Vertinti HER2 citavimo pagrindu. Matsusaka K, Ishikawa S Nakayama A, Ushiku T, Nishimoto A, Urabe, M, ir kt., (2016) Naviko turinys diagrama-Assisted, HER2 / redaktorius: Yves St-Pierre, INRS, Kanada Įstojo: lapkričio 7 2015; Priėmė: Balandžio 13, 2016 m Paskelbta įnešta 27 2016 Visos teisės saugomos: © 2016 Matsusaka et al. Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos Duomenų prieinamumas:. Visa reikalinga duomenys neviršija popieriaus ir jo Pagalbinė informacija failus finansavimas:. Šis darbas buvo atliktas kaip biobanków Japonijos projekto dalis (http://www.src.riken.jp/english/project/person/), kad parėmė švietimo ir mokslo ministerija, kultūros, sporto, mokslo ir technologijų (http://www.mext.go.jp/english/~~HEAD=pobj), Japonija agentūra medicinos mokslinių tyrimų ir plėtros (http: //www.amed.go Jp /lt /), o Dotacijos-in-pagalbos moksliniams tyrimams (KAKENHI) iš Japonijos draugijos mokslo skatinimo (https://www.jsps.go.jp/english/e-grants/). Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja Įvadas Skrandžio vėžys yra vienas iš labiausiai paplitusių piktybinių navikų ir trečiosios pagrindinė priežastis, dėl vėžio susijusių mirties visame pasaulyje [1]. Išplėstinė atvejų be operacinio įsikišimo prastos prognozės ir būtina daugiasrites gydymo metodus. HER2 yra 185-kDa transmembraninis glikoproteinas, kuris yra epiderminio augimo faktoriaus receptorių šeimai, ir veikia kaip tirozino kinazės receptoriais narys [2, 3]. Normaliomis ląstelių, HER2 baltymo veikia kaip signalo keitiklio metu ląstelių dauginimasis ar diferenciacijos laipsnį [4]; Tačiau ji turi onkogeninių savybių, ekspresija. Tai paprastai sukelia her2 Pacientams, sergantiems nerezekuojamas skrandžio vėžio, HER2 statusas turėtų būti tiriama naudojant mažų biopsijos pavyzdį. Kaip atstovaujami naujausių rekomendacijų HER2 tyrimo krūties vėžio American Society of Clinical Oncology (ASCO) /Koledžo Amerikos patologų (BŽŪP), imunohistocheminis (IHC) ir /arba in situ hibridizacijos (ISH) yra standartiniai metodai vertinant HER2 statusas [19], tačiau kiekvienas iš jų turi savo trūkumų. Pavyzdžiui, iš HER2 IHC veiksmingumas turi įtakos keletas veiksnių, kaip antai formalino fiksavimo procesą, o vertinimo sistema ne visada atkuriami ypač abejotinus atvejus, dėl kurių ISH rekomenduojama [19-25]. Ryškioje srityje HER2 Šiame tyrime mes taikomas micro-fluidics pagrįstą skaitmeninę PGR technologija. (Biomark; Fluidigm, Kembridžas, Jungtinė Karalystė) [26], siekiant nustatyti HER2 etikos taisyklės Šis tyrimas buvo patvirtintas universiteto Tokijuje institucinės etikos komitetas. Klinikiniai mėginiai su raštiško sutikimo buvo renkami pagal universiteto Tokijuje institucinius gaires dėl žmogaus audinių tyrimas. Iš viso 44 skrandžio vėžiu biopsijos iš 32 pacientų, tvarkomų vykdant įprastinę formalino fiksuoto parafiną įterptųjų (FFPE) buvo galima analizuoti. Visi biopsijos mėginiai buvo gautas endoskopijos ties Endoskopija ir endoskopinės chirurgijos skyrius. Keturi chirurginiai mėginiai, kurie buvo rezekcijos chirurginiu tuo departamento Virškinimo chirurgijos taip pat buvo analizuojami. Šie mėginiai buvo nustatytas 10% neutralus buferiniame formalino. Visi atvejai buvo diagnozuoti ne patologijos iš Tokijo ligoninėje universiteto. Dalys buvo susmulkinta 4 pm storio naudojant įprastus histologinius metodus; jie buvo renkami stikliukų ir naudojama hematoksilinu-eozino (HE) dažymo, HER2 IHC, ir HER2 imunohistocheminis imunohistocheminį dažymo buvo atliktas nuo FFPE audinio naudojant Ventana