Sažetak pregled
Procjena HER2 pregled gena pojačanje je bitan sastojak terapijski odlučivanja za napredne ili metastatski karcinom želuca. Jednostavna metoda koja se primjenjuje na male, formalinom fiksna, parafin uklopljenih uzorka biopsije je poželjno kao dodatak ili kao zamjena za trenutno koristi HER2 imunohistokemijski i in situ hibridizacije protokola. U ovom istraživanju, razvili smo Microfluidics-based digitalni PCR metodu za određivanje HER2 pregled i kromosom 17 centromere (CEP17) kopirati brojeve i procjene omjera sadržaja tumora (TCR). omjer HER2 pregled /CEP17 određuje tri varijable-TCR i apsolutni kopirati brojeve u HER2 pregled i CEP17-uvidom tumorskih stanica; samo omjer posljednja dva mogu se dobiti digitalnim PCR korištenjem cijeli uzorak bez pročišćavanja tumorske stanice. TCR je određena poluautomatske analize slike. Mi smo razvili tumor na sadržaj grafikon, što je zrakoplov pravokutnih koordinata koja se sastoji od HER2 pregled /CEP17 digitalni PCR podaci i TCR koji ocrtava umnoženi, ne pojačavaju i dvosmisleni područja. Primjenom ove metode, 44 kliničkih uzoraka biopsije želučani rak su klasificirani kao pojačani (n = 13), a ne pojačani (n = 25) ili dvosmisleni (n = 6). Za usporedbu, 11 uzoraka bilo je pozitivno, 11 su bili negativni, a 22 su dvosmislenim imunohistokemijski. Dakle, naša nova metoda smanjen broj dvoznačnim uzoraka od 22 do 6, čime se eliminira potreba za potvrdu fluorescencijom ili dual-sonde in situ hibridizacije na < 30% slučajeva. Tumor sadržaj grafikon uz pomoć digitalnog PCR analiza je također odnosi na više lokacija u kirurškim reseciranog tkiva. Ovi rezultati pokazuju da je ova analiza je korisna alternativa HER2 imunohistokemijski na želučanih karcinoma koji može poslužiti kao temelj za automatizirano ocjenjivanje HER2 pregled statusa pregled Citation. Matsusaka K, Ishikawa S, Nakayama A, Ushiku T, Nishimoto A, Urabe M, et al. (2016) Tumor Sadržaj Chart-Assisted HER2 /pregled CEP17 Digitalni PCR analiza raka želuca uzorka biopsije. PLoS ONE 11 (4): e0154430. doi: 10,1371 /journal.pone.0154430 pregled Urednik: Yves St-Pierre, INRS, Kanada pregled Primljeno: 7. studenog 2015. godine; Prihvaćeno: 13. travnja 2016; Objavljeno: 27. travanj 2016 pregled Copyright: © 2016 matsusaka et al. Ovo je otvoreno pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan pregled dostupnost podataka. Sve relevantne podaci u radu i njegove popratne podatke datoteka pregled Financiranje:. Ovaj rad je provedeno u sklopu BioBank Japan projekta (http://www.src.riken.jp/english/project/person/), koji je podržan od strane Ministarstva obrazovanja, kulture, športa, znanosti i tehnologije (http://www.mext.go.jp/english/~~HEAD=pobj), Japan Agencija za medicinska istraživanja i razvoj (http: //www.amed.go .jp /hr /), a Potpore-u-Aid za znanstvena istraživanja (KAKENHI) iz Japana društva za promicanje znanosti (https://www.jsps.go.jp/english/e-grants/). U financijeri nisu imali ulogu u studiju dizajna, prikupljanja i analize podataka, Odluka o objavi, ili pripremu rukopisa pregled U konkurenciji interese.. Autori su izjavili da ne postoje suprotstavljeni interesi pregled Uvod pregled rak želuca je jedan od najčešćih malignih tumora i treći vodeći uzrok karcinoma povezanih smrti širom svijeta [1]. Napredno slučajevi bez operativnog zahvata imaju lošu prognozu i zahtijevaju multidisciplinarnih pristupa