Citation:. Matsusaka K, Ishikawa S, Накаяма A, Усику T, Нишимото A, Urabe М., и др. (2016 г.) Опухоль Content Chart-Assisted HER2 / Введение В этом исследовании мы применили микрофлюидики на основе цифровой технологии ПЦР. (BioMark; Fluidigm, Кембридж, Великобритания) [26], чтобы определить, соотношение количества копий HER2 Заявление по вопросам этики В общей сложности 44 биоптатах рака желудка из 32 пациентов, обработанных формалином рутинного фиксированной парафин (FFPE) были доступны для анализа. Все образцы биопсии были получены эндоскопически в отделении эндоскопии и эндоскопической хирургии. Четыре хирургические образцы, которые были резецированные хирургическим путем в отделении желудочно-кишечной хирургии, были также проанализированы. Эти образцы фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине. Все случаи были диагностированы в отделении патологии Университета Токио больницы. Срезы были обрезаны при толщиной 4 мкм с использованием обычных гистологических методов; они были собраны на стеклах и используется для гематоксилин-эозином (HE) окрашивания, HER2-ВВК, и Her2 Immunohistochemistry HER2- Her2 наборы праймеров для амплификации HER2 всего слайдов изображения HE секций, которые были теми, как раз перед серийных срезов для экстракции ДНК, сканировали с помощью NanoZoomer (Hamamatsu Photonics, Хамамацу, Япония). Данные были импортированы в дефиниенс ткани Studio 2.0 (http://www.tissuestudio.com) для определения TCR. Выбранная область хирургических образцов сканировали с использованием BZ-710 микроскопа (Keyence, Осака, Япония). Данные были импортированы в гибридную соту графа программного обеспечения (BZ-H3C, Keyence). Данные, которые подробно количество ячеек в импортированных изображений и выдающихся раковая из незлокачественный клеток на основе ядра размера были автоматически Эксперименты для разработки чартов TC Клеточные линии. Статистический анализ Результаты Разработка диаграммы TC для цифровых данных PCR Сравнение цифровой ПЦР и против HER2 Соответствие между ТС диаграммы для цифровой ПЦР и HER2-IHC /. - DISH в образцах биопсии клинических Обсуждение
CEP17 цифровой ПЦР анализ рака желудка биоптатов. PLoS ONE 11 (4): e0154430. DOI: 10.1371 /journal.pone.0154430
<р> Редактор: Ив Сен-Пьер, INRS, КАНАДА
<р> Поступило: 7 ноября 2015 года; Принято: 13 апреля 2016; Опубликовано: 27 апреля 2016
<р> Copyright: © 2016 г. Matsusaka и др. Это статья открытого доступа распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник приписывают наличие
<р> Data:. Все соответствующие данные находятся в пределах своих подтверждающей информации, файлов бумаги и
<р> Финансирование:. Эта работа была проведена в рамках проекта биобанке Японии (http://www.src.riken.jp/english/project/person/), что при финансовой поддержке Министерства образования, культуры, спорта, науки и технологии (http://www.mext.go.jp/english/~~HEAD=pobj), Японское агентство по медицинским исследованиям и разработкам (HTTP: //www.amed.go .jp /ан /) и грантов-в-помощь для научных исследований (KAKENHI) из Японского общества содействия развитию науки (https://www.jsps.go.jp/english/e-grants/). Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов
<р> рак желудка является одним из наиболее распространенных злокачественных опухолей и третьей ведущей причиной связанной с раком смерти во всем мире [1]. Запущенные случаи без оперативного вмешательства имеют неблагоприятный прогноз и требуют междисциплинарные подходы к лечению. HER2 представляет собой трансмембранный гликопротеин 185 кД, который является членом семейства факторов рецептора эпидермального роста и функционирует как рецептор тирозин-киназы [2, 3]. В нормальных клетках, HER2 белок действует как преобразователь сигнала во время пролиферации клеток или дифференцировки [4]; Тем не менее, он обладает онкогенными свойствами, когда избыточно экспрессируется. Это обычно вызывается Her2
амплификации гена, который, как сообщалось в нескольких типах злокачественных опухолей [5], включая рак молочной железы [6, 7], слюнной железы аденокарциномы [8], рака мочевого пузыря [9] , и рак желудка [10]. HER2-гиперэкспрессией виды рака желудка составляет 8% -31% всех случаев [11-15]. В трастузумаб для проб рака желудка, трастузумаб (Roche Diagnostics, Базель, Швейцария) -a гуманизированного анти-HER2 моноклональных антител повышенной выживаемости пациентов с HER2-положительным рака желудка при введении в комбинации с химиотерапией [16], и было Препарат также одобрен для лечения рака молочной железы [17, 18]. Оценка статуса HER2 поэтому является важным аспектом терапии рака желудка.