Benchmark XT (Roche Diagnostics) su 4D5 prieš HER2 antikūnų. Dažymo intensyvumo ir membranos reaktyvumas modeliai buvo vertinami naudojant DaKo vertinimo sistemą pagal ASCO /BŽŪP gaires [19]. Nėra membranos nusidažo pelnytas kaip 0; silpnumą arba vos juntamas /nekomplektinė membranos nusidažo pelnytas kaip 1+; neišsami ir /arba silpnas /vidutinis žiedinis membranos nusidažo pelnytas kaip 2+; ir visiškai ir intensyviai žiedinis membranos nusidažo pelnytas kaip 3+. HER2- HER2 Jei išgauti DNR iš biopsijos mėginių, 10 serijos skyriai supjaustyti esant 10 mikronų storio buvo padėtas ant stiklo paviršiaus HER2 -IHC ir HER2 gruntas rinkiniai stiprintuvo, HER2 parsisiųsti ir CEP17 rodomi 1 lentelėje Kiekvienas gruntas buvo sukurtas taip, kad PGR produktai, gauti buvo pakankamai trumpas (59 ir 65 bp), siekiant pašalinti įtaka DNR fragmentacijos į FFPE procese. Skaitmeniniai PGR buvo atliekama naudojant EP1 sistema su 48,770 skaitmeniniams matricų integruotas skysčiu grandinės (Fluidigm). Kiekvienas lustas pateikta 48 panelių, kurios buvo toliau padalytas į 770 reakcijos kamerose. Teigiamų liuminescencinių signalų kiekvieno skydelio numeris buvo naudojamas kiekybiškai skirtingus DNR sekas. Protokolas buvo aprašyti kitur [26]. Trumpai tariant, 4-iL reakcijos mišiniai buvo pasirengę kiekvienam tyrimui, kuriame buvo 1 × TaqMan genų ekspresijos pagrindinį mišinį, 1 × HER2 FAM ir chr17cent-VIC TaqMan zondai, ir 1 × imties pakrovimo reagento (Fluidigm). Reakcijos mišinys tolygiai paskirstytas į 770 reakcijos kamerose ir skaitmeniniams matricų buvo termo-cikliškai ant EP1 sistema FC1 Jutiklis ciklų. Du tikslinės regionai buvo nepriklausomai išplėstos ir 6-karboksifluoresceino ir VIC dažų signalus kamerose buvo užregistruoti kiekvieno PGR ciklo pabaigoje. 6-karboksifluoresceino teigiamus (HER2) ir VIC-teigiamas (CEP17) kamerų kiekvienoje skydelį skaičius buvo skaičiuojamas ir HER2 Visa skaidrių įvaizdžio AM skyriuose, kurie buvo tie tik prieš serijinių skyriuose DNR ekstrakcijai buvo nuskaitomi naudojant NanoZoomer (Hamamatsu fotonikos, Hamamatsu, Japonija). Duomenys buvo importuoti į Definiens audinių Studio 2.0 (http://www.tissuestudio.com) Nustatydama TCR. Pasirinktas regionas chirurginių egzempliorių buvo nuskaitomi naudojant BZ-710 mikroskopą (KEYENCE, Osaka, Japonija). Duomenys buvo importuoti į Hybrid ląstelių skaičius programinė įranga (BZ-H3C, KEYENCE). Duomenys, kurie išsamiai ląstelių skaičių importuotų vaizdus ir žymūs vėžiniai ne iš vėžinių ląstelių remiantis branduolio dydis buvo automatiškai sukurtas eksperimentus kuriant TC diagramas Mobilaus ryšio linijas. kontrolės eksperimentų, H522 plaučių vėžio ir SK-BR-3 krūties vėžio ląstelių linijas buvo gauta iš amerikiečių tipas kultūros kolekcijos (Manassas, VA, USA). GM18997 Epstein-Barr virusas transformuotos limfoblastoidinio ląstelių linija (LCL) buvo gauta iš Coriell Biorepository (https://catalog.coriell.org/). H522 ląstelės ir LCL buvo auginamos Roswell Park memorialinis institutas-1640 terpė (Nacalai Tesque, Kioto, Japonija), kuriame yra 10% vaisiaus galvijų serumo (Sigma-Aldrich, St Louis, Misūrio valstija, JAV) ir 1% penicilinui streptomicino tirpalo ( Nacalai Tesque). SK-BR-3 ląstelės buvo auginamos Dulbecco modifikuota Eagle terpė /kumpiai F12 (Nacalai Tesque, Japonija) su 10% vaisiaus galvijų serumo ir 1% penicilinui /streptomicino. Ląstelės buvo auginamos 37 ° C temperatūroje atmosferoje sudėtyje yra 5% CO 2. DNR buvo išskirta naudojant QIAquick DNR mini rinkinį (QIAGEN). FFPE H522, SK-BR-3, ir LCL