liječenju. HER2 je 185-kDa transmembranski glikoprotein koji je član faktora epidermalnog rasta obitelj receptora i djeluje kao receptor tirozin kinaze [2, 3]. U normalnim stanicama, HER2 protein djeluje kao signalni transduktor vrijeme stanične proliferacije i diferencijacije [4]; Međutim, on ima onkogene svojstva pri prejakoj ekspresiji. To je obično uzrokovana HER2 pregled gena pojačanje, koje je objavljeno u nekoliko tipova malignih tumora [5], uključujući rak dojke [6, 7], slinovnica adenokarcinom žlijezda [8], rak mokraćnog mjehura [9] i rak želuca [10]. HER2 želučani karcinom račun za 8% -31% svih slučajeva [11-15]. U trastuzumab za rak želuca postupku, trastuzumab (Roche Diagnostics, Basel, Švicarska) -a humanizirano anti-HER2 monoklonskih antitijela-povećanu stopu preživljavanja kod pacijenata s HER2-pozitivnih želučanog raka kada se primjenjuju u kombinaciji s kemoterapijom [16], te je također odobren za liječenje raka dojke [17, 18]. Ocjenjivanje stanja HER2 je, dakle, bitan aspekt želučane terapije protiv raka. Pregled Za pacijente s kirurški odstraniti želučanog karcinoma, HER2 status treba biti ispitan pomoću malog biopsije uzorak. Kao što je prikazano u najnovijim preporukama za ispitivanje HER2 kod raka dojke strane American Society of Clinical Oncology (Asco) /College of American patologa (CAP), imunohistokemijski (IHC) i /ili in situ hibridizacija (ish) su standardne metode za procjenu HER2 stanje [19], ali svaka ima svoja ograničenja. Na primjer, učinkovitost HER2-IHC utječe nekoliko faktora kao što su formalin postupak fiksiranja, a sustav bodovanja nije uvijek ponovljiv osobito dvoznačnim slučajevima za koje se preporuča ISH [19-25]. U jakom polju HER2 pregled, dual-sonda ISH ( HER2 pregled -DISH), HER2 pregled i kromosom 17 centromere (CEP17) kopirati brojevi mogu se otkriti kao signali pod svjetlom mikroskop na cijelom području uzorka. Međutim, iako je ova metoda ima vrhunske osjetljivosti, što je skupo i relativno dugotrajan pregled U ovoj studiji, koja se primjenjuje smo Microfluidics-based digitalni PCR tehnologije. (Biomark; Fluidigm, Cambridge, UK) [26] kako bi se utvrdilo omjer HER2 pregled /CEP17 broj kopija. U digitalnom PCR DNA kalupa je podijeljen u 770 komada u nanoliter reakcijskih komora, uz očekivani koncentraciji od 0-1 molekule po komori. Dual-boji ciljne i referentni geni su istovremeno PCR amplifikaciju i njihov broj kopija se izračunava računajući komore sa pozitivnim signalima. Ova vrlo robusna metoda omogućila je usporedbu HER2 pregled i CEP17 brojevi kopiranja pomoću različitih primera seta. Cilj ovog istraživanja bio je utvrditi izvedivost digitalne PCR tehnologije za analizu želučanom biopsijom raka primjeraka. Međutim, problem s ovim pristupom je da je tkivo obično sadrži ne-kancerogene stanice strome koje ometaju molekularnim analizama. Da bi prevladali taj problem, razvili smo dvodimenzionalni raspršiti zemljište u tekstu se tumor sadržaj (TC) grafikon koji dodjeljuje podataka u pojačan, ne pojačavaju i dvoznačnim kategorijama. Cilj je bio razviti automatizirani način ocjenjivanja HER2 pregled statusa i TC grafikon potpomognuto HER2 pregled /CEP17 digitalni PCR analiza služi kao prvi korak. Pregled Materijali i Metode Izjave za etiku Ova studija je odobren od strane Sveučilišta u Tokiju Institucionalni Etičkog povjerenstva. Klinički uzorci sa pismenog pristanka su prikupljeni u