<Р> Для пациентов с неоперабельной рака желудка, HER2 статус должен быть рассмотрен с использованием небольшого образца биопсии. Как представлено в последних рекомендациях для тестирования HER2 при раке молочной железы Американского общества клинической онкологии (ASCO) /Колледж американских патологоанатомов (CAP), иммуногистохимии (IHC) и /или гибридизация (МОГ) являются стандартные методы оценки HER2 статус [19], но каждый из них имеет свои ограничения. Например, эффективность HER2-IHC зависит от нескольких факторов, таких как формалин процесса фиксации, и система подсчета очков не всегда воспроизводимы особенно в неоднозначных случаях, для которых рекомендуется ISH [19-25]. В светлом поле Her2
двойной зонд ISH ( Her2
-DISH), HER2
и хромосома 17 центромеры (CEP17) копировать номера могут быть обнаружены в виде сигналов под световым микроскоп по всей области образца. Тем не менее, хотя этот метод имеет высокую чувствительность, он является дорогостоящим и сравнительно много времени
/CEP17. В цифровой ПЦР, ДНК-матрица разделена на 770 частей в реакционных камерах nanoliter, с ожидаемой концентрацией 0-1 молекулы на камере. Двухцветные целевые и эталонные гены одновременно ПЦР-амплифицировали и их число копий рассчитываются путем подсчета камер с положительными сигналами. Это очень надежный метод позволил сравнение HER2
и число копий CEP17 с использованием различных наборов праймеров. Цель данного исследования состояла в том, чтобы подтвердить возможность цифровой технологии ПЦР для анализа образцов биопсии рака желудка. Тем не менее, одна из проблем этого подхода является то, что ткани, как правило, содержит нераковых стромальные клетки, которые мешают молекулярных анализов. Чтобы преодолеть эту проблему, мы разработали двумерный график рассеяния называют Опухоль Content (TC) график, который распределяет данные в амплифицируют, без усиления, и двусмысленные категории. Цель состояла в том, чтобы разработать автоматизированные средства оценки Her2
статус, с ТК график при содействии HER2
/CEP17 цифровой ПЦР анализ, выступающей в качестве первого шага.
Материалы и Методы
<р> Это исследование было одобрено Токийского университета этического комитета по Institutional. Клинические образцы с письменного информированного согласия были собраны в рамках Токийского университета институциональные рекомендации по изучению человеческих тканей.
Образцы Клинические желудка биопсии рака и хирургические образцы
-DISH.
<р> Иммуногистохимическое окрашивание проводили на FFPE ткани с использованием Ventana BenchMark XT (Roche Diagnostics) с антителом 4D5 анти-HER2. Окрашивание модели интенсивности и мембраны иммунореактивность оценивали с использованием балльной системы Dako в соответствии с директивами ASCO /CAP [19]. Ни одна мембрана окрашивание не был забит как 0; слабый или едва заметный /неполное окрашивание мембраны оценивали как 1+; неполной и /или слабая /умеренная окружная мембраны окрашивание оценивали как 2+; и полностью и интенсивно окружная мембраны окрашивание оценивали как 3+.