mobilieji blokai buvo parengta, HER2 Genomo DNR iš H522 ir SK -Br-3 ląstelės ir LCL buvo nustatomas taip, kad 50 ng /mikrol, koncentraciją. H522 ir LCL genominės DNR buvo sumaišyti aštuonių žingsnių, esant šiems tūrio santykis: 8: 2, 7: 3, 6: 4, 5: 5, 4: 6, 3: 7, 2: 8 ir 1: 9 (H522 : LCL). SK-BR-3 ir LCL genominės DNR buvo sumaišyti keturiais etapais, esant šiems tūrio santykis: 8: 2, 6: 4, 4: 6, ir 2: 8 (SK-BR-3: LCL). Chi kvadrato testai buvo taikomi palyginti skaičių tarp HER2 Rezultatai raida TC diagramą skaitmeniniai PGR duomenys HER2 Šiame tyrime [ X Eq (1) buvo pavaizduoti grafiškai kaip TC diagramą, su [ R apibrėžta HER2 Abi lygties pusės (2) buvo padalytas [ Ax derinant su periodų (1) ir (3), gautos taip: (4) (5) EQ (5) buvo sąlyga prilygsta [, B Todėl kai EQ (6) buvo patenkintas, HER2 Kita vertus, apibrėžimas, HER2 Eq (7) buvo perdirbami toje pačioje būdu kaip AKS (2) - (5), ir buvo išreikštas taip: (8) Eq (8) buvo sąlyga prilygsta [ B pervežimas / A pervežimas ≥ 2]; dešinėje pusėje narys lygtį nurodė monotoniška padidėjimą. Įtraukimas [ Taigi, kai EQ (9) buvo patenkintas, HER2 AKS (6) ir (9) buvo atidedamos TC diagramos, virš linijos plotas kreivumą padidės [ R [ x palyginimas skaitmeninio PGR ir HER2 patvirtinti teorinis EQ (1) TC grafikas pagal laipsniško mišinio sistemos ląstelių linijas. EQ (1) buvo gauta naudojant faktines išmatuotų verčių [ pervežimas] ir [, B Santykinis kopijavimo numeriai HER2 parsisiųsti ir CEP17 ( HER2 H522 ir SK-BR-3 ląstelių genomo DNR buvo sumaišytas su kad į laipsniško būdu LCL ir mišinių buvo analizuojami skaitmeninio PGR. Be H522 ląstelių HER2 Concordance tarp TC diagramos skaitmeninės PGR ir HER2 IHC /. - dish klinikinių biopsijos mėginių Skrandžio vėžio biopsijos mėginiai (n = 44) iš 32 pacientų buvo analizuojami skaitmenine PGR. HER2 Skaitmeniniai PGR duomenys ir TCR kiekvieno atveju buvo atidedamos TC diagrama (4 pav), įskaitant duomenis už HER2 Teoriškai apskaičiuota [, B Keli atvejai buvo įvertintas aštuonių pacientų (4 pav ir S1 lentelė). Visi atvejai kiekvienam pacientui parodė tuos pačius rezultatus indą ir skaitmeninės PGR išskyrus pacientus 24 (PT-24); viena iš penkių atvejais ( ) buvo teigiamas ir du ( ir ) buvo neigiami abiejų matavimų. Dvi bylos neigiamas patiekalas buvo skirta teigiamas (!) ir abejotini ( ) srityse, TC diagrama (3 lentelė ir S1 lentelė). Iš viso 22 HER2 IHC atvejų buvo balas 2+ (4 lentelė), kurį sudaro trys teigiamą, 15 neigiamą, ir keturis Neaiškias atvejus remiantis TC diagramos skaitmeninio PGR. Teigiami ir neigiami rezultatai buvo visiškai sutinkantis su tais HER2 naviką HER2 heterogeniškumas buvo įvertintas pagal HER2-IHC /-DISH ir skaitmeninis PGR (5 pav S1 pav ir S2, lentelė) derinys. Case_1, 2 ir 4 parodė ryškų naviką heterogeniškumas, susidedanti iš HER2 IHC-teigiamų ir neigiamojo pažeidimų klasterius, o Case_3 bendrai parodė dviprasmišką HER2 IHC išraiška modelis. Svarbiau yra tai, HER2 teigiamas pažeidimai buvo pasiekiama iš skrandžio spindžio į Case_1 (-2,-3), Case_2 (-1,-2), ir Case_4 (-4). Visi HER2 IHC /-DISH teigiami atvejai buvo brėžiamas teigiamo srityje. Trys pavyzdžiai Case_3 (-1, -2, -3) rodo HER2 IHC (neaiškus) ir HER2 Diskusijos tyrimas yra pirmasis bandyti skrandžio vėžio priskyrimas HER2 skaitmeninis PGR metodas buvo taikomas nuo kopijavimo skaičius viruso [28], vaisiaus chromosomų Aneuploidijos [29] vertinimo ir Onkogeny įvairiose vėžio audiniuose [30, 31]. Pagrindinė problema, kuri turi būti įveikti yra neapdorotų duomenų pagal naviko turinį egzempliorių