okviru Sveučilišta u Tokiju institucionalnih smjernica za proučavanje ljudskih tkiva. Pregled kliničkim uzorcima želučane biopsije raka i kirurške primjerci Ukupno, 44 želučane biopsije raka uzorci od 32 bolesnika obrađenih rutinskom formalinom fiksne parafinske-embedded (FFPE) bili dostupni za analizu. Svi Uzorci biopsije dobivene endoskopski na Odjelu za endoskopiju i endoskopsku kirurgiju. Četiri kirurške primjerci, koji su resected kirurškim na Odjelu za gastrointestinalna kirurgija, također su analizirani. Ovi uzorci su fiksirane u 10% neutralno puferirani formalin. Svi predmeti su dijagnosticirana u Zavodu za patologiju Sveučilišta u Tokiju bolnice. Rezovi na debljine 4 um pomoću uobičajenih histološkim tehnikama; one su sakupljena na stakalca i koristi se za Hematoxylin-eozinom (HE) bojenje, HER2-IHC i HER2 pregled -DISH. pregled Imunohistokemija pregled Imunohistokemijsko bojanje je provedeno na FFPE tkivu pomoću Ventana Benchmark XT (Roche Diagnostics) s 4D5 anti-HER2 antitijela. Bojanje intenziteta i membranu imunoreaktivnost uzoraka ocijenjeni su pomoću sustava Dako bodovanja u skladu sa smjernicama ASCO /CAP [19]. Ne obojenost membrane ocijenjena je kao 0; slab ili jedva primjetan /nepotpuna obojenost membrane ocijenjena je kao 1+; nepotpune i /ili slaba /umjerena obodna obojenost membrane ocijenjena je kao 2+; i potpuno i intenzivno obodna obojenost membrane ocijenjena je kao 3+. pregled HER2- pregled DISH bojenje i vrednovanje pregled HER2 pregled -DISH je provedeno na FFPE tkiva pomoću DISH kita HER2 DNA (Roche Diagnostics), prema uputama proizvođača, kao i uzoraka su procijenjeni svjetlosnim mikroskopom. HER2 pregled, signali se pojavio kao crne točkice ili klastere, a CEP17 signali pojavio kao crvene točkice. Dvadeset ne preklapaju jezgre raka su zabio za HER2 pregled i CEP17 signali i HER2 pregled pojačanja gen koji je klasificiran kao što je preporučeno od strane smjernicama ASCO /CAP [19]; pozitivan, [ HER pregled 2 /CEP17 omjer ≥ 2,0] i /ili [Prosječna JU pregled 2 kopiranja broj ≥ 6,0 signali /ćeliju]; sumnjiv, [ HER pregled omjer <2 /CEP17; 2,0] i [Prosječna HER pregled 2 broj kopija ≥ 4.0 i < 6.0 signale /stanične]; negativan, [ HER pregled omjer <2 /CEP17; 2,0] i [Prosječna HER pregled 2 broj kopija < 4,0 signale /stanične]. Pregled Priprava DNA iz FFPE kliničkog materijala pregled izdvajanje DNA iz uzoraka biopsije, 10 serijski sekciju reza na debljini od 10 um su smješteni na staklenu površinu za HER2 -IHC i HER2 pregled -DISH. Tumor sadržaj je potvrđeno prije i poslije secira bojenjem susjedne slajdove sa HE. Budući da pojedinačni parafinsku obično sadrži više komada bioptata, pojedini uzorci su izolirane pomoću staklenog rezača. Za izdvajanje DNA iz kirurški reseciranih uzoraka 5 serijski od svakog reprezentativnog tkiva bloku izrezani su u debljini od 10 um, koje su postavljene na lim izrađen od PTFE (politetrafluoretilen, Sanplatec, Osaka, Japan). Membrana je kemijska otpornost za ksilen-based deparaffinization, te je lako izrezati na komade. U studiji, različiti dijelovi su isječak iz listova prema HER2 profil. Staklene ili PTFE komada su sastavljeni u 2.0 ml epruvete, a DNA je ekstrahiran pomoću QIAamp DNA FFPE tkiva Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA). Pregled HER2 pregled, procjenu broj kopija digitalni PCR primer, setovi za pojačanje HER2 pregled i CEP17 su prikazani