DISH окрашивание и оценка
-DISH проводили на FFPE ткани с использованием DISH набора HER2 ДНК (Roche Diagnostics) в соответствии с инструкциями изготовителя, и образцы оценивали с помощью световой микроскопии. Her2
сигналы появились в виде черных точек или кластеров, а также CEP17 сигналы появились красные точки. Двадцать Неперекрывающиеся ядер рака оценивали по HER2
и сигналы CEP17 и Her2
амплификации гена был классифицирован в соответствии с рекомендациями руководящих принципов ASCO /CAP [19]; положительный, [ HER
2 /CEP17 соотношение ≥ 2,0] и /или [средний HER
2 число копий ≥ 6.0 сигналов /ячейку]; сомнительны, [ HER
2 /CEP17 отношение &л; 2.0] и [средний HER
2 число копий ≥ 4,0 и &л; 6.0 Сигналы /сотовые]; отрицательное, [ HER
2 /CEP17 отношение &л; 2.0] и [средний HER 2
количество копий &л; 4.0 Сигналы /сотовые].
Получение ДНК из клинического материала FFPE
<р> Для извлечения ДНК из образцов биопсии, 10 последовательных секций вырезанные при толщине 10 мкм, помещали на стеклянную поверхность для HER2 -IHC и Her2
-DISH. Содержание опухоли было подтверждено до и после перерезки путем окрашивания смежных слайдов с HE. Так как один блок парафина обычно содержит несколько частей образца биопсии, отдельные образцы были изолированы с помощью стеклорез. Для извлечения ДНК из хирургических образцов резецированных, 5 последовательных секций из каждого репрезентативного папиросной блока были вырезаны при толщине 10 мкм, которые были размещены на листе, изготовленного из политетрафторэтилена (ПТФЭ, Sanplatec, Осака, Япония). Мембрана является химическая стойкость к ксилолов на основе депарафинизации, и легко разрезать на куски. В исследовании, различные части были клип из листов в соответствии с профилем HER2. Стеклянные или PTFE части были собраны в 2,0-мл пробирку и ДНК экстрагировали с помощью ткани Kit QIAamp ДНК FFPE (Qiagen, Valencia, CA, USA).
Her2
оценка числа копий с помощью цифровых ПЦР
и CEP17 приведены в таблице 1. Каждый праймер был разработан таким образом, что ПЦР-продукты, полученные были достаточно короткими (59 и 65 пар оснований) с целью устранения влияние фрагментации ДНК в процессе FFPE. Цифровая ПЦР проводили с использованием системы EP1 с 48,770 Цифровой массив интегрированной жидкостный контур (Fluidigm). Каждый чип содержал 48 панелей, которые были дополнительно разбиты на разделы в 770 реакционных камер. Число положительных флуоресцентных сигналов в каждой панели использовали для количественной оценки различных последовательностей ДНК. Протокол был описан в другом месте [26]. Вкратце, 4-мкл реакционные смеси были приготовлены для каждого анализа, который содержал 1 × TaqMan экспрессии гена основной смеси, 1 × HER2-FAM и chr17cent-ВИК TaqMan зондов, и 1 × загрузки образца реагента (Fluidigm). Реакционную смесь равномерно распределяется в реакционные камеры 770 и цифровой массив был термо-циклическое на циклера EP1 системы FC1. Две целевые области были независимо друг от друга усиливается и 6-карбоксифлуоресцеина и ВИК красителях сигналы в камерах были записаны в конце каждого цикла ПЦР. Число 6-карбоксифлуоресцеин-позитивных (HER2) и VIC-положительных (CEP17) камер в каждой панели подсчитывали и соотношение количества копий HER2
/CEP17 был рассчитан [27].
Оценка соотношения содержания опухоли (TCR)
<р> Для контрольных экспериментов, рака легкого H522 и SK-BR-3 линий клеток рака молочной железы были получены из американской коллекции типовых культур (Manassas, VA, USA). GM18997 вирус Эпштейна-Барр-трансформированных лимфобластоидная клеточную линию (LCL) была получена из Coriell Biorepository (https://catalog.coriell.org/). H522 клетки и LCL культивировали в Roswell Park Memorial институт-1640 (Nacalai Tesque, Киото, Япония), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, штат Миссури, США) и 1% пенициллина-стрептомицина раствора ( Nacalai Tesque). Клетки SK-BR-3 культивировали в модифицированной среде Игла /Хэма F12 Дульбекко (Nacalai Tesque, Япония) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 1% пенициллина /стрептомицина. Клетки культивировали при 37 ° С в атмосфере, содержащей 5% CO <суб> 2. ДНК экстрагировали с использованием QIAquick ДНК мини-набора (Qiagen). FFPE H522, SK-BR-3 и LCL клеточные блоки были подготовлены для Her2
-DISH оценки.