korekcija; skrandžio vėžio audiniai paprastai yra didesnes sumas ne vėžiniai ląstelių infiltracija, pvz tarpo arba uždegiminių ląstelių. Šiame tyrime mes naudojome vaizdo analizę gauti pusiau automatinis įvertinti naviko ląstelių kiekio ir sukūrė TC diagramą klasifikuoti duomenis į tris kategorijas-I.E., Papildyta, ne sustiprina, ir abejotinus. Tai gali būti įmanoma išgryninti vėžines ląsteles iš FFPE audinių sekcijų microdissection, bet tai per sunkus įprastinės klinikinės praktikos, net jei ji yra tikslesnė teorija. Naudojant šį metodą biopsijos, kad HER2 IHC-abejotinus atvejus (2+) buvo sumažintas nuo 22 iki šešių skaičių, tokiu būdu už patvirtinimą poreikį, HER2 Yra papildomų privalumų skaitmeninio PGR protokolą. Pirma, ji yra paprasta, palyginti su ISH, kuris reikalauja įgūdžių ir darbo jėgos, apimanti kelis žingsnius. Antra, mažiau atvejų yra reikalingi patvirtinimo, nei yra reikalinga HER2
genų amplifikacija yra esminė terapinio sprendimų priėmimą dėl išplitusio arba metastazavusio skrandžio vėžio. Paprastas metodas, kuris taikomas mažų, formalino fiksuotas, parafino-embedded biopsijos pageidautina kaip priedas prie arba kaip dabar naudojamą HER2 imunohistocheminiu ir in situ hibridizacijos protokolų pakaitalas. Šiame tyrime mes sukūrėme micro-fluidics pagrindu skaitmeninį PGR metodą, leidžiantį nustatyti, HER2 parsisiųsti ir 17 chromosomos Centromera (CEP17) kopijuoti numerius ir įvertinti naviko turinio santykis (TCR). HER2
/CEP17 santykis nustatomas pagal tris kintamuosius-TCR ir absoliučių kopijavimo skaičių HER2 parsisiųsti ir CEP17-nagrinėjant navikines ląsteles; tik pastarųjų dviejų santykis gali būti gaunamas skaitmeninio PGR naudojant visą bandinį be valymo auglio ląsteles. TCR buvo nustatomas pagal pusiau-automatiniu vaizdo analizės. Mes sukūrėme navikas Turinio diagramą, kuri yra stačiakampių koordinačių plokštumoje, susidedantis iš HER2
/CEP17 skaitmeninis PGR duomenys ir TCR, kad apibrėžia amlifikuoti, ne sustiprina, ir abejotinas sritis. Taikant šį metodą, 44 klinikinių skrandžio vėžys biopsijos mėginiai buvo klasifikuojami kaip papildyta (n = 13), ne-amplifikuotas (n = 25), arba abejotini (n = 6). Palyginimui, 11 mėginiai buvo teigiami, 11 buvo neigiamas, o 22 buvo nevienareikšmiškai imunohistocheminis. Taigi, mūsų romanas metodas sumažino abejotinus mėginių skaičių nuo 22 iki 6, taip išvengti jo patvirtinimą fluorescencijos arba dvigubos zondo poreikis situ hibridizacijos ir < 30% atvejų. Naviko turinys topuose padeda skaitmeninis PGR analizė taip pat taikomas kelių vietų chirurginiu rezekcijos audiniuose. Šie rezultatai rodo, kad ši analizė yra naudinga alternatyva HER2 imunohistocheminiu skrandžio vėžio, kuris gali tarnauti kaip automatinio vertinimo HER2
statuso
CEP17 Skaitmeninis PGR analizė skrandžio vėžio biopsijos. PLoS ONE 11 (4): e0154430. Doi: 10,1371 /journal.pone.0154430
geno ekspresija, kuris buvo pastebėtas keliose tipų piktybinio auglio [5], įskaitant krūties vėžio [6, 7], seilių liaukų adenokarcinomos [8], šlapimo pūslės vėžio [9] , ir skrandžio vėžys [10]. HER2 ekspresija skrandžio vėžio sudaro 8% -31% visų atvejų [11-15]. Trastuzumabo skrandžio vėžio bandymus, trastuzumabu (Roche Diagnostics, Bazelis, Šveicarija) -a žmogiškas anti-HER2 monokloninių antikūnų padidino išgyvenamumas pacientų, sergančių HER2 teigiamas skrandžio vėžio, kai jis vartojamas kartu su chemoterapija [16], ir buvo taip pat patvirtino dėl krūties vėžio [17, 18] gydymui. Todėl vertinant HER2 būklės yra esminis aspektas skrandžio vėžio gydymo.