u tablici 1. Svaka primer takva da PCR proizvodi dobiveni su dovoljno kratak (59 i 65 bp) kako bi se uklonili utjecaj DNA fragmentacije u procesu FFPE. Digitalni PCR je provedena korištenjem EP1 sustav s 48,770 digitalnim poljem integriranim krugom (fluidne Fluidigm). Svaki čip sadržavao je 48 ploča koje su dalje podijeljene u 770 reakcijskih komora. Broj pozitivnih fluorescentne signale u svakoj ploči je korišten za kvantificiranje različite DNA sekvence. Protokol je opisano na drugom mjestu [26]. Ukratko, 4-ul reakcijske smjese dobije se za svaki test koji je sadržavao 1 x TaqMan ekspresije gena glavne smjese, 1 × HER2-FAM i chr17cent-VIC TaqMan sondi i 1 × nanošenja uzorka reagensa (Fluidigm). Reakcijska smjesa je ravnomjerno raspoređen u reakcijskim komorama 770 i digitalno array termo-ciklički na EP1 sustava FC1 ciklički uređaj. Dva ciljna područja su neovisno pojačani i 6-karboksifluorescein, a VIC bojila signala u komorama je zabilježeno na kraju svakog PCR kruga. Broj 6-karboksifluorescein-pozitivnih (HER2) i VIC-pozitivnih (CEP17) komorama u svakoj ploči je broje i HER2 pregled /CEP17 omjer broj kopija je izračunata [27]. Pregled Procjena omjera sadržaja tumora (TCR) Cijeli slide slike Nj sekcija, koje su oni neposredno prije serijske dijelove za ekstrakciju DNK, skenirana upotrebom NanoZoomer (Hamamatsu Photonics, Hamamatsu, Japan). Podaci su uvezeni u Definiens tkiva Studio 2.0 (http://www.tissuestudio.com) za određivanje TCR. Odabrana regija kirurških uzoraka skenirana upotrebom BZ-710 mikroskopa (Keyence, Osaka, Japan). Podaci su uvezeni u Hybrid Cell računati softver (BZ-H3C, Keyence). Podaci koji detaljno broj stanica u uvezene slike i istaknutih kancerogena iz ne-kancerogen stanice se temelji na jezgri veličine su automatski generirani pregled pokusa za razvoj TC ljestvicama staničnim linijama. Pregled kontrolnim pokusima, H522 pluća i SK-BR-3 karcinoma dojke stanične linije dobivene su od American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). GM18997 Epstein-Barr virus transformira limfoblastoidne linijske stanice (LCL) dobiven je iz Coriell Biorepository (https://catalog.coriell.org/). H522 stanice i LCL uzgojene su u Roswell Park Memorial Institute-1640 mediju (Nacalai tcsquc, Kyoto, Japan) koji je sadržavao 10% fetalnog goveđeg seruma (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) i 1% otopine penicilin-streptomicina ( Nacalai Tesque). SK-BR-3 stanice su bile uzgajane u Dulbecco Modified Eagle mediju /Hams F12 (Nacalai tcsquc, Japan) s 10% fetalnog goveđeg seruma i 1% penicilina /streptomicina. Stanice se kultiviraju na 37 ° C u atmosferi koja je sadržavala 5% CO 2. DNA je ekstrahiran korištenjem QIAquick DNA mini kit (Qiagen). FFPE H522, SK-BR-3 i LCL stanica blokovi su bili pripremljeni za HER2 pregled -DISH procjena. Pregled Postupno prihranjivanje LCL. Pregled genomske DNA iz H522 i SK Br-3 stanice, a LCL se podesi na koncentraciju od 50 ng /ul. H522 i LCL genomska DNA miješati u osam koraka na sljedećim volumnim omjerima: 8: 2, 7: 3, 6: 4, 5: 5, 4: 6, 3: 7, 2: 8, i 1: 9 (H522 : LCL). SK-BR-3 i LCL genomska DNA miješati u četiri koraka na sljedećim volumnim omjerima: 8: 2, 6: 4, 4: 6, 2: 8 (SK-BR-3: LCL). Pregled Statistički analizira pregled hi-kvadrat testovi su se primjenjuje za usporedbu broji između HER2 pregled -DISH i digitalna PCR u H522 i SK-BR-3 stanicama i LCL. Razlike