Поэтапное смешивание с LCL.
<Р> геномных ДНК из H522 и SK -BR-3 клетки и LCL доводили до концентрации 50 нг /мкл. H522 и LCL геномную ДНК смешивали в восемь этапов в следующих объемных соотношениях: 8: 2, 7: 3, 6: 4, 5: 5, 4: 6, 3: 7, 2: 8 и 1: 9 (H522 : LCL). SK-BR-3 и LCL геномную ДНК смешивали в четыре этапа в следующих объемных соотношениях: 8: 2, 6: 4, 4: 6 и 2: 8 (SK-BR-3: LCL).
<р> хи-квадрат тесты применялись для сравнения между отсчеты Her2
-DISH и цифровой ПЦР в H522 и SK-BR-3 клеток и LCL. Различия считались значимыми, если р
&л; 0.05
<р> соотношение HER2
/CEP17 была определена на основе трех переменных:. TCR и номера абсолютная копия HER2
и CEP17. Показаны только относительные соотношения двух последних могут быть получены с помощью цифровой ПЦР с использованием образца опухоли, без выделения отдельных клеток. <ЕМ> отношение к HER2
/CEP17 полученный цифровой ПЦР [<ЕМ> R
] была выражена следующим образом, исходя из предположения, что количество копий гена раковых клеток однородны и что незлокачественных клеток генетически стабильная с диплоидных хромосом (рис 1А и 1В) :( 1) где [<ЕМ> R
] является отношение <ЕМ> HER2
к CEP17 полученный цифровой ПЦР (0 &ЛТ; <ЕМ> г
); [ х
] является TCR (0 ≤ х
≤ 1); [ а
] является CEP17 число копий в одной клетке рака (0 ≤ а
); и [ B
] является Her2
количество копий в одной клетке рака (0 ≤ B
). Далее, двумерная диаграмма рассеяния, представленное формулой (1) называется ТС графике.
<Р> В настоящем исследовании, [ х
] была определена из HE-окрашенных образцов с использованием изображения программное обеспечение для анализа, таких как ткани студии анализа изображений программное обеспечение для биопсии и программного обеспечения Hybrid Cell Count для хирургических образцов, соответственно; и [ г
] и [ х
] определялись из измерений.
<р> Уравнение (1) была представлена графически в виде диаграммы ТС, с [ г
] и [<ЕМ> х
] в качестве вертикальной и горизонтальной осей, соответственно (фиг.1В). Отношение [ B
/ а
] было опорное значение для определения Her2
амплификации гена. В самом деле фактическая копия количество CEP17 [ а
] и HER2
[ B
] не может быть определена без выполнения Her2
-DISH. Тем не менее, практическая оценка HER2
и CEP17 число копий по DISH установлено, что [ а
] колебалась от 2,0 до 6,0 (от 40 до 117 CEP17 сигналов среди 20 раковых клеток в S1 и S2 Таблицы) и никогда не превышала 8,0 в клинических образцах рака желудка. По нашему опыту 164 последовательных случаев рака желудка (Усику T и др.
Неопубликованные данные), CEP17 число копий составляет 1.0-5.7, медиана 2,5 и моносомии, определяется как [ А <бр> &л; 1.5], довольно редко только в двух случаях (1,2%). Таким образом, диапазон [ а
] было установлено как [2 ≤ A
≤ 8] с запасом прочности.