dvejopo zondas ISH ( HER2
-DISH) HER2 parsisiųsti ir 17 chromosomos Centromera (CEP17) kopijuoti numeriai gali būti atpažintas kaip signalų pagal šviesos mikroskopas visam regionui pavyzdį. Tačiau, nors šis metodas yra pranašesnis jautrumą, jis yra brangus ir gana daug laiko
/CEP17 kopijų skaičiaus santykiu. Skaitmenine PGR, DNR šablono yra padalintas į 770 vienetų nanoliter reakcijos kamerų, su numatytai koncentracijai 0-1 molekulės per kamerą. Dvigubas spalvos tikslinių ir pagalbos genai yra vienu metu PGR sustiprina ir jų kopijų skaičius yra apskaičiuojamas skaičiavimo kameras teigiamų signalų. Tai labai tvirtas metodas leido HER2 parsisiųsti ir CEP17 kopijų skaičius naudojant skirtingus gruntas rinkinius palyginimas. Šio tyrimo tikslas buvo patvirtinti skaitmeninės PGR technologija galimybes analizei skrandžio vėžio biopsijos. Tačiau, viena problema su šiuo požiūriu yra tai, kad audinys paprastai yra ne-vėžinių trakto stromos ląstelių, kurios trukdo su molekulinės analizės. Norėdami išspręsti šią problemą, mes sukūrėme vadinamos Naviko turinys (TC) diagramą, pagal kurią paskirstoma duomenis į papildyta, ne sustiprina, ir abejotinus kategorijas dvimatis sklaida sklypas. Tikslas buvo sukurti automatizuotas priemones įvertinti HER2
statusas, su TC topuose padeda HER2
/CEP17 skaitmeninis PGR analizė tarnauja kaip pirmas žingsnis.
Medžiagos ir metodai
Klinikiniai skrandžio vėžio biopsijos mėginiai ir chirurginiai pavyzdžiai
-DISH.
Dish dažymo ir vertinimas
-DISH buvo atliktas FFPE audinių naudojant HER2 DNR DISH rinkinį (Roche Diagnostics) pagal gamintojo nurodymus, o bandiniai buvo įvertintas šviesos mikroskopu. HER2
signalai pasirodė kaip juodų taškelių ar grupių, ir CEP17 signalai pasirodė kaip raudonus taškus. Dvidešimt nepersidengiantiems vėžio branduoliai buvo įvartį, HER2 parsisiųsti ir CEP17 signalai ir HER2
genų amplifikacija buvo klasifikuojama kaip rekomenduojama Asco /BŽŪP gaires [19]; teigiamas, [, JOS
2 /CEP17 santykis ≥ 2,0] IR /ARBA [vidutinė , JOS
2 egzemplioriaus numeris ≥ 6,0 signalus /ląstelę]; abejotini, [, JOS
2 /CEP17 santykis < 2.0] ir [vidutinė , JOS
2 kopija skaičius ≥ 4,0 ir < 6,0 signalai /mobilieji]; neigiamas, [, JOS
2 /CEP17 santykis < 2.0] ir [vidutinė , JOS
2 kopija skaičius < 4,0 signalai /mobilieji].
