D).
-DISH-positive (rød), -equivocal (lilla) og -negativ (blå), samt HER2-IHC-positive (rhombi), -equivocal (trekanter), og -negativ ( kryssmerkene) prøver. Clinicopathological informasjon om representative og totale tilfeller er vist i tabell 3 og S1 Tabell hhv. Det var ingen HER2
-DISH-positive tilfeller under linjen [ r
= x
+ 1]; imidlertid en HER2
-DISH-negative ( ), to tvetydige (og), og tre positive (,)og,) tilfeller ble observert i usikre området . I tillegg var det en HER2
-DISH-negativ sak i positiv område (!). Tre tilfeller (,og*) viste markant høye digitale PCR verdier (28.25, 19.99 og 24.00, henholdsvis). I HER2
-DISH, disse tilfellene viste gruppert HER2
signaler (figur 3C) som var vanskelige å kvantifisere, som i SK-BR-3-celler. Eq (1) ble også uttrykt som følger: (11)
] ble beregnet ved bruk av målte [ r
] og [ x
] og målt [ A
], som ble bestemt ut fra tellinger av CEP17 signaler som oppnås ved å HER2
-DISH i 20 kreftceller (tabell 3 og S1 tabell). [ B '
] ble også oppnådd ved å måle [ r
] og [ En
] og [ x
= 1], som beskrevet for SK-BR-3-celler.
-DISH. Av de fire tvetydige tilfeller med IHC poengsum 2+, en () var positive og de andre (, og)) var negative, som bestemmes av HER2
-DISH. Den estimerte [ B Twitter / En
] verdien var tilsvarende ≥ 2,0 i tilfelleog < 2,0 i de tre siste, bortsett fra tilfelle), estimert [ B Twitter / En
] som var 2,12.
Evaluering av intratumoral HER2 heterogenitet i kirurgiske prøver
-DISH (positiv) ble plottet i det tvetydige område. Prøve nr 2-2 ble avsatt i det tvetydige område fordi området-2 dekket et forholdsvis stort område inneholdende både HER2-positive og -negative komponenter. Prøve nr 4-2 viste avvik mellom HER2-IHC (positiv) og HER2
-DISH (negativ) (S2 tabell), med de digitale PCR resultatene tilsvarende HER2
-DISH.
forsterkning-negative, -equivocal, og -positivt tilfeller ved hjelp av en todimensjonal scatter plott eller TC diagram, basert på målte verdier av HER2 Twitter /CEP17 forhold oppnås ved digital PCR [ r
] og TCR [ x
] uten konvensjonell HER2
-DISH eller HER2-IHC informasjon. Dermed en analyse av TC diagrammet er uavhengig av CEP17 og HER2
kopiere numre ([ En
] og [ B
]) i en enkelt kreftcelle, som kan normalt fås ved HER2
-DISH.
-DISH kan unngås til mindre enn 30% av tilfellene. Hyppigheten av HER2
forsterkning varierer over, magekreft histologiske typer, fra 20% -30% i intestinal til < 10% i den diffuse type [32]. Derfor er en effektiv screening metode som kreves i rutinemessig klinisk praksis, spesielt i land med høy forekomst av magekreft. TC diagrammet kan også brukes sammen med andre PCR-basert metode, for eksempel kvantitativ PCR for HER2
forsterkning [33].