<Р> Мы определили HER2
усиление-отрицательным, как [ B
/ а
&л; 2] или [ B &
л; 2 а
]. [ Bx
+ 2 (1 - х
)] затем выражается следующим образом: (2)
<р> обе части уравнения (2) были разделены на [ Ax
+ 2 (1 - х
)] :( 3)
<р> Объединение с формулами (1) и (3) дает следующее: (4) (5)
<р> уравнение (5) является условием эквивалентно [ B
/ а
&л; 2]. Правая сторона член уравнения (5) показал монотонное возрастание в соответствии с переменной [ а
] (2 ≤ а
≤ 8); включение [ а
= 2], что было минимальное значение [ а
], в уравнение (5) дает следующее: (6)
<р> Таким образом, всякий раз, когда уравнение (6) было выполнено, Her2
усиление отрицательным условием [ B
/ а
&л; 2] было верно для любого значения [ а
] (2 ≤ а
≤ 8).
<Р> С другой стороны, определение HER2
усиление положительным было [ B
/ а
≥ 2] или [ B
≥2 а
]. В этом случае, [<ЕМ> Bx
+ 2 (1 - х
)] была выражена следующим образом: (7)
<р> Уравнение (7), обрабатывали таким же образом, в уравнения (2) - (5) и выражается следующим образом: (8)
<р> уравнение (8) является условием эквивалентно [ B /
A ≥
2]; правая часть уравнения указывают на монотонное возрастание. Включение [ а
= 8], что стало максимальным значением [ а
], в уравнение (8) дает следующее: (9)
<р> Таким образом, всякий раз, когда уравнение (9) была удовлетворена, Her2
усиление положительным условием [ B
/ а
≥ 2] было верно для любого значения [ A
] (2 ≤ а
≤ 8).
<р> Когда уравнения (6) и (9) были нанесены на график ТС, область над линией изгибаясь вверх [ г
= (7 х
+ 1) /(3 х
+ 1)] ( а
= 8) была обозначена как положительной области, и область ниже прямой [ г
= х
+ 1] ( а
= 2) была отрицательной области. Площадь, заключенная между линиями [ г
= х
+ 1] и [ г
= (7 х
+ 1) /(3 х
+ 1)] была неопределенной зоны в зависимости от значения [
], которая была обозначена как двусмысленной области и определяется следующим образом (рис 1В) :( 10)
<р> Когда [<ЕМ> х
] 0 (не содержащая раковых клеток), все линии сходились в точке с координатами (0,1), исходя из предположения, что не-раковые клетки genomically стабильны. Когда [ х
] был 1,0 (состоящий только из раковых клеток), линии проходили через координаты (1,2) независимо от значений для [ а
] и [ B
].
-DISH в культивируемых клетках
<р> Мы подтверждена теоретическая формула (1) и ТС график ступенчатым системы смеси клеточных линий. Уравнение (1) было получено с использованием фактических измеренных значений [ а
] и [ B
] получено Her2
-DISH в клеточных линиях, или используя вычисленный [ B '
] из [ а
] и измерили [ г
].
<р> числа Относительный переплете HER2
и CEP17 ( HER2
/CEP17) в LCL и H522 и SK-BR-3cells оценивали Her2
-DISH с использованием блоков FFPE клеток и цифровой ПЦР (таблица 2). Her2
сигналы появились в виде дискретных точек в ядрах с помощью Her2
-DISH (рис 2А и 2В); Her2
количество копий в отдельных ячейках было почти два в LCL и четыре в H522 клеток. В отличие от этого, SK-BR-3 клетки обнаруживают кластер против HER2
сигналы, которые было трудно различить по отдельности (рис 2с); их число произвольно установить до максимальных значений 7, 14, и 21 в соответствии с размерами кластеров. Таким образом, более низкая <ЕМ> отношение к HER2
/CEP17 был получен <ЕМ> против HER2
-DISH, чем цифровой ПЦР.