paruošimas DNR FFPE klinikinės medžiagos
-DISH. Naviko turinys buvo patvirtintas prieš ir po ruožais nudažant gretimų skaidres su HE. Nuo vieno parafino blokas paprastai yra keletas vienetų biopsijos mėginio, individualūs egzemplioriai buvo izoliuoti naudojant stiklo pjovimo. Norėdami išgauti DNR iš chirurginės rezekcijos egzempliorių, 5 serijos skyriai iš kiekvienos atstovas audinių blokas buvo sumažinti ne mažiau kaip 10 mikronų storio, kurie buvo pateikti į lapo, pagamintas iš politetrafluoretileno (PTFE, Sanplatec, Osaka, Japonija). Membrana yra cheminis atsparumas už ksileno pagrindu deparaffinization, ir yra lengvai supjaustyti į gabalus. Tyrime, įvairios dalys buvo klipas iš lapų pagal HER2 profilio. Stiklo arba PTFE vienetų buvo surinkti į 2,0 ml mėgintuvėlį ir DNR buvo išskirta naudojant QIAamp DNR FFPE audinių rinkinį (QIAGEN, Valensija, Kalifornija, JAV).
HER2
kopijų skaičiaus vertinimas skaitmeninių PGR
/CEP17 kopijų skaičiaus santykis buvo apskaičiuojamas [27].
Įvertinimas naviko turinio santykis (TCR) pervežimas
-DISH vertinimas.
Palaipsniui maišymas su LCL.
statistines analizes
-DISH ir skaitmeninės PGR H522 ir SK-BR-3 ląstelių ir LCL. buvo laikomi skirtumai turi būti reikšmingas, jeigu P
< 0,05
/CEP17 santykis buvo nustatytas remiantis trijų kintamųjų:. TCR ir absoliuti kopijavimo numeriai HER2
ir CEP17. Tik santykinės proporcijos pastarųjų dviejų gali būti gaunamas skaitmeninio PGR naudojant auglio mėginį be išskiriant atskirus ląsteles. HER2
/CEP17 santykis gaunamas skaitmeninis PGR [ R
] buvo išreikštas taip, remiantis prielaida, kad genų kopijų skaičius vėžinių ląstelių yra vienodos ir kad ne vėžinės ląstelės yra genetiškai stabilus diploidinių chromosomų (pav 1A ir 1B) :( 1) kai [ R
] yra santykis HER2
į CEP17 gautas skaitmeninės PGR (0 < R
); [ X
] yra TCR (0 ≤ X
≤ 1); [
] yra CEP17 kopija skaičius viename vėžio ląstelių (0 ≤
); ir [, B
] yra HER2
kopija skaičius viename vėžio ląstelių (0 ≤ , B
). Toliau dvimatis scatterplot atstovaujamos Eq (1) yra vadinamas TC diagramos.
] buvo nustatytas nuo HE-tamsintas egzempliorių naudojant atvaizdą analizės programinė įranga, pavyzdžiui, audinių Studio vaizdo analizės programinė įranga už biopsijos ir hibridinių ląstelių skaičius programinė įranga chirurginių egzempliorių, atitinkamai; ir [ R
] ir [ X
] buvo nustatyti atlikus matavimus.
] ir [ x
] kaip vertikalių ir horizontalių ašių, atitinkamai (pav 1b). Iš santykis [, B
/
] buvo pamatinė vertė nustatant HER2
genų amplifikacija. Iš tiesų tikrasis kopija skaičius CEP17 [
] ir HER2
[, B
] negalėjo būti nustatyta neatliekant HER2
-DISH. Tačiau praktinis vertinimas HER2 parsisiųsti ir CEP17 kopijuoti numerius patiekalas nustatė, kad [
] svyravo nuo 2,0 iki 6,0 (nuo 40 iki 117 CEP17 signalų tarp 20 vėžio ląstelių S1 ir S2 Stalai) ir niekada neviršijo 8,0 klinikinių skrandžio vėžio pavyzdžius. Pagal mūsų patirtį 164 iš eilės atvejais skrandžio vėžiu (Ushiku T ir kt
. Neskelbtų duomenų), CEP17 kopija skaičius yra 1,0-5,7, mediana 2,5 ir monosomiją, apibrėžiama kaip [ A
< 1.5], yra gana retas tik dviem atvejais (1,2%). Taigi diapazonas [
] buvo nustatytas kaip [2 ≤ A
≤ 8] su saugos atsarga.