koje se smatraju značajnim ako p izvoznici < 0.05 pregled Rezultati Razvoj TC grafikonu podataka digitalne PCR omjer HER2 pregled /CEP17 utvrđena je na temelju tri varijable. TCR i brojevi apsolutna kopiju HER2 Netlogu i CEP17. Samo relativni omjeri posljednja dva mogu se dobiti digitalnim PCR korištenjem tumorskih uzorak bez izolacije pojedinačnih stanica. omjer HER2 pregled /CEP17 dobiti digitalni PCR [ r pregled] izražena je kao što slijedi, temelji se na pretpostavci da je gen copy broja stanica raka su homogena i da ne-kancerogene stanice su genetski stabilna s diploidnih kromosoma (slika 1A i 1B) :( 1) gdje je [ r pregled] je omjer HER2 pregled za CEP17 dobivena digitalnim PCR (0 < r U ovoj studiji, [ X pregled] određena je iz He-obojenog uzorka pomoću slika analiza softvera, kao što su tkiva Studio analiza slike softver za uzoraka biopsije i Hybrid Cell računati softver za kirurških uzoraka, odnosno; i [ r pregled] i [ X pregled] određene su iz mjerenja. pregled Jednadžba (1) je grafički prikazati kao TC grafikon, uz [ r smo definirali HER2 pregled pojačanje-negativ [ B pregled / A izvoznici < 2] ili [ B izvoznici < 2 A pregled]. [ Bx pregled + 2 (1 - X pregled)], a zatim se izraziti na sljedeći način: (2) pregled Obje strane izraza (2) su podijeljena [ Ax pregled + 2 (1 - x pregled)] :( 3) pregled Kombinacija s ekviv (1) i (3) da bi se dobio sljedeći: (4) (5) jednadžba (5) bio uvjet ekvivalentan [ B pregled / A izvoznici < 2]. Pravo član strana izraza (5) pokazala je monotonih povećanje u skladu s varijablom [ A pregled] (2 ≤ A pregled ≤ 8); Ugradnja [ A pregled = 2], što je najmanja vrijednost [ A pregled], u jed (5) dobije se sljedeće: (6) pregled Prema tome, kad god Eq (6) bio je zadovoljan, HER2 pregled pojačanje negativnih stanja [ B pregled / A izvoznici < 2] vrijedi i za bilo koju vrijednost od [ A pregled] (2 ≤ A pregled ≤ 8). Pregled S druge strane, definicija HER2 Jednadžba (7) je obrađen na isti način kao standarda kakvoće (2) - (5) i izražava se kako slijedi: (8) pregled jednadžba (8) je bio uvjet ekvivalentan [ Prema tome, kad god Eq (9) je zadovoljan, HER2 pregled pojačanje pozitivnih stanje [ B pregled / A pregled ≥ 2] vrijedi i za bilo koju vrijednost od [ A pregled] (2 ≤ a pregled ≤ 8). pregled Kada standarda kakvoće (6) i (9) su nacrtane na TC grafikona, područje iznad linije vijugavog prema gore [ r pregled = (7 x pregled + 1) /(3 x pregled + 1)] ( A pregled = 8) je označen kao pozitivnom području, a područje ispod ravne linije [ r pregled = x pregled + 1] ( a pregled = 2) bio je negativan području. Područje okruženo linije [ r pregled = X pregled + 1] i [ r pregled = (7 X pregled + 1) /(3 x pregled + 1)] je na neodređeno zona, ovisno o vrijednosti [ a pregled], koji je označen kao dvosmislen području, a definirani su kako slijedi (slika 1B) :( 10) Kada je [ x pregled] je 0 (koji ne sadrži stanice raka), sve linije konvergentne na koordinatama (0,1) temelji se na pretpostavci da je ne-kancerogene stanice su Genomski stabilna. Kad je [ X pregled] je 1.0 (koji se sastoji od samo stanice raka), linije prošao kroz koordinate (1,2), neovisno o vrijednosti za [ A Usporedba digitalne PCR i HER2 pregled -DISH u kulturi stanica pregled potvrđene smo teoretski Eq (1) i TC grafikon pomoću postupne smjese sustava staničnih linija. EQ (1) dobivena je pomoću stvarne izmjerene vrijednosti [ A Relativna kopirati