<Р> H522 и SK-BR-3 клеток геномной ДНК смешивали с что из LCL ступенчато и смеси анализировали с помощью цифровой ПЦР. В H522 клеток, Her2
[ B
] и CEP17 [ а
] число копий были вычислены из Her2
-DISH следующим образом: [ а
= 41/20 = 2,05] и [ B
= 85/20 = 4,25]. Когда значения [ а
] и [ B
] были применены к уравнению (1), данные могут быть описаны с помощью опорной линии [ г
= ( 4,25 х
+ 2 (1 - х
)) /(2,05 х
+ 2 (1 - х
))] (рис 2D ). В случае-BR-3 SK клеток, CEP17 число копий [ а
] был [ а
= 83/20 = 4,15]; Тем не менее, как описано выше, против HER2
сигналы были сгруппированы, что уменьшало оценочное количество копий. Поэтому, применяя [ а
= 4,15], [ г
= 5,69] и [ х
= 1,0] для уравнения (1), по оценкам, Her2
количество копий [ B '
] предполагалось, что [ B'
= 5,69 × 4,15 = 23,61]. Следовательно, [ а
= 4,15] и [ B '
= 23,61] whilethe опорная линия была [ г
= (23,61 х
+ 2 (1 - х
)) /(4,15 х
+ 2 (1 - х
))] (рис 2E). Plotted цифровые данные ПЦР-BR-3 SK клеток, смешанных с LCL соответствовала этой линии, а не [ г
= (19,50 х
+ 2 (1 - х <бр>)) /(4,15 х
+ 2 (1 - х
))], которая была основана на Her2
-DISH данных, для которых [ B
= 19,50]. Эти результаты демонстрируют обоснованность ТС диаграммы, то есть, что он обладает достаточной quantitativity цифровой ПЦР отличать HER2-амплифицирован из неамплифицированный клеток
<р> образцы биопсии рака желудка (n = 44) из 32 пациентов были проанализированы с помощью цифровой ПЦР. <ЕМ> против HER2
статус каждого образца определяли HER2-IHC и -DISH (фиг 3А-3С). Расчетные значения согласуются с ручными подсчетов, сделанных патологоанатомом (КМ). Скорость TC определяли из изображений, различая ядра раковой от незлокачественных клеток (рис 3D).
<р> цифровые данные ПЦР и TCR каждого случая были нанесены на ТС графике (рис 4), в том числе данные для Her2
-DISH-положительный (красный), -equivocal (фиолетовый) и -отрицательное (синий), а также HER2-IHC-положительных (ромбы), -equivocal (треугольники), и -отрицательное ( перекрестные метки) образцов. Клинико-патологическими информацию о репрезентативных и общего количества случаев показано в таблице 3 и таблице S1 соответственно. Там не было Her2
-DISH-положительных случаев ниже линии [ г
= х
+ 1]; Тем не менее, один элемент Her2
-DISH-отрицательные ( ), два сомнительными (№ 8 и № 15), а также три положительных (,)и,) случаи наблюдались в сомнительном районе , Кроме того, там был один Her2
-DISH-негативный случай в положительной области (!). Три случая (,и*) показали заметно высокие цифровые значения PCR (28,25, 19,99 и 24.00 соответственно). В Her2
-DISH, эти случаи показали кластерный Her2
сигналы (рис 3C), которые трудно определить количественно, как и в клетках SK-BR-3. Было также выражено уравнение (1) следующим образом: (11)
<р> Теоретически по оценкам [ B
/ а
] была рассчитывается путем применения измеренных [ г
] и [ х
] и измерили [ а
], который был определен из отсчетов сигналов CEP17, полученных с помощью функции Her2
-DISH в 20 раковых клеток (табл 3 и S1 Таблица). [ B '
] была также получена путем измерения [ г
] и [ а
] и [ х
= 1], как описано для SK-BR-3 клетки.
<р> Несколько случаев были оценены для восьми пациентов (фиг.4 и S1, таблица). Во всех случаях у каждого пациента показали те же результаты для DISH и цифровой ПЦР для пациентов-24 (Pt-24), за исключением; один из пяти случаев ( ) был положительным и два ( и ) были отрицательными для обоих измерений. Два случая негативных для DISH были выделены положительные (!) и неоднозначны ( ) областях в ТС графике (таблица 3 и S1 таблицы).
<Р> В общей сложности 22 случая HER2-IHC имели балл 2+ (Таблица 4), включающий три положительных, 15 негативных и четыре неоднозначные дела, основанные на графике TC цифровой ПЦР. Положительные и отрицательные результаты были полностью согласные с таковыми Her2
-DISH. Из четырех неоднозначных случаев с IHC счетом 2+, один () был положительным, а остальные (, и)) были отрицательными, как определено Her2
-DISH. По оценкам [ B
/ а
] значение было соответственно ≥ 2,0 в случаеи &л; 2,0 в последних трех, по делу № 41, за исключением, по оценкам [ B
/ а
] из которых был 2.12.