amplifikacija-neigiami [, B
/
< 2] arba [, B
< 2,
]. [ Bx
+ 2 (1 - X
)], buvo išreikšti taip: (2)
+ 2 (1 - x
)] :( 3)
/
< 2]. Dešinėje pusėje narys Eq (5) nurodė monotoniška padidinti atsižvelgiant į kintamojo [
] (2 ≤
≤ 8); įtraukimas [
= 2], kuris buvo minimali vertė [
], į lygtį (5) davė taip: (6)
amplifikacija neigiamas sąlyga [, B
/
< 2], buvo tiesa, bet [vertę,
] (2 ≤
≤ 8).
amplifikacija teigiamas buvo [, B
/
≥ 2] arba [ B
≥2
]. Šiuo atveju, [ Bx
+ 2 (1 - x
)] buvo išreikštas taip: (7)
= 8], kuris buvo didžiausia vertė [
], į lygtį (8) davė taip: (9)
amplifikacija teigiamas sąlyga [, B
/
≥ 2], buvo tiesa, bet A [vertę
] (2 ≤
≤ 8).
= (7 x
+ 1) /(3 dalis x
+1)] (
= 8), buvo įvardijamas kaip teigiama srityje, ir žemiau tiesės [ R
= x
+ 1] (
= 2) buvo neigiamas plotas plotas. Teritorija uždara linijomis [ R
= X
+ 1] ir [ R
= (7 X
+ 1) /(3 x
+1)] buvo neterminuota zona priklausomai nuo [
], kuri buvo paskirta kaip dviprasmiška srityje ir apibrėžti taip (pav 1B vertės) :( 10)
] buvo 0 (kurių sudėtyje nėra vėžines ląsteles), visos linijos susiliejęs koordinates (0,1), remiantis prielaida, kad ne vėžinės ląstelės yra genomically stabili. Kai [ X
] buvo 1,0 (sudarytas iš tik vėžines ląsteles), linijos pro koordinačių (1,2), nepriklausomai nuo vertės [ pervežimas] ir [ b punktas
].
-DISH kultūroje ląstelių
] gauti HER2
-DISH ląstelių linijų, arba naudojant apskaičiuotas [, B
] nuo [
] ir matuojamas [ R
].
/CEP17) į LCL ir H522 ir SK-BR-3cells vertino HER2
-DISH naudojant FFPE mobiliuosius blokus ir skaitmeninės PGR (2 lentelė). HER2
signalai pasirodė kaip atskirų taškų branduolyje HER2
-DISH (pav 2A ir 2B); HER2
kopija skaičius atskiruose langeliuose buvo beveik du LCL ir keturi H522 ląsteles. Priešingai, SK-BR-3 ląstelės parodė susitelkę HER2
signalai, kad buvo sunku atskirti atskirai (pav 2c); jų skaičius buvo savavališkai nustatyti didžiausių vertybių 7, 14, ir 21, pagal klasterių dydžių. Taigi, mažesnis, HER2
/CEP17 santykis buvo gautas, HER2
-DISH nei skaitmeninio PGR.
[, B
] ir CEP17 [
] Kopijuoti numeriai buvo apskaičiuotos iš HER2
-DISH taip: [
= 41/20 = 2.05] ir [, B
= 85/20 = 4,25]. Kai [ pervežimas] ir [, B
] buvo taikomi Eq (1), duomenys gali būti aprašyti atskaitos linijos [ R
= vertybės ( 4,25 x
+ 2 (1 - x
)) /(2,05 x
+ 2 (1 - x
))] (pav 2D ). Atsižvelgiant į SK-BR-3 ląstelių atveju CEP17 kopija numeris [
] buvo [
= 83/20 = 4.15]; Tačiau, kaip aprašyta pirmiau, HER2
signalai buvo susitelkę, kuris sumažino apskaičiuotą kopijos numeris. Todėl, taikant [
= 4.15], [ R
= 5.69] ir [ X
= 1,0] lygtį (1), apskaičiuota, HER2
kopija numeris [, B
] buvo laikomas [, B
= 5.69 × 4.15 = 23.61]. Taigi, [
= 4.15] ir [, B
= 23.61] whilethe atskaitos linija buvo [ R
= (23.61 X
+2 (1 - x
)) /(4,15 x
+ 2 (1 - x
))] (pav 2E). Brėžiamas skaitmeniniai PGR duomenys SK-BR-3 ląstelių, sumaišytų su LCL atitiko šioje eilutėje, o ne [ R
= (19.50 X
+ 2 (1 - X
)) /(4,15 x
+ 2 (1 - x
))], kuri buvo grindžiama HER2
-DISH duomenų, už kuriuos [ B
= 19,50]. Šie rezultatai rodo, jog TC topuose ty pagrįstumą, kad turi pakankamai quantitativity skaitmeninės PGR atskirti HER2 papildyta iš ne sustiprina ląstelių
statusas kiekvieno pavyzdžio nulėmė HER2 IHC ir -DISH (pav 3A-3C). Apytikres vertes atitiko rankinių grafų atliktų patologas (km). TC lygis buvo nustatomas iš vaizdų, išskiriant branduolius vėžinių nuo tų ne vėžinių ląstelių (pav 3D).