brojeve HER2 Netlogu a CEP17 ( HER2 pregled /CEP17) u LCL i H522 i SK-BR-3cells su ocijenjeni od strane HER2 pregled -DISH pomoću FFPE stanica blokovi i digitalna PCR (Tablica 2). HER2 pregled, signali se pojavio u obliku diskretnih točaka u jezgri u HER2 pregled -DISH (slika 2A i 2B); HER2 pregled, broj kopija u pojedinim stanicama je gotovo dva u LCL i četiri u H522 stanica. Za razliku od toga, SK-BR-3 stanice pokazali su grupirani HER2 pregled, signali koji su bili teško razlikovati pojedinačno (Slika 2c); njihov broj je proizvoljno postavljena na maksimalnih vrijednosti za 7, 14 i 21 prema veličinama klastera. Dakle, niži omjer HER2 pregled /CEP17 dobiven je HER2 pregled -DISH nego digitalni PCR. Pregled H522 i SK-BR-3 stanice genomska DNA je pomiješana s onom LCL u postepeno i smjese su analizirane pomoću digitalnog PCR. U H522 stanica, HER2 pregled [ B pregled] i CEP17 [ A pregled] kopirati brojeve izračunate su iz HER2 pregled -DISH kako slijedi: [ a pregled = 41/20 = 2,05] i [ B pregled = 85/20 = 4,25]. Kad su vrijednosti [ A podudarnost TC karta za digitalne PCR i HER2-IHC /. - dish u kliničkim uzorcima biopsije Želučani biopsije raka primjerci (n = 44) od 32 bolesnika analizirani su digitalni PCR. HER2 pregled status svakog uzorka određena je HER2-IHC i -DISH (Slika 3A-3C). Procijenjene vrijednosti su u skladu s ručnim tačkama od strane patologa (KM). Stopa TC je određen iz slika je razlikovanje jezgre kancerogeni od onih ne-kancerogen stanice (slika 3D). pregled Digitalni PCR podaci i TCR svakog slučaja su nacrtane na TC grafikon (slika 4), uključujući podatke HER2 pregled -DISH-pozitivne (crveno), -equivocal (ljubičasta) i -negativno (plava), kao i HER2-IHC-pozitivne (rhombi), -equivocal (trokuti) i -negativno ( poprečni oznake) uzoraka. Kliničkopatološkim informacije o predstavničkim i ukupnog broja slučajeva prikazana je u Tablici 3 i S1 tablici respektivno. Nije bilo HER2 pregled -DISH-pozitivnih slučajeva ispod crte [ r pregled = X pregled + 1]; Međutim, jedna HER2 pregled -DISH-negativni ( ), dva dvosmisleni (i), a tri pozitivna (,)i,) slučajeva zabilježen je u dvosmislen području , Osim toga, tu je bila jedna HER2 pregled -DISH-negativne slučaj u pozitivnom području (!). Tri slučaja (,i*) pokazali su izrazito visoke digitalne vrijednosti PCR (28.25, 19.99 i 24.00, respektivno). U HER2 pregled -DISH, ovi slučajevi pokazali su grupirani HER2 pregled signali (Slika 3C), koji su bili teško kvantificirati, kao u SK-BR-3 stanicama. Jednadžba (1) također je izrazio na sljedeći način: (11) pregled Teoretski procjenjuje [ B pregled / A pregled] je izračunata primjenom mjeriti [ r Više slučajevi su ispitani u osam pacijenata (Slika 4 i S1 tablicu). Svi slučajevi u svakog bolesnika pokazala iste rezultate za jelo i digitalne PCR, osim za pacijente-24 (PT-24); jedan od pet slučajeva ( ) bio je pozitivan i dva ( i ) bili su negativni na oba mjerenja. Dva slučaja negativna za jelo su dodijeljeni pozitivno (!) i dvosmisleni ( ) područja u TC grafikonu (tablica 3 i S1 tablici). Pregled U ukupno 22 HER2-IHC slučajevi imali rezultat od 2+ (Tablica 4), koji obuhvaća tri pozitivna, 15 negativnu i četiri dvosmislene slučajeva na temelju TC grafikonu digitalne PCR. Pozitivni i negativni rezultati su bili potpuno saglasan sa onima HER2 pregled -DISH. Od četiri dvoznačnim slučajevima s IHC rezultatom 2+, on () bio je pozitivan, a