Оценка внутриопухолевой HER2 гетерогенности в хирургических образцах
<р> внутриопухолевой HER2 гетерогенность оценивали с помощью комбинации HER2-IHC /-DISH и цифровой ПЦР (рис 5, S1 и S2 рис Таблица). Case_1, 2, и 4 показали отличную внутриопухолевой гетерогенность, состоящий из HER2-ВВК-положительных и -отрицательное поражений в кластере, в то время как Case_3 в целом показал неоднозначную характер экспрессии HER2-IHC. Важно отметить, что HER2-положительного повреждения были доступны из просвета желудка в Case_1 (-2,-3), Case_2 (-1,-2), и Case_4 (-4).
<р> Все HER2-IHC /-DISH-положительных случаев были построены в положительной зоне. Три образца Case_3 (-1, -2 и -3), показывающие HER2-IHC (неоднозначного) и Her2
-DISH (положительный) были построены в сомнительном районе. Образец-2 наносили на график в неоднозначного области, так как область-2 охватывает относительно большую площадь, содержащую и HER2-положительным и -отрицательное компонентов. Пример-2 показали расхождения между HER2-IHC (положительный) и Her2
-DISH (отрицательный) (S2 Table), причем цифровые результаты ПЦР, соответствующий Her2
-DISH.
<р> это исследование является первым, чтобы попытаться категоризацию рака желудка в Her2
амплификации-отрицательных, -equivocal и -положительным случаи с использованием двумерного разброса участок или ТС график, на основе измеренных значений
/соотношение CEP17 HER2, полученный цифровой ПЦР [ г
] и TCR [ х
] без обычного HER2
-DISH или информацию HER2-IHC. Таким образом, анализ по ТК график не зависит от CEP17 и HER2
копировать номера ([ а
] и [ B
]) в одной клетке рака, который может как правило, получают Her2
-DISH.
<р> цифровой метод ПЦР был применен к оценке числа копий вируса [28], плода хромосомной анеуплоидии [29], и онкогенов в различных раковые ткани [30, 31]. Одна из основных проблем, которые необходимо преодолеть, это исправление необработанных данных в соответствии с содержанием опухоли образцов; желудочные раковые ткани обычно содержат большие количества нераковая клеточной инфильтрации, например, интерстициальные или воспалительные клетки. В настоящем исследовании мы использовали анализ изображения для получения полуавтоматического оценки содержания опухолевых клеток и разработал схему ТС для классификации данных по трем категориям-i.e., Усиленный, не усиленных и неоднозначные. Это может быть возможным, чтобы очистить раковые клетки из секций FFPE ткани микродиссекции, но это слишком трудоемким для рутинной клинической практике, даже если оно является более точным в теории. Используя этот подход для биопсии, количество HER2-IHC-неоднозначных случаев (2+) была снижена с 22 до шести, тем самым необходимость подтверждения Her2
-DISH может быть устранено до менее чем 30% случаев. Частота Her2
амплификации варьируется в зависимости от рака желудка гистологических типов, от 20% -30% в кишечном к &лт; 10% в диффузного типа [32]. Таким образом, эффективный метод скрининга необходим в повседневной клинической практике, особенно в странах с высокой распространенностью рака желудка. TC график может также использоваться с другими ПЦР на основе метода, такие как количественной ПЦР для Her2
усиления [33].
<Р> Есть дополнительные преимущества цифрового протокола ПЦР. Во-первых, это просто по отношению к ISH, которая требует навыков и трудоемкий, включающий несколько этапов. Во-вторых, меньше случаев требуются для проверки, чем необходимы для Her2
-DISH, что делает его экономически эффективным. И, наконец, необходимо только разработать специфические праймеры, которые могут быть применены к другим, чем генов HER2
, что делает его более универсальным, чем метод ISH или IHC.