-DISH teigiamas (raudona), -equivocal (violetinė) ir neigiamojo (mėlyna), taip pat HER2 IHC teigiamas (rhombi), -equivocal (trikampiai) ir -neigiama ( kryžminiai ženklai) mėginiai. Klinikos informacija reprezentatyvių ir visų atvejų yra parodyta 3 lentelėje ir S1 lentelėje atitinkamai. Nebuvo HER2
-DISH teigiamas atvejai žemiau linijos [ R
= X
+ 1]; Tačiau vienas, HER2
-DISH neigiamas ( ), du abejotinas (ir) ir trys teigiami (,)ir,) atvejų buvo pastebėtas neaiškus srityje , Be to, ten buvo vienas, HER2
-DISH neigiamas atvejis teigiamą srityje (!). Trys atvejai (,ir*) parodė labai didelius skaitmeninius PGR vertes (28.25, 19.99 ir 24.00, atitinkamai). Be HER2
-DISH, šie atvejai parodė, susitelkę, HER2
signalai (pav 3c), kurie buvo sunku įvertinti, kaip SK-BR-3 ląsteles. Up (1) Taip pat buvo išreikštas taip: (11)
/
] buvo apskaičiuojamas taikant išmatuota [ R
] ir [ x
] ir matuojamas [
], kuris buvo nustatytas pagal kaltinimus dėl CEP17 signalus, gautus HER2
-DISH 20 vėžinių ląstelių (lentelėje 3 ir S1 lentelė). [, B
] taip pat buvo gauti matuojant [ R
] ir [
] ir [ X
= 1], kaip aprašyta SK-BR-3 ląstelės.
-DISH. Iš keturių abejotinus atvejus su IHC rezultatas 2+, vienas () buvo teigiamas ir kiti (, ir)) buvo neigiamas, kaip nustatyta HER2
-DISH. Apskaičiuota [, B
/
] vertė buvo atitinkamai ≥ 2.0 teismoir < 2.0 Pastaruoju trijų, išskyrus teismo), apskaičiuota [, B
/
], iš kurių buvo 2,12.
vertinimas naviką HER2 heterogeniškumo chirurginėms egzempliorių
-DISH (teigiamas) buvo brėžiamas į dviprasmiška srityje. Pavyzdys-2 buvo brėžiamas į dviprasmiška srityje, nes regionas-2 apėmė gana didelį plotą, kuriame yra tiek HER2 teigiamą ir neigiamojo komponentus. Pavyzdys-2 parodė skirtumus HER2 IHC (teigiamą) ir HER2
-DISH (neigiamas) (S2 lentelė), su skaitmeniniu PGR rezultatus, atitinkančius HER2
-DISH.
amplifikacijos-neigiamas, -equivocal ir -positive atvejais naudojant dvimatę sklaidą sklypas arba TC diagramą, remiantis išmatuotų verčių, HER2
/CEP17 santykis gautas skaitmeninės PGR [ R pervežimas] ir TCR [ x
] be įprastinių HER2
-DISH ar HER2 IHC informacija. Taigi, TC diagramos analizė yra nepriklausoma nuo CEP17 ir HER2
kopijuoti numerius ([
] ir [, B
]) per vieną vėžio ląstelės, kurios gali paprastai galima gauti HER2
-DISH.
-DISH gali būti pašalinta mažiau kaip 30% atvejų. Iš dažnis HER2
stiprinimas skiriasi visoje skrandžio vėžio histologinių tipų, nuo 20% -30% žarnyno į < 10%, difuzinio tipo [32]. Todėl efektyvi atrankos metodas yra būtinas įprastinėje klinikinėje praktikoje, ypač tose šalyse, kuriose yra didelis paplitimas skrandžio vėžio. TC diagrama taip pat gali būti naudojamas kartu su kitais PGR pagrįstas metodas, pavyzdžiui, kiekybinis PCR už HER2
stiprinimas [33].