drugi (, i)) bili negativni, kao što je određeno HER2 pregled -DISH. Procijenjena [ B pregled / A pregled] vrijednost bila u skladu s ≥ 2,0 u slučaju dai < 2.0 u drugoj tri, osim slučaja), procijenjena [ B pregled / A pregled] od kojih je 2,12. Pregled Procjena intratumoralno HER2 heterogenosti u kirurških uzoraka pregled intratumoralno HER2 heterogenost je procijenjena kombinacijom HER2-IHC /-DISH i digitalni PCR (slika 5, S1 Sl i S2 Tablica). Case_1, 2 i 4 su pokazali izrazitu intratumoralno heterogenost koja se sastoji od HER2-IHC-pozitivnih i -negativno lezija u klasteru, a Case_3 općenito pokazali dvosmisleni HER2-IHC izraz uzorak. Važno je, HER2 pozitivni lezije dostupna od lumen želuca u Case_1 (-2,-3), Case_2 (-1,-2) i Case_4 (-4). pregled Svi HER2-IHC /-DISH pozitivni slučajevi su nacrtane u pozitivnom području. Tri uzorci Case_3 (-1, -2 i -3) pokazuje HER2-IHC (dvosmislen) i HER2 pregled -DISH (pozitivni) su nacrtane na dvosmislen području. Uzorak-2 je nanesen na dvosmislen području zbog regija-2 pokrivena relativno veliki prostor koji sadrži i HER2-pozitivnim i -negativno komponente. Uzorak-2 pokazali razlike između HER2-IHC (pozitivan) i HER2 pregled -DISH (negativan) (S2 tablica), s digitalnim rezultati PCR odgovara HER2 pregled -DISH. Rasprava pregled Ovo je prva studija za pokušaj kategorizaciju od želučanog karcinoma u HER2 pregled pojačanja na negativne, -equivocal i pozitivnih slučajeva pomoću dvodimenzionalne raspršiti zemljište ili TC grafikon na temelju izmjerenih vrijednosti HER2 pregled /omjer CEP17 dobiti digitalni PCR [ r PCR metoda digitalne primijenjena je na procjenu broja kopija virusa [28], fetalni kromosomske aneuploidije [29], a onkogeni u raznim raka tkiva [30, 31]. Glavni problem koji se mora prevladati je korekcija sirovih podataka u odnosu na sadržaj tumora primjeraka; želučani tkiva raka općenito sadrže veće količine nekanceroznog stanične infiltracije, npr intersticijske ili upalne stanice. U ovom istraživanju koristili smo analizu slike kako bi se dobila polu-automatizirani procjena sadržaja tumorskih stanica i razvijaju TC tablicu za određivanje tajnosti podataka u tri kategorije-tj. Pojačan, non-pojačalom i dvoznačnim. To bi moglo biti moguće očistiti stanice raka iz sekcije FFPE tkiva mikrodisekcijom, ali ovo je previše naporno za rutinsku kliničku praksu, čak i ako je preciznija u teoriji. Koristeći ovaj pristup za uzoraka biopsije, broj HER2-IHC-dvoznačnim slučajevima (2+) smanjen je s 22 na šest, time i potrebu za potvrde HER2 pregled -DISH moglo otpasti na manje od 30% slučajeva. Učestalost HER2 pregled pojačanje varira diljem želučanog raka histoloških tipova, od 20% -30% u probavnom < 10% difuznog tipa [32]. Dakle, učinkovita metoda probira je potrebna u svakodnevnoj kliničkoj praksi, posebno u zemljama s visokom prevalencijom od raka želuca. TC grafikon može se koristiti i sa drugim PCR-based metode, kao što je kvantitativna PCR HER2 pregled pojačanje [33]. Pregled Postoje dodatne prednosti za PCR protokol digitalnog. Kao prvo, to je jednostavno u odnosu na ISH, koja zahtijeva vještinu i naporan rad, koji obuhvaća više koraka. Drugo, manje slučajeva su potrebni za vrednovanje nego su potrebne za HER2 pregled -DISH, što je isplativo. Na kraju, potrebno je samo da dizajn specifičnih klica koje se mogu primijeniti na genima, osim