<Р> Одна из основных проблем с текущей HER2- IHC и -ish протоколов является тот факт, что HER2-IHC 0/1 + случаи могут показывать положительные сигналы с помощью Her2
-ish [19]. Это явление не наблюдалось в настоящем исследовании, но два HER2-IHC 1+ образцов (№ 14 и № 15) имели значения 1,98 и 1,89 от Her2
-DISH. Среднее количество HER2 копия в обоих образцах были 4,15 и 5,05 с помощью Her2 одностоечные анализа зонд, соответственно (S1 таблицу). Обновление ASCO /CAP директива для рака молочной железы были приняты критерии сомнительны для Her2
усиление, то есть [ HER
2 /CEP17 отношение &л; 2,0] и абсолютное значение [средний HER
2 числа копий ≥ 4,0 и &л; 6.0 Сигналы /сотовые] по Her2
-DISH [19]. Если это применяется к обоих случаях (№ 14 и № 15), они были HER2
-DISH-сомнительны. Кроме того, был один случай ()), показывающий отрицательное HER2
/соотношение CEP17 и положительный результат в среднем Her2
сигналы в раковых клетках (таблица 3). Дальнейшие исследования необходимы при раке желудка, чтобы доказать, является ли достаточным или нет единого зондового анализа.
<Р> Aneusomy хромосомы 17 (моносомии и полисомию) могут повлиять на Her2
измерения усиления классом HER2
/соотношение CEP17, хотя его клиническое значение неизвестно, в отсутствие гиперэкспрессией HER2 на ВВК [19]. В данном исследовании, не было ни одного случая, показывающий среднее число CEP17 копию [ A
] меньше, чем 2,0 (S1 и S2 таблицы). Полисомию может быть более распространенным при раке желудка, но среднее число CEP17 копия [ а
] не превышала 6,0. Поскольку смещение выбора не влияет на хромосомные регионы без онкогенов, CEP17 число копий может быть относительно стабильным и легко подсчитать. Jacquemier и др
. сообщил также соответствие между FISH и количественной ПЦР в реальном времени (КПЦР) в качестве альтернативных методов в большой серии больных раком молочной железы [33]. Они указали на то, что надежность кПЦР была увеличена путем получения нескольких наборов праймеров для хромосомных областей. Таким образом, можно принять другой набор праймеров для CEP17 для определения средних значений [<ЕМ> а
] цифровой ПЦР.
<Р> Гистологическое гетерогенность опухолей является одной из основных проблем, связанных с HER2
измерения усиления, особенно при раке желудка. Это было показано в настоящем исследовании пациентов-24 (случаи -!) экспертизы биопсии. Амплификация была продемонстрирована блюдом только один из пяти образцов, которые показали кишечного типа гистологии. С другой стороны, ТС-диаграмма помощь цифровой ПЦР-анализ классифицирован два образца, как усиленный, один как сомнительны, и только два, как отрицательные. Таким образом, этот способ может быть в состоянии уменьшить число образцов, необходимых для проведения измерений.
Потеря микробиома в результате использования антибиотиков влияет на реакцию на вакцину против гриппа
Женщины, рожденные с помощью кесарева сечения, имеют больший риск ожирения и диабета.
Микробиом кишечника также присутствует в жизни плода.
Заболевание раздраженного кишечника увеличивает риск деменции
Новая модель трансплантации микробиома влагалища
Хорошие новости для людей, страдающих СРК, поскольку исследователи определяют «кишечный зуд».
Многопрофильный подход к разработке лекарств против COVID-19
Новое исследование опубликовано на сервере препринтов medRxiv * в мае 2020 года сообщает о многопрофильном подходе, который может упростить разработку лекарств, эффективных против COVID-19. Мульти-о
Пищевые реакции регулируются микробиомом кишечника,
находит новое исследование Исследование, опубликованное на этой неделе, показывает, что взаимодействие бактерий в нашем кишечнике (микробиом кишечника) с пищей, которую мы едим, заметно различается ме
Недавно обнаруженные крупные фаги стирают границу между жизнью и неживой
Новое исследование, опубликованное в журнале Природа показывает, что существуют буквально сотни вирусов, достаточно больших, чтобы поглощать бактерии, и со свойствами, которые типичны для живого орг