); [ X pregled] je TCR (0 ≤ X pregled, ≤ 1); [ A pregled] je CEP17 broj kopija u jednoj ćeliji raka (0 ≤ A pregled); i [ B pregled] HER2 pregled, broj kopija u jednoj ćeliji raka (0 ≤ B pregled). Nakon toga, dvodimenzionalna scatterplot predstavljen jed (1) se naziva TC grafikonu. Pregled
] i [ x pregled] kao vertikalne i horizontalne osi, odnosno (Sl 1b). Omjer [ B pregled / A pregled] je referentna vrijednost za određivanje HER2 pregled pojačanje gena. Doista je stvarni broj kopija od CEP17 [ A pregled] i HER2 pregled [ B pregled] ne može utvrditi bez provođenja HER2 pregled -DISH. Međutim, praktična procjena HER2 pregled i CEP17 kopirati brojeve koje jelo otkrili da [ A pregled] u rasponu od 2,0 do 6,0 (između 40 i 117 CEP17 signala među 20 stanica raka u S1 i S2 Stolovi) i nikad nije prešla 8,0 u kliničkim uzorcima s rakom želuca. Prema našem iskustvu 164 uzastopnih slučajeva raka želuca (Ushiku T i sur
. Neobjavljeni podaci), CEP17 broj kopija je 1,0-5,7, medijan 2,5, a monosomijom definira kao [ A
< 1.5], vrlo je rijetka u samo dva slučaja (1,2%). Dakle, raspon [ A pregled] je postavljen kao [2 ≤ A pregled ≤ 8] s granice sigurnosti. Pregled
pojačanje-pozitivan je [ B pregled / A pregled ≥ 2] ili [ B pregled ≥2 A pregled]. U tom slučaju, [ Bx pregled + 2 (1 - x pregled)] izražena je kao što slijedi: (7) pregled
/a B
≥ 2]; pravo član strana jednadžbe ukazuje na monotonih porast. Ugradnja [ A pregled = 8], što je maksimalna vrijednost [ A pregled], u jed (8) dala je slijedeće: (9) pregled
] i [ B
]. pregled
] i [ B pregled] dobiven HER2 pregled -DISH u staničnim linijama, ili pomoću računa [ B 'pregled] iz [ a pregled] i izmjeri [ r pregled]. pregled
] i [ B pregled] su se primjenjivali na jed (1), podaci mogu se opisati referentne crte [ r pregled = ( 4,25 x pregled + 2 (1 - x pregled)) /(2,05 x pregled + 2 (1 - x pregled))] (Slika 2D ). U slučaju SK-BR-3 stanice, CEP17 broj kopija [ A pregled] je [ A pregled = 83/20 = 4,15]; Međutim, kao što je gore opisano, HER2 pregled signali grupirani što smanjen procijenjeni broj kopija. Dakle, primjenom [ A pregled = 4.15], [ r pregled = 5.69] i [ X pregled, = 1,0] za jed (1), procjenjuje se HER2 pregled, broj kopija [ B 'pregled] se od pretpostavke da se [ B' pregled = 5.69 × 4.15 = 23.61]. Dakle, [ A pregled = 4.15] i [ B 'pregled = 23.61] whilethe referentna linija je [ r pregled = (23.61 X pregled + 2 (1 - x pregled)) /(4,15 x pregled + 2 (1 - x pregled))] (Slika 2E). Nacrtane digitalne PCR podaci iz SK-BR-3 stanicama pomiješane s LCL suobličeni toj liniji, a ne [ r pregled = (19.50 X pregled + 2 (1 - X
)) /(4,15 x pregled + 2 (1 - x pregled))], koji se temelji na HER2 pregled -DISH podataka za koje [ B pregled = 19,50]. Ovi rezultati pokazuju valjanost TC grafikonu-tj, da ima dovoljno quantitativity digitalne PCR razlikovanja HER2-pojačan od ne-pojačan stanica pregled
] i [ x pregled] i izmjeri [ a pregled], koja se određuje iz točaka za CEP17 signala dobivenih HER2 pregled -DISH 20 stanica raka (Tablica 3 i S1 Tablica). [ B 'pregled] je također dobivena mjerenjem [ r pregled] i [ A pregled] i [ X pregled = 1], kako je opisano u SK-BR-3 stanice. pregled
] i TCR [ x pregled] bez uobičajenog HER2 pregled -DISH ili HER2-IHC informacije. Dakle, analiza TC grafikon je neovisan o CEP17 i HER2 pregled kopirati brojeve ([ A pregled] i [ B pregled]) u jednoj stanici raka, što može obično se dobiti HER2 pregled -DISH. pregled